Przeprogramowanie indukowanych pluripotentnych linii komórek macierzystych z próbek zamrożonego płaszcza Buffy

Celem tego protokołu jest przeprogramowanie ludzkich zamrożonych powłok buffy coat, czyli PBMC, na indukowane pluripotentne komórki macierzyste. Ten protokół unikalnie oczyszcza białą sierść po rozmrożeniu i identyfikuje somatyczną morfologię komórek, która świadczy o sukcesie przeprogramowania. Na początek wyciągnij zamrożony płaszcz buffy pochodzący z ludzkiej krwi i połóż go na lodzie.

Delikatnie mieszaj próbkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wyjmij fiolkę, gdy pozostanie tylko mały kryształ lodu. Ostrożnie przelej zawartość fiolki kroplami do stożkowej probówki zawierającej 12 mililitrów DPBS. Przepłucz fiolkę jednym mililitrem DPBS i dodaj płukanie do stożkowej rurki zawierającej pobrane komórki.

Wiruj próbkę za pomocą wirnika z łyżką obrotową w temperaturze 200 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij osad komórkowy w czterech mililitrach DPBS zawierającego 1% FBS. Następnie delikatnie nałóż warstwy mieszanki Buffy coat na trzy mililitry roztworu gradientu gęstości, unikając mieszania na styku.

Wirówka z wirnikem obrotowym o mocy 800 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Za pomocą pipety usuwa się i usuwa górną warstwę plazmy, nie naruszając granicy plazmy z gradientem. Następnie usuwa obwodową komórkę monojądrową krwi, czyli warstwę PBMC, na granicy i przenosi ją do czystej rurki 15-mililitrowej.

Przemyj PBMC, dodając trzy mililitry medium rozprężnego i wirując w temperaturze 200 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij granulkę w dwóch mililitrach medium ekspansyjnego zawierającego cytokiny, takie jak SCF, IL-3, EPO i IGF-1. Komórki pokryj w 1 dołku z 12-dołkowej płytki.

Hodować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla i 20% tlenu przez 10 do 14 dni. Wymieniaj połowę podłoża co drugi dzień, aż zaobserwujemy gęstą populację jasnych, okrągłych erytroblastów, co wskazuje, że komórki są gotowe do transdukcji. Trzy dni po transdukcji wirusem Sendai zawierającym czynniki Yamanaka należy nakładać komórki na mysie embrionalne fibroblasty z częstotliwością dwóch mililitrów na dołek.

Inkubuj hodowle przez około siedem dni, karmiąc wschodzące kolonie podłożem hESC co drugi dzień. Umieść płytkę zawierającą przetworzone komórki i wyklęte kolonie pod mikroskopem rozcinającym. Użyj mikroskopu, aby zlokalizować jedną kolonię, podnieść i podnieść pokrywkę płytki, aby odsłonić dołek.

Aseptycznie otwórz strzykawkę i odsłonić igłę. Pod kierunkiem mikroskopu użyj końcówki igły do odłączenia kolonii od otaczających komórek zażywczych poprzez śledzenie jej konturu. Użyj końcówki igły, aby pokroić kolonię na kilka kawałków o równych rozmiarach.

Jeśli kawałki się nie odłączyły, użyj boku igły, aby nabierać lub zeskrobać je z talerza, aż zaczną unosić się na powierzchni. Teraz, używając pipety P200, zlokalizuj pobraną kolonię pod mikroskopem, aspiruj unoszącą się kolonię pipetą i przenieś ją do dołka przygotowanej płyty z 24 dołkami. Upewnij się, że cała kolonia zostanie przeniesiona bez zbierania innych kolonii lub komórek zażywających.

Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla i 20% tlenu, aż osiągnie pożądane połączenie węgla. Zidentyfikuj kolonie duże, okrągłe i wykazujące świecące krawędzie, gotowe do rozdzielenia. Aspiruj medium z dołka i raz przepłukaj próbkę jednym mililitrem DPBS.

Następnie usuń DPBS i dodaj 500 mikrolitrów buforu dysocjacyjnego EDTA o wartości 0,5 milimolarnej. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez dwie minuty, aż kolonie się poluzują, a komórki się zaokrąglią. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora i zasysaj bufor dysocjacyjny EDTA.

Za pomocą pipety P1000 zbieraj komórki za pomocą jednego mililitra ludzkiego nośnika pluripotentnego z komórek macierzystych, delikatnie pipetując w górę i w dół, aż kolonie zostaną odłączone i lekko rozbite. Przełóż jeden mililitr pożywki i komórek do nowej płytki z sześcioma dołkami zawierającą jeden mililitr świeżego, ludzkiego pluripotentnego medium komórek macierzystych. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla i 20% tlenu.

Codziennie karmić indukowane pluripotentne komórki macierzyste, aż studnia się zbije i będzie gotowa do rozszczepienia. Tymczasem oblecz naczynie o średnicy 10 centymetrów 7 mililitrów po 5 mikrogramów na mililitr roztworu witronektyny przygotowanego w DPBS i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę. Aby kontynuować rozszczepienie, dodaj 7 do 10 mililitrów ludzkiego medium pluripotentnych komórek macierzystych do naczynia o średnicy 10 centymetrów, przenieś komórki z płytki sześciodołkowej na miskę w proporcji 1:1 i inkubuj tak, jak pokazano wcześniej.

Potwierdź, że komórki w naczyniu o średnicy 10 centymetrów są zbiegane, zanim ponownie je rozdzielisz. Dostosuj stosunek podziału na podstawie morfologii i gęstości komórek, zazwyczaj stosując stosunek 1:10, i zapisz numer przejścia przy każdym fragmencie. Na koniec scharakteryzować indukowane pluripotentne komórki macierzyste poprzez potwierdzenie ekspresji markera macierzystego NANOG za pomocą immunofluorescencji.

Różnicowanie komórek na linie ektodermy, mezodermy i endodermy przy użyciu określonych warunków hodowlacyjnych. Ocena potencjału różnicowania poprzez barwienie na PAX6, Brachyury i SOX17, wraz z utratą ekspresji NANOG. Pod koniec ekspansji PBMC różnicowały się w erytroblasty, które pojawiały się jako jasne, okrągłe komórki dużych i małych rozmiarów.

Natomiast hodowle pozbawione tych komórek lub wyglądające na martwe raczej nie uda się skutecznie przeprogramować. Udana transdukcja i przeprogramowanie charakteryzowały się pojawieniem indukowanych pluripotentnych kolonii komórek macierzystych na napromieniowanych komórkach zasilających, które następnie rozwinęły typową morfologię komórek macierzystych. Natomiast komórki, które nie przyjęły morfologii podobnej do komórek macierzystych, nie zostały skutecznie przeprogramowane.

Skutecznie przeprogramowane indukowane pluripotentne komórki macierzyste wykazywały gęste, okrągłe kolonie o gładkich, jasnych krawędziach. Subklony o mniej idealnej morfologii, takiej jak spontaniczne zróżnicowanie czy gęste centrum, były czyszczone przez dostosowanie warunków rozszczepienia. Niektóre wybrane kolonie nie zdołały się skutecznie rozszerzać.

Oprócz morfologii, indukowane pluripotentne komórki macierzyste wykazywały stemowość, co potwierdza ekspresja markera stemnessu NANOG. Przeprogramowane indukowane pluripotentne komórki macierzyste wykazały potencjał różnicowania w ektodermę, mezodermę i endodermę. Protokół ten zapewnia szczegółowe punkty kontrolne do śledzenia i przewidywania sukcesu przeprogramowania.

Aby dodatkowo potwierdzić, że linia iPSC nadaje się do użycia, należy przeprowadzić kariotypowanie, genotypowanie oraz regularne testy mykoplazmy. Protokół ten umożliwia przeprogramowanie istniejących pacjentów z biobankowymi futrami buffy, poszerzając użyteczność technologii iPSC.