Wykorzystanie roztworu NMR do charakteryzacji kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych
17 kwietnia 2026
Przedstawiamy protokoły dla metodologii NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) oraz CONdensate DEtectioN za pomocą SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), które umożliwiają bezoznakową, ilościową charakterystykę kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych, ujawniając podział molekularny, dynamikę wymiany, hydratację kondensatu oraz strukturę kropli bez osadu czy oznakowania.
Opracowaliśmy metody NMR do badania kondensatów biomolekularnych. Są one kluczowe dla organizacji komórek, ale ich ciągłe informacje są zawarte w wielu zaburzeniach. Korzystając z naszych metod, badamy właściwości materiałów kondensatowych, analizujemy mechanizmy ich powstawania oraz monitorujemy długoterminowe zmiany, takie jak dojrzewanie kondensatu czy patologiczne migotanie biomolekuł.
Na początek przygotuj ostateczną próbkę bifazową stabilizowaną przez hydrogel agarozowy, mieszając zapasy białka, zapasy RNA lub oba z odpowiednim ciepłym buforem agarozowym w mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra. Końcowe stężenie białka, czyli RNA, to zazwyczaj 50 do 500 mikromolarów do wykrywania NMR. Włóż przygotowaną próbkę bifazową do spektrometru, następnie zablokuj, podkład, dopasuj i dostroj kanał protonowy jak zwykle.
Skalibruj długość impulsu 90 stopni na kanale protonowym według ogólnej procedury kalibracji. Następnie zapisz jednowymiarowe widmo z tłumieniem wody i sprawdź, czy widmo zawiera silne sygnały biomolekularne. Jeśli sygnał nie jest zaobserwowany lub jest bardzo słaby, nie kontynuuj z REDIFINE, lecz użyj CONDENSE-MT.
Nagraj eksperyment spektroskopii zleconej dyfuzją, aby uporządkować siłę gradientu dyfuzji od 2 do 95% w 16 liniowych krokach. Aby kontynuować pozyskiwanie danych dla pełnego zestawu REDIFINE, stwórz dziewięć nowych eksperymentów PPP GPQ S19, kopiując parametry z właśnie przeprowadzonego eksperymentu. W każdym kolejnym eksperymencie zmieniaj tylko opóźnienie dyfuzji D20 w zmiennych krokach, aby obejmować zakres od 100 do 1000 milisekund.
Wykonaj każdy z tych eksperymentów odpowiednim poleceniem. Ostatnie N wykorzystaj, aby zachować wzmocnienie odbiornika przez 10 eksperymentów. Ustaw znak Q z SSB2 jako funkcją okna.
Następnie wyciągnij piąty kawałek za pomocą odpowiedniego polecenia. Fazuj jednowymiarowe widmo i zapisz parametry fazowania do dwuwymiarowego zbioru danych. Przetworz dwuwymiarowy zbiór danych za pomocą XF2 i wykonaj korektę bazową za pomocą ABS2.
Następnie wyodrębnij 16 plasterków za pomocą split 2D. Powtórz podobną procedurę dla pozostałych dziewięciu eksperymentów. Sprawdź co najmniej pierwsze cztery do pięciu plasterków, aby upewnić się, że fazowanie i korekcja bazowa jest prawidłowa.
Jeśli trzeba, popraw fazowanie i linię bazową ręcznie. Następnie użyj odpowiedniego kodu MATLAB do analizy. W kodzie modyfikuj czasy dyfuzji, ustaw wartości PG zgodnie z siłą gradientu sondy i przypisz eksperymenty od jeden do dziesięciu na podstawie łącznej liczby eksperymentów.
Następnie dopasowują dane zgodnie z modelem REDIFINE, korzystając z tego kodu. Zarejestruj 1D widmo tłumione przez wodę. Jeśli sygnał jest bardzo ograniczony, przekonuj eksperyment CONDENSE-MT.
Określ szybkość wody R1 za pomocą odzysku inwersji T1 dla ilościowego CONDENSE-MT. Skopiuj dostarczoną sekwencję impulsów i listę VD do odpowiednich folderów. Po kalibracji impulsu protonu 90 stopni, ustaw NS na 2, DS na 0, D1 na 20 sekund, SW na 10 części na milion.
TD2 do 16K i TD1 do 24. Dla eksperymentu CONDENSE-MT skopiuj dostarczony zestaw parametrów Brukera, sekwencję i listę częstotliwości do folderów specyficznych dla Brukera. Następnie dostosowujemy częstotliwości i moc zgodnie ze spektrometrem.
Ustaw P1 na skalibrowaną długość impulsu 90 stopni, a P4 na jedną mikrosekundę dla impulsu wzbudzającego, aby uniknąć tłumienia promieniowania. Ustaw NS na 2, DS na 16, D1 na cztery sekundy, SW2 na 20 części na milion, TD2 na 8k, a TD1 na długość listy częstotliwości. Ustaw SPNAM10 na Squa100 000, a P10 na pięć sekund.
Znajdź moc SP10, która daje promieniowanie o częstotliwości 100 herców. Dostosuj moc impulsu napromieniowania SP10 odpowiednio. Uruchom pseudo dwuwymiarowy eksperyment z odpowiednim poleceniem i ustaw serię tych pseudo eksperymentów 2D, zmieniając moc napromieniowania SP10.
Po dostosowaniu wszystkich parametrów uruchom kod do odczytu widma NMR, co integruje sygnał wody i zapisuje go w nowej zmiennej. W procesie odzyskiwania inwersji kodu dostosuj ścieżkę do odpowiednich danych i sprawdź region integracji wody. Następnie dostosuj numer eksperymentu zawierający dane odzyskiwania inwersji.
Ustaw wszystkie parametry eksperymentalne i wprowadź wartości pustej puli agarozy, które wcześniej uzyskano poprzez dopasowanie zestawu danych agarozy w podobny sposób. Uruchom pierwszą sekcję skondensowanego pustego kodu, aby uzyskać dopasowanie dla relaksacji podłużnej wody. Następnie uruchom sekcję skondensowanego pustego dopasowania, aby zainicjować wykres na żywo pokazujący minimalizację funkcji dopasowania.
Uruchom kolejną sekcję kodu, aby określić niepewności i wyrysować dane. Dopasowanie REDIFINE określało współczynniki dyfuzji w fazie rozcieńczonej i skondensowanej, populację białka w fazie skondensowanej, średnią wielkość kropli oraz przepuszczalność międzyfazową dla próbki FUS w domenie N-terminalnej. Sygnał NMR domeny N-końcowej FUS pozostał wykrywalny w fazie skondensowanej.
Nie zaobserwowano różnicy w profilu transferu magnetyzacji między agarozowym wzorem odniesienia a domeną FUS N-terminalną przez próbkę fazową. Dla kondensatów powtarzających się RNA CAG nie obserwuje się sygnału NMR. W związku z tym profil transferu magnetyzacji jest istotnie inny niż agarozowy referencyjny.
Eksperyment CONDENSE-MT dostarczył dynamicznej charakterystyki kondensatów RNA powtarzającej się ekspansji. Analiza CONDENSE-MT wykazała kinetykę wymiany protonów między kondensatem a wodą objętą. Analiza CONDENSE-MT wykazała również czas relaksacji poprzecznej RNA w kondensacie oraz pozorną szybkość relaksacji poprzecznej wody objętej.
W tym protokole możemy scharakteryzować właściwość kondensatu w stanie bifazowym bez potrzeby stosowania chemicznego znacznika. Krople współistnieją w rozcieńczonym środowisku, co umożliwia wymianę między dwiema fazami naśladującymi środowisko komórkowe. Nasze metody skupione na charakteryzacji kondensatu mogą być uzupełniane konwencjonalnymi metodami NMR do badania interakcji i dynamiki struktur molekularnych między fazami.
W przyszłych badaniach zamierzamy opracować bardziej złożone modele kondensatu, dostosowując metodologię do bardziej złożonych systemów, a ostatecznie badając kondensat bezpośrednio w ich środowiskach wewnątrzkomórkowych.
Przegląd
Kondensaty biomolekularne powstające w wyniku separacji faz ciecz-ciecz (LLPS) odgrywają kluczową rolę w organizacji środowiska wewnątrzkomórkowego i regulacji procesów biochemicznych. Charakterystyka składu, dynamiki i wewnętrznej organizacji tych kondensatów jest trudna, szczególnie bez zastosowania zewnętrznego znakowania. Niniejszy artykuł przedstawia dwie komplementarne metody spektroskopii rezonansu magnetycznego jądra (NMR), które umożliwiają kompleksową, bezznakową analizę kondensatów biomolekularnych w ich natywnym stanie dwufazowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia strukturalna
- Biofizyka
Wstęp
- Kondensaty biomolekularne powstają w wyniku procesu LLPS i są niezbędne dla organizacji komórkowej.
- Tradycyjne metody badania kondensatów często wymagają zastosowania zewnętrznych znaczników lub etykiet.
- Spektroskopia NMR oferuje metodę bez użycia znaczników do badania ruchu molekularnego i heterogeniczności środowiska.
- Zrozumienie właściwości kondensatów jest istotne dla powiązania ich struktury z funkcjami biologicznymi oraz chorobami.
Cel badania
- Opracowanie i zademonstrowanie metod opartych na NMR do charakteryzacji kondensatów biomolekularnych bez użycia zewnętrznych znaczników.
- Ilościowe określenie rozdziału molekularnego, dynamiki wymiany i organizacji wewnętrznej kondensatów.
- Zapewnienie wielowymiarowego, ilościowego obrazu struktury i dynamiki kondensatów w warunkach zbliżonych do naturalnych.
Zastosowane Metody
- Metoda NMR z wymianą dyfuzyjną: REstricted DIffusion of INvisible speciEs (REDIFINE).
- NMR z transferem namagnesowania w półciałach z detekcją wody: CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT).
- Pomiar kontrastu dyfuzyjnego, wymiany chemicznej i kontrastu relaksacyjnego.
- Analiza szybkości wymiany molekularnej, wielkości kropli, przepuszczalności interfejsu, dynamiki hydratacji oraz zawartości wody związanej.
Główne wyniki
- Metoda REDIFINE pozwala na ilościowe określenie frakcji cząsteczek rozdzielonych pomiędzy fazę skondensowaną a rozcieńczoną.
- Wyznaczanie wielkości kropli oraz przepuszczalności interfejsu za pomocą pomiarów dyfuzji i wymiany.
- Metoda CONDENSE-MT monitoruje kondensaty poprzez protony wody w całej objętości, ujawniając dynamikę rozdziału i hydratacji.
- Obie metody zapewniają kompleksową, bezetykietową charakterystykę struktury i dynamiki kondensatów.
Wnioski
- Integracja REDIFINE i CONDENSE-MT rozszerza zestaw narzędzi NMR stosowanych w badaniu separacji faz biomolekularnych.
- Metody te umożliwiają ilościową, wielowymiarową analizę kondensatów bez konieczności stosowania znaczników fluorescencyjnych lub detekcyjnych.
- Podejście to stanowi podstawę do powiązania właściwości fizykochemicznych kondensatów z ich funkcjami biologicznymi oraz patologiczną dysregulacją.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Beznakoznikowa charakterystyka kondensatów biomolekularnych metodą NMR wypełnia istotną lukę w wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając ilościową, wielowymiarową analizę zgromadzeń oddzielonych fazowo w warunkach zbliżonych do natywnych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego, wspierając podejmowanie świadomych decyzji dotyczących portfolio w kluczowych punktach zwrotnych. Integracja tych metod NMR z procesami odkrywania leków wzmacnia powiązanie między właściwościami fizykochemicznymi kondensatów a ich rolami biologicznymi lub patologicznymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę składu kondensatów i wymiany molekularnej bez użycia zewnętrznych znaczników.
- Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację współczynników rozdziału i szybkości wymiany między fazami.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celu poprzez ujawnienie dynamiki i organizacji kondensatów.
- Ułatwia selekcję projektów w portfelu poprzez rozróżnianie funkcjonalnych od patologicznych stanów kondensatów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe odczyty struktury i hydratacji kondensatów do dalszych analiz.
- Wspiera standaryzację testów poprzez dostarczanie powtarzalnych pomiarów bez użycia znaczników.
- Umożliwia przesiewowe badanie modulatorów wpływających na dynamikę kondensatów lub zachowanie fazowe.
- Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych systemach biomolekularnych wykazujących LLPS.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie fizykochemicznych właściwości kondensatów do mechanizmów związanych z chorobą w przypadku potwierdzenia patologii LLPS.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie cech kondensatów w różnych modelach.
- Wspiera rozwój projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka, dostarczając ilościowych, mechanistycznych biomarkerów stanu kondensatu.
- Zapewnia predykcyjną redukcję ryzyka dla celów terapeutycznych uwikłanych w zaburzenia związane z separacją faz.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsze metody NMR sytuują się w kontinuum procesu odkryć – od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne – umożliwiając precyzyjną charakterystykę mechanizmów sterowanych przez kondensaty.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie rozdziału i wymiany molekularnej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania analiz i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary dyfuzji, wymiany i hydratacji w celu porównania warunków i wsparcia procesów decyzyjnych.
- Badania translacyjne: Łączy właściwości kondensatów z mechanizmami chorobowymi w przypadkach, gdy zaangażowany jest proces LLPS.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku, beznakcjonalną platformę NMR dla różnorodnych systemów kondensatów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje analizę kondensatów bez użycia znaczników w zespołach B+R.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne ograniczanie ryzyka związanego z mechanizmami biologicznymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów istotnych dla procesu LLPS.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie NMR w roztworach oraz biofizyki separacji faz.
- Wymaga dostępu do wysokopolowej aparatury NMR i infrastruktury analitycznej.
- Korzysta ze standaryzacji przygotowania próbek i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Można zastosować zarówno w dynamicznych, jak i sztywnych układach kondensatów, wykorzystując komplementarne metody NMR.
- Ograniczono do kondensatów podatnych na detekcję NMR lub monitorowanie protonów wody zgodnie z opisem.
