Ekstrakcja DNA metodą kolumnową o średniej przepustowości z wykorzystaniem racków 24-dołkowych

Nasze badania koncentrują się na drukowanych w technologii 3D statywach do równoległej ekstrakcji DNA i RNA przy użyciu kolumn wirowych, co stanowi pomost między metodami manualnymi a zautomatyzowanymi. Rozwiązanie to eliminuje ograniczenia pracochłonnych manualnych metod z użyciem kolumn wirowych, umożliwiając jednoczesne przetwarzanie do 116 próbek DNA lub RNA. Aby rozpocząć, należy użyć drukarki 3D działającej w technologii FDM z dyszą o średnicy 0,4 milimetra w celu wydrukowania statywu.

Należy użyć filamentu z polilaktydu (PLA), glikolu polietyleno-tereftalatego (PETG) lub akrylonitrylo-butadien-styrenu (ABS) ze stuprocentowym wypełnieniem (100% infill). Wysokość warstwy należy ustawić na 0,1 mm i włączyć wygładzanie powierzchni. Ustawienia druku należy dostosować tak, aby zapewnić wodoszczelność i stabilność mechaniczną.

Przed pierwszym użyciem należy sprawdzić szczelność statywów. Aby przetestować wydrukowany zbiornik przed użyciem, należy napełnić go 70% ethanol. Centryfuguj przez stopniowo zwiększany czas, aby potwierdzić brak wycieków lub uszkodzeń strukturalnych.

Po pomyślnym przetestowaniu kleju, połącz komponenty zbiornika podstawowego, tworząc szczelną jednostkę. Zaszczep escherichia coli lub transformanty E.Coli w trzech do pięciu mililitrów pożywki lysogeny broth lub pożywki LB, zawierającej odpowiednie antybiotyki. Inkubuj kulturę przez 12 do 16 godzin w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu.

Wirować przy 2000 G przez 10 minut w celu zebrania komórek. Odlać supernatant. Do osadu dodać 250 µL buforu do resuspensji.

Następnie całkowicie resuspenduj osad, używając wortexa lub pipety. Dodaj 250 µL buforu do lizy. Wymieszaj delikatnie, odwracając probówkę od czterech do sześciu razy lub kołysząc płytką 24-dołkową.

Dodaj 350 µL buforu neutralizującego i wymieszaj. Zaobserwuj powstanie białego osadu, aby potwierdzić pomyślną neutralizację. Dodaj bufor lizujący do probówki zawierającej proszek dwutlenku tytanu.

Dodaj stosunek objętości do masy w proporcji dwa do jednego. Dodaj 250 µL zawiesiny dwutlenku tytanu do lizatu, a następnie wymieszaj, potrząsając probówką.

Dodać 350 µL buforu neutralizującego i dokładnie wymieszać. Odwirować przy 2000 G przez 10 minut. Obserwować całkowite wytrącenie pelletu komórkowego w obecności dwutlenku tytanu oraz całkowitą przejrzystość nadfiltratu.

W przypadku braku dwutlenku tytanu należy zwrócić uwagę na obecność pozostałego osadu w nadfiltracie. Zebrać nadfiltrat, nie naruszając osadu, i przenieść go do kolumny wiążącej. Umieścić kolumny do wiązania DNA w warstwie uchwytu na kolumny w statywie.

Umieść pokrywy kolumn w wyznaczonych gniazdach, aby zabezpieczyć je podczas wirowania. Umieść kolumny do klarowania lub filtrowania w warstwie kolumn filtrujących bezpośrednio nad kolumnami wiążącymi. Przenieś przygotowany zneutralizowany lizat do kolumn filtracyjnych.

Umieść zmontowany statyw w rotorze z koszykami z kątem nachylenia. Wiruj przy 2000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po wyjęciu statywu z wirówki, zdejmij i wyrzuć warstwę kolumny filtrującej.

Przelej ciecz przepływową z zbiornika do pojemnika na odpady. Ponownie zamontuj statyw z kolumnami wiążącymi. Dodaj od 500 do 700 µL buforu płuczącego do każdej kolumny wiążącej.

Wirować przy 2000 G przez jedną minutę. Odlać ciecz z otworu zbiornika i powtórzyć etap płukania, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Wyjąć kolumny wiążące ze statywu i przenieść je do probówek zbierających o pojemności dwóch mililitrów.

Wiruj w wirówce przy 10 000 G lub więcej przez jedną minutę, aby osuszyć membranę. Przenieś kolumny do czystych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 50 µl buforu elucyjnego lub wody bezpośrednio na membranę i inkubuj kolumny przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Wirować przy 10 000 G lub więcej przez jedną minutę w celu elucji DNA. Całkowita wydajność plazmidów nie wykazała istotnych różnic między metodą konwencjonalną a ekstrakcją z wykorzystaniem konfiguracji statywów. Potwierdzenie obecności plazmidu zostało zachowane przy podobnym rozkładzie form relaksowanych, linearyzowanych i superzwiniętych.

Rozkład barwnika ograniczał się do obszaru odpadowego bezpośrednio pod obciążonymi kolumnami, przy braku widocznego sygnału w przyległych studzienkach lub na końcówkach sąsiednich kolumn, co wskazuje, że konstrukcja statywu zmniejsza prawdopodobieństwo rozbryzgów i przenoszenia materiału między kolumnami. Amplifikację wykryto wyłącznie w eluatach z kolumn, do których dodano amplikon. Cząstka ta pozwala badaczom na uzyskanie wysokiej jakości plazmidowego DNA do dalszych zastosowań, w tym klonowania, sekwencjonowania oraz analizy PCR.

Najważniejszą kwestią podczas wykonywania tego protokołu jest zapobieganie kontaminacji krzyżowej poprzez zapewnienie szczelności i dopasowania drukowanych w technologii 3D zbiorników. Ponadto, po przeprowadzeniu tej procedury, statywy te mogą być wykorzystane do dowolnej analizy ekstrakcji kwasów nukleinowych opartej na kolumnach.