Wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej
5 czerwca 2026
Ten protokół przedstawia mikroskopie konfokalną światła odbitego do obiektywnej, pojedynczej komórkowej detekcji aktywności senescencji związanej z beta-galaktozydazą (SA-β-gal) w frakcji naczyniowej stromy izolowanych z ludzkiego tkanki tłuszczowej. Metoda jest kompatybilna z immunocytochemią, zawiera kontrole pH do oceny ilościowej i dodatkowo zapewnia bardziej wrażliwą i mniej subiektywną alternatywę dla konwencjonalnego barwienia SA-β-gal.
Badamy starzenie się adipocytów na różne złożenia tkanki tłuszczowej i warunki metaboliczne, takie jak otyłość i hiperinsulinemia. Tradycyjne testy SABG oparte na jasnym polu nie pozwalają naprawdę na multiplexing i są bardzo subiektywne. Nasz nowy protokół jest mniej subiektywny i pozwala na multiplexing.
Na początek pobieraj probówkę zawierającą ludzką tkankę tłuszczową. Zhomogenizuj 10 gramów tkanki tłuszczowej i dodaj do probówki zawierającej 0,05% enzymu kolagenowego typu jeden, aby uzyskać około milion komórek frakcji śródnaczyniowej, lub SVF. Włóż po 500 000 komórek do każdej mikrocentrfużującej probówki o pojemności 1,5 ml.
Dodaj jeden mililitr 2% paraformaldehydu do probówki w celu fiksacji komórek. Następnie inkubuje się na wahadle w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Wiruje się przez 10 minut przy 600G i usuwa się nadstan.
Przygotuj roztwór barwienia X-Gal za pomocą zestawu do barwienia beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się zgodnie z instrukcjami producenta. Włóż jeden mililitr roztworu barwnikowego do trzech świeżych probówek. I wyreguluj pH do pięciu, sześciu i ośmiu za pomocą jednomolarnego kwasu solnego lub jednomolarnego roztworu wodorotlenku sodu.
Użyj kalibrowanego miernika pH, aby zweryfikować pH. Dodaj dostosowany pH X-Gal do każdej z etykietowanych probówek zawierających 500 000 komórek. Inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny bez dwutlenku węgla.
Wiruje się komórki przez 10 minut przy 600G. Po usunięciu nadstanu, przepłukuj komórki za pomocą PBS. I wiruje się ponownie przez 10 minut przy 600G.
Po usunięciu nadstanu, aby zidentyfikować komórki śródbłonkowe w obrębie heterogenicznej SVF, inkubowano komórki z komórkami śródbłonkowymi oznaczonymi antyciałami pierwotnymi CD31 lub kontrolnym IgG przez całą noc w czterech stopniach Celsjusza. Przepłukuj komórki trzy razy z 0,1% PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wahadle, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwotne. I wiruje się przez 10 minut przy 600G.
Po odrzuceniu nadstanu, inkubowano komórki z przeciwciałami wtórnymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wahadle. Wiruje się przez 10 minut przy 600G, aby usunąć roztwór barwnika przeciwciała wtórnego. Przepłukuj komórki trzy razy za pomocą PBST, a następnie wiruje się zgodnie z wcześniejszymi wskazówkami.
Ponownie zawiesz komórki w środku przeciwsłaniającym. Wypij zawiesinę komórek na szkiełka mikroskopowe i wylecz przez noc w temperaturze pokojowej, aby unieruchomić komórki. Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów 100% glicerolu.
Umieść pokrywkę na wierzchu i uszczelnij go lakierem do paznokci. Umieść przygotowane szkiełko na stole mikroskopowego konfokalnego. W interfejsie oprogramowania mikroskopu wybierz opcję Ścieżka świetlna i wyreguluj ustawienie dzielacza wiązki do T90R10.
Następnie zweryfikuj wartości długości fali odcięcia dla wtórnych luster dwóch kierunków, lub SDM, w ustawieniach Lustro. W menu Detektora kliknij opcję Farba i Wybór Detektora, aby przypisać kanały i długości fal wzbudzenia. Następnie ustaw wartości procentowe intensywności mocy lasera dla każdego konkretnego lasera w zakresie od 10 do 15% W menu Seria, w sekcji LSM, przełącz opcję Z na Wł.Ustaw wielkość kroku Z na optymalną wartość systemową 0,74 mikrometra.
Następnie, pod menu Z Sekcja, wprowadź wartość dla pola wejściowego start i zdefiniuj stos Z na podstawie sygnału membrany, aby uchwycić pełną objętość komórki. Pod panelem Nabywania, wprowadź nazwę pliku i lokalizację zapisu pliku w polu wejściowym LSM. I kliknij na LSM Start, aby rozpocząć akwizycję obrazu.
I zapisz pliki w natywnym formacie mikroskopu oir. Po nabyciu użyj strzałek nawigacyjnych Z, aby zweryfikować sygnał i dystrybucję ogniskowania różnych barwników w całym stosie Z. Prześlij zapisany plik oir do Image J. W oknie wyskakującym Opcje importu Bio-Formats kliknij OK.
Kliknij na menu Obraz, aby otworzyć plik. I z opcji rozwijanych, wybierz Kolor, a następnie opcję Podziel kanały, aby otworzyć różne kanały jako oddzielne okna. Następnie dostosuj kontrast jasności i zoptymalizuj wartości LUT za pomocą opcji Dostosuj w menu Obraz dla lepszej wizualizacji obrazu.
Użyj paska przewijania osi Z na dole ramki, aby przejść przez sekcje optyczne i zweryfikować cechy komórkowe w całym stosie. W menu Obraz wybierz Stos. Następnie wybierz funkcję Z Project, aby wygenerować sumujące projekcje intensywności trójwymiarowego obrazu konfokalnego.
W oknie dialogowym Z Projekcja, zdefiniuj zakresy początkowych i końcowych krojów. Wybierz typ projekcji i kliknij OK, aby uzyskać końcowy obraz składowy 2D. Następnie przejdź do menu Obraz.
Wybierz opcję Typ, aby dostosować typ obrazu do 16-bitowego. Następnie zapisz i eksportuj obrazy jako 16-bitowe pliki TIF. Zaimportuj zapisane obrazy do CellProfiler wersja 4.2.8 do zautomatyzowanej segmentacji komórek, ilościowego pomiaru intensywności odbijanego światła dla każdej kom
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowaną metodę konfokalnej mikroskopii światła odbitego do ilościowego wykrywania aktywności β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-gal) w ludzkich komórkach frakcji naczyniowej (SVF). Podejście to umożliwia obiektywną analizę pojedynczych komórek, pozwala na wielokrotne immunocytochemiczne wykrywanie dodatkowych markerów starzenia lub linii komórkowych oraz obejmuje kontrole z dopasowanym pH. Stanowi ono czułą i powtarzalną alternatywę dla konwencjonalnych, subiektywnych testów SA-β-gal w heterogenicznych populacjach pierwotnych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Starzenie komórkowe
- Wykrywanie biomarkerów
- Mikroskopia konfokalna
Wstęp
- SA-β-gal jest powszechnie stosowanym markerem komórek senescentnych, jednak konwencjonalne testy opierają się na subiektywnej ocenie wizualnej.
- Ograniczenia te są szczególnie widoczne w heterogenicznych populacjach pierwotnych ludzkich komórek, takich jak frakcja naczyniowo-stromalna (SVF) pochodząca z tkanki tłuszczowej.
- SVF zawiera preadipocyty, komórki odpornościowe oraz komórki śródbłonka, co utrudnia analizę pojedynczych komórek.
- Istnieje zapotrzebowanie na ilościowe, obiektywne metody wykrywania senescencji w złożonych tkankach.
Cel badania
- Opracowanie zoptymalizowanej metody konfokalnej mikroskopii w świetle odbitym do wysokorozdzielczego, ilościowego wykrywania SA-β-gal.
- Umożliwienie obiektywnej analizy pojedynczych komórek w heterogenicznych populacjach ludzkich SVF.
- Umożliwienie jednoczesnej immunocytochemii w celu multipleksowego wykrywania markerów starzenia i markerów linii komórkowych.
- Wprowadzenie kontroli z dopasowanym pH w celu zwiększenia swoistości.
Zastosowane metody
- Konfokalna mikroskopia światła odbitego do detekcji SA-β-gal.
- Kontrole z dopasowanym pH w celu odróżnienia specyficznej aktywności enzymatycznej.
- Immunocytochemia do jednoczesnej detekcji markerów starzenia i markerów linii komórkowych.
- Analiza obrazów pojedynczych komórek do pomiarów ilościowych.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia obiektywny, ilościowy pomiar aktywności SA-β-gal w pojedynczych komórkach.
- Pozwala ona na jednoczesną detekcję dodatkowych markerów starzenia lub linii komórkowych za pomocą immunocytochemii.
- Kontrole z dopasowanym pH zwiększają specyficzność i redukują sygnały fałszywie dodatnie.
- Podejście to jest powtarzalne i czułe w heterogenicznych pierwotnych ludzkich komórkach SVF.
Wnioski
- Zoptymalizowana metoda mikroskopii konfokalnej stanowi doskonałą alternatywę dla konwencjonalnych testów SA-β-gal.
- Umożliwia ona wysokorozdzielcze, ilościowe i wieloparametrowe wykrywanie starzenia komórkowego.
- Podejście to jest szczególnie wartościowe w badaniu starzenia w złożonych pierwotnych tkankach ludzkich, takich jak SVF tkanki tłuszczowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe wykrywanie starzenia się komórek w heterogenicznych populacjach pierwotnych ludzkich komórek ma kluczowe znaczenie dla ograniczania ryzyka na etapie wczesnego odkrywania oraz walidacji celów w procesach rozwoju leków na choroby metaboliczne i związane z wiekiem. Zoptymalizowane podejście z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii światła odbitego umożliwia obiektywną analizę pojedynczych komórek pod kątem aktywności β-galaktozydazy związanej ze starzeniem, co wspiera pewność prognostyczną i rzetelną ocenę biomarkerów. Możliwość ta usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio poprzez dostarczanie powtarzalnych, multipleksowanych danych w złożonych systemach tkankowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia obiektywną analizę starzenia komórkowego jako mechanistycznego czynnika przyczyniającego się do rozwoju szlaków chorobowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe określanie markerów starzenia z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Zwiększa pewność prognostyczną w ramach wstępnej selekcji portfolio w badaniach nad zaburzeniami metabolicznymi i procesami starzenia.
Przesiew i opracowanie testu
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych, ilościowych testów do wykrywania starzenia w heterogenicznych populacjach komórek.
- Ułatwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki zastosowaniu kontroli o dopasowanym pH oraz multipleksowaniu.
- Pozwala na wiarygodną ocenę wpływu związków na markery starzenia w pierwotnych komórkach ludzkich.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wykrywania biomarkerów starzenia do systemów tkanek ludzkich istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w modelach chorób metabolicznych.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe dla decyzji dotyczących dalszego rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w złożonych kontekstach tkankowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając solidną, ilościową analizę starzenia w pierwotnych ludzkich komórkach SVF, co wspiera zarówno walidację celów, jak i strategie w zakresie biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkryć: Obiektywnie ilościowo określa markery starzenia się komórek, aby wyjaśnić udział szlaków sygnałowych i zredukować niejednoznaczność mechanistyczną.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki analizy odpowiednie do przesiewania związków w systemach heterogenicznych.
- Analityka: Zapewnia rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek oraz multipleksowe odczyty do analiz porównawczych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia zgodność biomarkerów ze złożonością ludzkich tkanek w celu zachowania ciągłości badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandardizowaną, skalowalną platformę do wykrywania starzenia się komórek w ramach różnorodnych programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność w modelach chorób związanych ze starzeniem się komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia odtwarzalność, standaryzację i skalowalność testów w przepływach pracy z podstawowymi ludzkimi komórkami.
- Wartość strategiczna: Wspiera świadome podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów celujących w szlaki starzenia się komórek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii konfokalnej oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymagany jest dostęp do aparatury konfokalnej z oświetleniem odbitym oraz możliwości przeprowadzenia wielokrotnej immunocytochemii.
- Wymagana jest standaryzacja warunków analizy i kontroli między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do heterogenicznych populacji pierwotnych ludzkich komórek po odpowiedniej optymalizacji.
- Metoda zależy od rygorystycznych kontroli z dopasowanym pH w celu zapewnienia specyficzności wykrywania markerów starzenia.
![Wizualizacja i kwantyfikacja brązowych i beżowych tkanek tłuszczowych u myszy za pomocą obrazowania [18F]FDG Micro-PET/MR](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A25%253A48.878Z&w=384&q=75)