ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Johnowi Fullerowi, Nickowi Morganowi oraz firmie Beckman Coulter Life Sciences (BCLS) za wsparcie logistyczne i opracowanie protokołu z użyciem ECHO Acoustic Dispenser. Dziękujemy Mitchellowi Kozakoffowi z ICCB-Longwood Screening Facility na Harvard Medical School za infrastrukturę i zasoby techniczne. Za usługi czystych pomieszczeń dziękujemy placówce KNMRC na Northeastern University. Autorzy chcą również podziękować Laurze Shumate z firmy Keytech, jak również grupie w firmie Shakotis Ltd. Finansowanie staży studenckich zostało hojnie zapewnione przez Massachusetts Life Sciences Center (Mass Life Sciences). Praca ta była również częściowo wspierana przez MEDTEQ+, którego wkład pomagał w rozwijaniu i walidacji platformy. Dziękujemy również dr. Steve'owi S. Shih z Concordia University

Pierwotne ludzkie komórki T użyte w tym protokole zostały uzyskane od komercyjnych dostawców na podstawie pisemnej zgody odbiorców i zgodnie z obowiązującymi wytycznymi instytucjonalnymi, etycznymi i regulacyjnymi. Wszelkie obchodzenie się z materiałami biologicznymi pochodzenia ludzkiego było prowadzone zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Badacze stosujący ten protokół są odpowiedzialni za zapewnienie, że ich użycie pierwotnych ludzkich komórek jest zgodne z wymaganiami lokalnej rady recenzji instytucjonalnej (IRB) lub komitetu etycznego, obowiązującymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz wszelkimi odpowiednimi przepisami krajowymi lub regionalnymi regulującymi użycie ludzkiego materiału biologicznego. Żadne informacje identyfikujące pacjenta nie były związane z materiałem komórkowym użytym w tym badaniu.
1. Przygotowanie i aktywowanie pierwotnych ludzkich komórek T
<ol>
	<li>Szybko odmrażać krioprzechowywane pierwotne ludzkie CD3⁺ komórki T w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść komórki do wstępnie podgrzanego podstawowego pożywka dla komórek T i wyśrodkować przez 10 min. przy 180 × g. Odrzucić nadstan i ponownie zawiesić osadut w świeżym pożywce.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie komórek i ich żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Zawiesić komórki w stężeniu 1 × 106 komórek/mL w pożywce do hodowli komórek T uzupełnionej rozpuszczalnym tetramerycznym przeciwciałem CD3/CD28 T-cell activator stimulus (zgodnie z instrukcjami dostawcy) i 200 IU/mL IL-2. Wyhodować komórki przez 72 h w 37 °C, 5% CO₂. 
	UWAGA: Utrzymać stężenie komórek w zakresie 0,5–2 × 106 komórek/mL podczas aktywacji. Przeprowadzić aktywację w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie U w celu optymalizacji kontaktu komórek z aktywatorem i efektywności aktywacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie plamek RNA przewodnikowego na podłożu DMF (nakręcanie przez akustyczny dozownik)
<ol>
	<li>Odtwarzać liofilizowano RNA przewodnikowe w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia stockowego 100 µM. W osobnej probówce przygotować stockową 100 mg/mL kwasu poli-L-glutaminowego (PGA, sól sodowa, masa cząsteczkowa 15 000–50 000 Da) w wodzie wolnej od nukleaz. Połączyć RNA przewodnikowe i stock PGA w proporcji objętości 5:4 (RNA przewodnikowe: PGA), co daje ostateczne stężenie RNA przewodnikowego 55,6 pmol/µL i ostateczne stężenie PGA 44,4 mg/mL w wodzie wolnej od nukleaz. Skręcić krótko i wyśrodkować przez 30 s przy 1 000 × g i rozdzielić na jednorazowe objętości oraz przechowywać niezużyte alikwoty w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. 
	UWAGA: Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Dodać mieszankę przewodnika-PGA do płyty źródła akustycznego o małej objętości śmierci w dołkach odpowiadających pożądanemu układowi miejsc reakcji.</li>
	<li>Przenieść 40 nL (równoważne 2,2 pmol RNA przewodnikowego) mieszanki przewodnika-PGA do każdego regionu docelowego plamki na podłożu DMF za pomocą skalibrowanego akustycznego dozownika. 
	UWAGA: Przy 55,6 pmol/µL, 40 nL dostarcza 2,2 pmol RNA przewodnikowego na miejsce (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Wysuszone przewodniki są odtwarzane podczas łączenia kropli na karcie; pełne zawieszenie jest potwierdzane przez jednolitą efektywność edycji w całym miejscu.</li>
	<li>W szafce bezpieczeństwa biologicznego pozostawić plamki, aby całkowicie osuszyły się na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż nie pozostanie widoczny płyn (około 5 min). 
	UWAGA: Nie należy używać wymuszonego przepływu powietrza ani ciepła, ponieważ może to spowodować oderwanie lub degradację RNA przewodnikowego.</li>
	<li>Złożyć kartridż DMF.
	<ol>
		<li>W szafce bezpieczeństwa biologicznego wyrównać górną płytę nad nakrytym podłożem, dopasowując asymetryczne plastikowe elementy do pasowania od górnej płyty do wycięć na dolnej płycie. Nałożyć równomierną, jednoczesną nacisk wzdłuż krótkich krawędzi, aż poczuje się wyraźne mechaniczne zaciśnięcie, co potwierdza pełne zaangażowanie elementów zamykających. 
		UWAGA: Kartridż jest zaprojektowany z jednym poprawnym ułożeniem; niewłaściwa montaż nie wytworzy zaciśnięcia. Zawsze trzymać podłoża za krawędzie, aby uniknąć skażenia lub uszkodzenia funkcjonalnych powierzchni i unikać przesuwania podłoży nawzajem, ponieważ może to zarysować powłoki powierzchniowe.</li>
		<li>Punkt kontrolny: Potwierdzić poprawne złożenie za pomocą mechanicznego zaciśnięcia. 
		UWAGA: Nie ma wskaźnika elektrycznego poprzedzającego uruchomienie kontroli integralności powłoki; wszelkie awarie funkcjonalne wynikające z niewłaściwej montażu są automatycznie wykrywane i zgłaszane w raporcie QC po uruchomieniu. 
		Punkt przerwy: Przechowywać

<ol>
	<li>Roth, T. L., Puig-Saus, C., Yu, R., Shifrut, E., Carnevale, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting.">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 285-297 (2018).</li><li>Li, L. H., McCarthy, P., Hui, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+electrotransfection+of+human+primary+hematopoietic+stem+cells.">High-efficiency electrotransfection of human primary hematopoietic stem cells.</a> FASEB J. 15 (1), 159-167 (2001).</li><li>Parnas, O., Jovanovic, M., Eisenhaure, T. M., Herbst, R. H., Dixit, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+screen+in+primary+immune+cells+to+dissect+regulatory+networks.">A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks.</a> Cell. 162 (3), 675-686 (2015).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li><li>Pollack, M. G., Fair, R. B., Shenderov, A. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrowetting-based+actuation+of+liquid+droplets+for+microfluidic+applications.">Electrowetting-based actuation of liquid droplets for microfluidic applications.</a> Appl Phys Lett. 77 (11), 1725-1726 (2000).</li><li>Sinha, H., Quach, A. B. V., Vo, P. Q. N., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+gene-editing+platform+for+deciphering+cancer+genes.">An automated microfluidic gene-editing platform for deciphering cancer genes.</a> Lab Chip. 18 (21), 3291-3301 (2018).</li><li>Little, S. R., Rizzetto, S., Sherwood, C. A., Quach, A. B. V., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tri-droplet+liquid+structure+for+highly+efficient+intracellular+delivery+in+primary+mammalian+cells+using+digital+microfluidics.">A tri-droplet liquid structure for highly efficient intracellular delivery in primary mammalian cells using digital microfluidics.</a> Adv Mater Technol. 8 (11), 2300719 (2023).</li><li>Little, S. R., Vo, P. Q. N., Sinha, H., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+microfluidic+platform+for+the+microscale+production+of+functional+immune+cell+therapies.">A digital microfluidic platform for the microscale production of functional immune cell therapies.</a> Anal Chem. 97 (21), 11026-11034 (2025).</li><li>Patel, M. A., Boribong, B. P., Sinha, H., Xiao, B., Xie, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+scalable+arrayed+CRISPR+screening+in+primary+cells+enables+discovery+at+the+single+donor+resolution.">Miniaturized scalable arrayed CRISPR screening in primary cells enables discovery at the single donor resolution.</a> Sci Rep. 15, 29350 (2025).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nguyen, D. N., Roth, T. L., Li, P. J., Chen, P. A., Apathy, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency.">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li></ol>

M.A.P, H.S, P.Q.N.V, A.B.C, A.E, M.W i A.H są obecnymi lub byłymi pracownikami lub udziałowcami DropGenie. M.S. jest obecnym lub byłym pracownikiem lub udziałowcem FIDA Biosciences. Pozostali autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Ten protokół opisuje zminiaturyzowany przepływ mikrofluidycznej elektroporacji, który umożliwia wydajne dostarczanie substancji do komórek T pierwotnych u ludzi za pomocą kropli w skali nanolitrowej. Główną zaletą tej metody jest możliwość wykonywania edycji genomu CRISPR–Cas9 przy użyciu zaledwie 10 000 komórek na reakcję, co znacznie zmniejsza wymagania materiałowe w porównaniu z konwencjonalną elektroporacją. Oparta na kroplach architektura wspiera automatyzację, zapewniając powtarzalne obchodzenie się z reagentami i ...

Edycja genów w komórkach pierwotnych człowieka staje się coraz bardziej centralna zarówno w rozwoju terapii, jak i w badaniach podstawowych, w tym w zastosowaniach inżynierii immunologicznej, modelowaniu rzadkich chorób i genomice funkcjonalnej1. Chociaż elektroporacja umożliwia bardzo wydajne edycję genomu, konwencjonalne systemy oparte na cuwetach zazwyczaj wymagają do milionów komórek na warunek, co ogranicza ich zastosowanie do próbek pochodzących od pacjentów i rzadkich populacji immunologicznych2. Ponadto systemy te są słabo przystosowane do przesiewowych badań na dużą skalę ze względu na ograniczenia dotyczące przepustowości, automatyzacji i zużycia reagentów3.
Mikrofluidyczna elektroporacja stała się obiecującym podejściem do edycji genomu z małymi zasobami4. Jednak większość istniejących platform opiera się na architekturach o ciągłym przepływie, które wymagają złożonego przetwarzania płynów, ograniczonej elastyczności w mieszaniu reagentów i stosunkowo wysokich wymagań dotyczących liczby komórek na warunek. W przeciwieństwie do tego, mikrofluidyka cyfrowa (DMF) umożliwia aktywne sterowanie dyskretnymi kroplami o objętości nanolitrów na płaskiej tablicy elektrod, pozwalając na precyzyjną kontrolę nad składem reakcji, czasem i lokalizacją przestrzenną. Ten format oparty na kroplkach typu plug-and-play jest dobrze przystosowany do nisko-wolumenowych, wysoko-przepustowościowych przepływów pracy, w których konserwacja pierwotnych komórek i reagentów jest istotna5.
Ostatnie prace wykazały wykonalność dostarczania wewnątrzkomórkowego opartego na DMF za pomocą architektur elektroporacji trójkropkowej, które generują zlokalizowany, niskoprądowy elektroporacji generujący pola elektryczne dla efektywnego dostarczania RNP i mRNA, minimalizując stres termiczny i elektrochemiczny6,7,8. Budując na tej podstawie, stworzona została platforma elektroporacji DMF nowej generacji, zwana ‘DMF-ection’, która obejmuje 48 niezależnie adresowalnych miejsc reakcji, pełną kompatybilność z automatyzacją oraz skalowalną produkcję kaset9 (Rysunek 1). Kasetka DMF składa się z dolnej płyty PCB i plastikowej górnej płyty oddzielonych uszczelką, złożonych za pomocą uchwytów mocujących w pojedynczej poprawnej orientacji (Rysunek 1A). Układ 48-pozycyjny jest zorganizowany w ośmiu identycznych rodzinach (Rysunek 1A-H), z których każda zawiera sześć niezależnie adresowalnych miejsc elektroporacji, obsługujących do 48 warunków edycji równolegle na kasetce (Rysunek 1B). Biblioteki RNA przewodników są zdeponowywane na powierzchni podłoża za pomocą akustycznego dozownika przed złożeniem kasetki. Dokładność pozycyjna depozycji została potwierdzona dla wszystkich 48 miejsc, z pozycjami kropli skupiającymi się w odstępstwie poniżej milimetra od środka elektrod (Rysunek 1C), co wspiera niezawodne gromadzenie RNP na kasetce. Po załadowaniu komórki i krople elektrod płynowych są aktywne na kasetce, tworząc geometrię elektroporacji trójkropek (Rysunek 1D). Po elektroporacji komórki są rozładowywane do płytek hodowlanianych w celu regeneracji i analizy poniżej, w tym cytometrii przepływowej, sekwencjonowania i mikroskopii (Rysunek 1E). System ten umożliwia wydajną edycję genomu przy użyciu do 100-krotnie mniejszej liczby komórek niż standardowe metody oparte na cuwetach, znacznie poszerzając dostęp do inżynierii genomu w aplikacjach o niskiej liczbie komórek i wysokiej przepustowości.
Niniejsze badanie ocenia wydajność platformy poprzez dostarczanie wielu ładunków biomolekularnych, w tym kompleksów mRNA i kryspr-Cas9 rybonukleoproteinowych (RNP), osiągając efektywną transfekcję i zakłócenie genów. Oprócz pierwotnych komórek T, DMF-ection zapewnia ogólną ramę dostarczania kwasów nukleinowych do złożonych wielokomórkowych struktur. Trójwymiarowe (3D) sferoidy i modele organoidowe stanowią znaczne bariery dla przenikania reagentów ze względu na ich architekturę i delikatność, a konwencjonalne podejścia elektroporacji często zakłócają morfologię lub generują heterogeniczne dostarczanie. Aby ocenić, czy te same zasady miniaturyzacji elektroporacji stosowanej do edycji komórek T działają w tkankach strukturalnych, przepływ DMF został zastosowany do 3D sferoidów HEK293T. Te eksperymenty wykazały, że elektrozwilżanie oparte na DMF może delikatnie ustawić całe sferoidy w geometriach trójkropek i wspierać jednolite dostarczanie mRNA, zachowując strukturę i wzrost. Chociaż wyniki te wykraczają poza opisany tutaj protokół dotyczący komórek T, ilustrują szersze zastosowanie programowalnej elektroporacji DMF dla nowych 3D systemów komórkowych istotnych dla odkrywania leków i modelowania chorób.

<table><tbody><tr><td>12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette</td><td>Integra</td><td>4732</td><td>Instrumentation</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td>Flow Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface</td><td>Thermo Fisher</td><td>174927</td><td>Spheroid protocol</td></tr><tr><td>96-well conical-bottom plate&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td>Spheroid protocol</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>357421</td><td>1 in 200, Clone A161A1</td></tr><tr><td>Attune Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Instrumentation</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>10564011</td><td>Media Supplement- Spheroid culture</td></tr><tr><td>DMF compatible buffer</td><td>DropGenie</td><td></td><td>Transfection</td></tr><tr><td>DropGenie Transfection System</td><td>DropGenie</td><td></td><td>Instrumentation</td></tr><tr><td>Echo&nbsp;Acoustic Dispenser 650 Series</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo&nbsp;Qualified 384-well Low Dead Volume</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Flow Buffer</td></tr><tr><td>EGFP mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7201</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Fluorescent Microscope</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Instrumentation</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Media Supplement- Spheroid culture</td></tr><tr><td>Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector</td><td>Fida Biosystems ApS</td><td></td><td>Instrumentation</td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510</td><td>Cytek Biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>Spheroid protocol</td></tr><tr><td>Human IL-2 Recombinant Protein,</td><td>Peprotech</td><td>200-02 50ug</td><td>T cell media supplement</td></tr><tr><td>Human Primary Pan CD3+ T Cells</td><td>All Cells</td><td></td><td>Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected</td></tr><tr><td>Immunocult CD3/CD28 Activator</td><td>StemCell Technologies</td><td>10970</td><td>T Cell Activation media</td></tr><tr><td>Immunocult Expansion Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>10981</td><td>T Cell Activation media</td></tr><tr><td>Incucyte Live Cell Analysis System</td><td>Sartorius</td><td></td><td>Instrumentation</td></tr><tr><td>INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot</td><td>Integra</td><td>4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),&nbsp;</td><td>Instrumentation</td></tr><tr><td>non targeting synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5&rsquo; GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-202</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human TCR &alpha;/&beta; Recombinant Antibody</td><td>Biolegend</td><td>380805</td><td>1 in 200, Clone QA20B12&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-Cy 7 Anti-Human CD8</td><td>BD Pharmingen</td><td>557750</td><td>1 in 200, Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Media Supplement- Spheroid culture</td></tr><tr><td>Poly-L-glutamic Acid (PGA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4761-100MG</td><td>Use a at 100mg/ml</td></tr><tr><td>Prism version 8.0.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease</td><td>IDT</td><td>10017687</td><td></td></tr><tr><td>Spheroid Microplate</td><td>Corning</td><td>3830</td><td>Spheroid protocol</td></tr><tr><td>Surfactant F</td><td>DropGenie</td><td></td><td>Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer</td></tr><tr><td>TRAC synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5&rsquo; AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>Spheroid protocol</td></tr></tbody></table>

platforma elektroporacji cyfrowej mikrofluidycznej do edycji genomu crispr z niskim wejściem i transfekcji mrna w zawiesinach limfocytów t oraz modelach komórkowych 3d

A Digital Microfluidic Electroporation Platform for Low-Input CRISPR Genome Editing and mRNA Transfection In Suspension T Cells and 3D Cell Models

Cyfrowa mikrofluidyka (DMF) umożliwia precyzyjne, małoobjętościowe manipulowanie genetyczne komórek ssaczych, minimalizując jednocześnie wpływ komórkowy do 100x i zachowując żywotność. Niniejsze badanie przedstawia przepływowy proces transfekcji oparty na DMF do CRISPR-pośredniczonego nokautowania locus TRAC w pierwotnych ludzkich komórkach T zawiesinowych oraz do transfekcji mRNA trzech wymiarowych sferoidów HEK293T. Wykorzystując przestrzennie zdeponowane krysprorny RNA przewodnik i montaż rybonukleoproteiny (RNP) na wkładce, uzyskano efektywne uszkodzenie locus TRAC zarówno w populacjach komórek CD4⁺ jak i CD8⁺, używając tylko 10 000 komórek na warunek, przy czym żywotność po edycji przekraczała 85%. Charakterystyka biofizyczna za pomocą analiz indukowanych przepływem i dyfuzji Taylora wykazała, że dodatki polimerowe stabilizują kompleksy Cas9-sgRNA w warunkach buforu elektroporacyjnego, co wspiera reproduktywalne edycje w objętościach poniżej mikrolitara. Proces został również zaadaptowany do zastosowań 3D poprzez dostarczenie mRNA EGFP do nienaruszonych sferoidów HEK293T, co skutkowało mocną i przestrzennie jednolitą fluorescencja bez upośledzenia wzrostu czy morfologii sferoidów. Razem wyniki te pokazują, że elektroporacja DMF umożliwia efektywne edycje genomu i dostarczanie mRNA zarówno dla komórek odpornościowych w zawiesinie, jak i dla wielocząsteczkowych sferoidów. Ta platforma zapewnia skalowalne i nisko-inputowe rozwiązanie dla zastosowań w terapii CAR-T, funkcjonalnej genomice oraz zaawansowanych 3D modelach komórkowych.

Oczekiwane wyniki 
Elektroporacja 10 000 aktywowanych limfocytów T na warunek zazwyczaj skutkuje wydajnością knockoutu TRAC na poziomie &#62;85% przy przeżywalności &#62;95% 72 h po transfekcji. Cytometria przepływowa wykazuje wyraźną utratę barwienia TCRα/β w warunku celującym w TRAC w porównaniu z kontrolami z niecelującym sgRNA (NTC) oraz kontrolami niepoddanymi działaniu pól elektrycznych. O ile nie zaznaczono inaczej, n oznacza niezależne serie DMF-ection przeprowadzone w różne dni. Re...

Ten protokół opisuje zminiaturyzowaną edycję genomu CRISPR–Cas9 receptora TCRα/β w pierwotnych ludzkich komórkach T za pomocą ‘DMF-ekcji’, platformy elektroporacji cyfrowych mikrofluidów (DMF). Metoda umożliwia równoległą edycję genów z małym zapotrzebowaniem na wysoką żywotność i jest ponadto przystosowana do dostarczania mRNA do wielowarstwowymi 3D kulistości.

Platforma elektroporacji cyfrowej mikrofluidycznej do edycji genomu CRISPR z niskim wejściem i transfekcji mRNA w zawiesinach limfocytów T oraz modelach komórkowych 3D

Digital microfluidic (DMF) electroporation enables precise, low-volume genetic manipulation of mammalian cells while minimizing cellular input by up to ...

Our research develops automated digital microfluidic platforms for efficient low input transfection and CRISPR gene editing. Standard electrocuration requires millions of cells. This platform achieves efficient editing with only 10, 000 cells per condition.To begin, obtain a T75 flask from the incubator containing CD3 positive human primary T cells. In the tissue culture hood, transfer the cells to a 15 milliliter falcon tube and centrifuge at a relative centrifugal force of 200 for five minutes. Discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of fresh medium.Pipette 10 microliters of cell suspension into a counter cell counting chamber. Using an automated cell counter, determine the cell concentration and viability. Pipette 100, 000 cells into four to five wells of a V-bottom well plate and place on ice.Reconstitute one lyophilized track knockout targeting single guide RNA or other sgRNA and one lyophilized non-targeting control, or NTC sgRNA, in nucleus free water to a stock concentration of 100 micromolar. After preparing a 100 milligram per milliliter stock solution of polyL-glutamic acid, or PGA, in nucleus free water in two tubes, label the tubes as, tra

a-digital-microfluidic-electroporation-platform-for-low-input-crispr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy sposób wykonania prostego urządzenia mikroprzepływowego, które można zintegrować ze standardowymi zestawami do elektrofizjologii, aby w kontrolowany sposób eksponować mikroskalowe powierzchnie skrawka mózgu na działanie różnych neuroprzekaźników.

Stymulacja skrawków mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidycznej i standardowej komory perfuzyjnej

Wychwytywanie limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem jednorazowego chipa mikroprzepływowego w badaniach nad HIV

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach...

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół inżynierii genomowej opartej na CRISPR/Cas9 pierwotnych ludzkich limfocytów B do nokautowania genów (KO) i knock-in (KI) w celu zbadania biologicznych funkcji genów w komórkach B i rozwoju terapii komórek B.

Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

DropGenie.  This protocol describes miniaturized CRISPR–Cas9 genome editing of TCRα/β receptor in primary human T cells using ‘DMF-ection’, a digital microfluidic (DMF) electroporation platform. The method enables parallel, low-input gene editing with high viability and is further adaptable for mRNA delivery into multicellular 3D spheroids.

Platforma elektroporacji cyfrowej mikrofluidycznej do edycji genomu CRISPR z niskim wejściem i transfekcji mRNA w zawiesinach limfocytów T oraz modelach komórkowych 3D

Przeglądaj więcej filmów