Name: Wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-05T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę wykrywania starzenia się komórek w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej przy użyciu odbitego światła w mikroskopii konfokalnej. Ta technika umożliwia ilościową, obiektywną analizę pojedynczych komórek z możliwością multipleksowego barwienia immunocytochemicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Liv Eidsmo i Keira Melican za zapewnienie dostępu do biopsji tkanek ludzkich oraz Lenie Appelsved za pomoc w przetwarzaniu próbek. To badanie było wspierane przez granty dla KLS od Szwedzkiej Rady Badań Naukowych (2022-01236), Strategicznego Programu Badań dla Diabetu w Instytucie Karolinska (C5471162), Fundacji Novo Nordisk (C5475033), Vallee Foundation Scholar Award (C5471234), Mark Foundation Aspire Grant (C5477023), Szwedzkiego Towarzystwa Przeciwnowotworowego (22 2420), Strategicznego Programu Badań dla Komórek Macierzystych i Regeneracji w Instytucie Karolinska (C5472022) oraz Fundacji Knuta i Alicji Wallenberga (2020.0118; 2023.0536).

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z postanowieniami Deklaracji Helsińskiej. Badanie zostało zatwierdzone przez regionalny komitet etyczny w Sztokholmie, DNR 2012/50-31.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Użyj komórek frakcji stromalno-naczyniowej (SVF) izolowanych z ludzkiego tkanki tłuszczowej przez trawienie kolagenazą. 
	​UWAGA: Wydajność komórek różni się w zależności od wielkości bioptatu i składu tkanki; jednak zwykle uzyskuje się około 1,0 × 106 komórek SVF na 10 g tkanki tłuszczowej.</li>
</ol>
2. Barwienie X-gal i przygotowanie preparatów
<ol>
	<li>Ukształtuj komórki w 1 ml 2% paraformaldehydu (PFA) w 1,5 ml mikrocentryfugowym probówce przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT) na rockerze.</li>
	<li>Centryfuguj przez 10 min przy 600 × g i usuń nadstan.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do barwienia X-gal używając zestawu do barwienia senescencyjnej β-Galaktozydazy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Podziel roztwór barwiący na 3 probówki (po 1 ml) i wyreguluj pH na 5, 6 i 8 z użyciem 1 M HCl i 1 M NaOH. Zmierzyć pH za pomocą skalibrowanego miernika pH.</li>
	<li>Dodaj roztwór X-gal do 0,5 × 106 komórek na warunki i inkubuj przez 24 h w 37 °C bez CO2.</li>
	<li>Centryfuguj przez 10 min przy 600 × g i usuń nadstan.</li>
	<li>Umyj komórki z PBS (pH 7), centryfuguj przez 10 min przy 600 × g i usuń nadstan.</li>
	<li>Przygotuj roztwór przeciwciała pierwotnego (CD31 [1:200] lub kontrola IgG [1:333]) w 5% normalnym surowicy osłabionej osła (NDS). Inkubuj komórki przez noc w 4 °C.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy w PBST (0,1%) przez 10 min w temperaturze pokojowej na rockerze.</li>
	<li>Przygotuj roztwór przeciwciała wtórnego (anty-mysie Alexa Fluor 555 [1:500]) i lektynę z zarodka pszenicy (WGA [1:200]) w 5% NDS. Inkubuj przez 1 h w temperaturze pokojowej na rockerze.</li>
	<li>Centryfuguj przez 10 min przy 600 × g i usuń roztwór barwienia przeciwciała wtórnego.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy w PBST (0,1%) przez 10 min na rockerze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Centryfuguj przez 10 min przy 600 × g i usuń nadstan.</li>
	<li>Znów zawieś komórki w antyfade mountant.</li>
	<li>Wypij zawiesinę komórek na szkielety mikroskopowe.</li>
	<li>Pozwól, aby środek montażowy wyschnął przez noc w temperaturze pokojowej, aby unieruchomić komórki.</li>
	<li>Dodaj 100 μL 100% glicerolu, nałóż szkielet i uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
</ol>
3. Mikroskopia
UWAGA: Obrazuj komórki używając mikroskopu konfokalnego skonfigurowanego do wykrywania światła odbitego. Sygnał światła odbitego powinien być zbierany na długości fali wzbudzenia lub w pobliżu ją za pomocą podziałacza wiązki lub konfiguracji lusterka dychoicznego dostarczonego przez producenta. Użyj obiektywu 30× z olejem krzemianowym (apertura numeryczna 1.05) dla wszystkich eksperymentów.
<ol>
	<li>Wybierz ustawienie podziałacza T90/R10 w oprogramowaniu mikroskopu.</li>
	<li>Użyj wzbudzenia 633 nm i zbieraj odbite światło między 635–645 nm.</li>
	<li>Zbieraj sygnał Hoechst używając wzbudzenia 405 nm.</li>
	<li>Zbieraj sygnał WGA używając wzbudzenia 488 nm.</li>
	<li>Zbieraj sygnał CD31 używając wzbudzenia 555 nm.</li>
	<li>Ustaw wielkość skoku Z na optymalną dla systemu (0,74 μm) i zdefiniuj stos Z oparty na sygnale błony, aby uchwycić pełną objętość komórek.</li>
	<li>Zbieraj obrazy używając identycznych ustawień zbioru dla wszystkich próbek. Zapisz pliki w natywnym formacie mikroskopu (np. .oir) bez kompresji.</li>
</ol>
4. Analiza obrazów
UWAGA: Analizuj obrazy używając ImageJ i CellProfiler.
<ol>
	<li>Rozdziel kanały w ImageJ aby stworzyć stos Z dla każdego kanału (405, 488, 555, 633).</li>
	<li>Generuj projekcje sumarycznej intensywności używając funkcji Z Project i eksportuj jako pliki TIFF 16-bitowe. </li>
	<li>Zaimportuj obrazy do CellProfiler (wersja 4.2.8) dla zautomatyzowanego segmentowania komórek i ilościowego określania intensywności światła odbitego na komórkę (Dodatkowa Figura 1 i Dodatkowa Figura 2).</li>
	<li>Eksportuj pomiary intensywności do arkusza kalkulacyjnego dla dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Oceny SA-β-gal
<ol>
	<li>Zdefiniuj próg dla SA-β-gal pozytywności jako średnią intensywność światła odbitego warunku pH 8 plus trzy odchylenia standardowe.</li>
	<li>Klasyfikuj komórki w

<ol><li>Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+human+fibroblasts+resist+programmed+cell+death%2C+and+failure+to+suppress+bcl2+is+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved.</a> Cancer Res. 55 (10), 2284-2292 (1995).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nat Commun. 7 (1), 11190(2016).</li>
<li>Jun, J. -I., Lau, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matricellular+protein+CCN1+induces+fibroblast+senescence+and+restricts+fibrosis+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing.</a> Nat Cell Biol. 12 (7), 676-685 (2010).</li>
<li>Krizhanovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+of+activated+stellate+cells+limits+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis.</a> Cell. 134 (4), 657-667 (2008).</li>
<li>Storer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+is+a+developmental+mechanism+that+contributes+to+embryonic+growth+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning.</a> Cell. 155 (5), 1119-1130 (2013).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li>
<li>Eggert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functions+of+senescence-associated+immune+responses+in+liver+tumor+surveillance+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct functions of senescence-associated immune responses in liver tumor surveillance and tumor progression.</a> Cancer Cell. 30 (4), 533-547 (2016).</li>
<li>Feldser, D. M., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+telomeres+limit+tumor+progression+in+vivo+by+inducing+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence.</a> Cancer Cell. 11 (5), 461-469 (2007).</li>
<li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+and+tumour+clearance+is+triggered+by+p53+restoration+in+murine+liver+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas.</a> Nature. 445 (7128), 656-660 (2007).</li>
<li>Acosta, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+secretory+program+orchestrated+by+the+inflammasome+controls+paracrine+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence.</a> Nat Cell Biol. 15 (8), 978-990 (2013).</li>
<li>Coppé, J. -P., Desprez, P. -Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol+Mech+Dis%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol Mech Dis. 5 (1), 99-118 (2010).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> eLife. 4 (1), e12997(2015).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senolytics+improve+physical+function+and+increase+lifespan+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age.</a> Nat Med. 24 (8), 1246-1256 (2018).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBP1+loss+disrupts+liver+metabolism+and+promotes+tumorigenesis+through+a+hepatic+stellate+cell+senescence+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome.</a> Nat Cell Biol. 22 (6), 728-739 (2020).</li>
<li>Yoshimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-induced+gut+microbial+metabolite+promotes+liver+cancer+through+senescence+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome.</a> Nature. 499 (7456), 97-101 (2013).</li>
<li>Aravinthan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+senescence+predicts+progression+in+non-alcohol-related+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease.</a> J Hepatol. 58 (3), 549-556 (2013).</li>
<li>Baboota, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP4+and+Gremlin+1+regulate+hepatic+cell+senescence+during+clinical+progression+of+NAFLD%2FNASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH.</a> Nat Metab. 4 (8), 1007-1021 (2022).</li>
<li>Chen, Y. -W., Harris, R. A., Hatahet, Z., Chou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+XP-V+gene+causes+adipose+tissue+senescence+and+metabolic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ablation of XP-V gene causes adipose tissue senescence and metabolic abnormalities.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), E4556-E4564 (2015).</li>
<li>Gustafson, B., Nerstedt, A., Spinelli, R., Beguinot, F., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%2C+independent+of+obesity+and+age%2C+is+characterized+by+senescent+and+dysfunctional+mature+human+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes, independent of obesity and age, is characterized by senescent and dysfunctional mature human adipose cells.</a> Diabetes. 71 (11), 2372-2383 (2022).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+hyperinsulinemia+drive+adipocytes+to+activate+a+cell+cycle+program+and+senesce%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Obesity and hyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce.</a> Nat Med. 27 (11), 1941-1953 (2021).</li>
<li>Minamino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+adipose+tissue+p53+in+the+regulation+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance.</a> Nat Med. 15 (9), 1082-1087 (2009).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+senolysis+with+single-cell+resolution+delays+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Aging%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging.</a> Nat Aging. 3 (3), 297-312 (2023).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Horwitz, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+cytochemical+demonstration+of+enzyme+activity%3AI.+some+substituted+3-indolyl-%CE%B2-D-glycopyranosides1a%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity:I. some substituted 3-indolyl-β-D-glycopyranosides1a.</a> J Med Chem. 7 (5), 574-575 (1964).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+engineering+development+of+%CE%B2-galactosidase-activatable+fluorogenic+probes+for+precise+senescence+tracking+in+cells%2C+tissues+and+a+mouse+model+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular engineering development of β-galactosidase-activatable fluorogenic probes for precise senescence tracking in cells, tissues and a mouse model of psoriasis.</a> Sens Actuators B Chem. 444 (1), 138406(2025).</li>
<li>Dedic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+detection+using+reflected+light%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence detection using reflected light.</a> Aging Cell. 23 (1), e14295(2024).</li>
<li>Alcorta, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16+%28INK4a%29+in+replicative+senescence+of+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13742-13747 (1996).</li>
<li>Hara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p16CDKN2+expression+and+its+implications+for+cell+immortalization+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence.</a> Mol Cell Biol. 16 (3), 859-867 (1996).</li>
<li>Lin, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+senescence+involving+p53+and+p16+is+activated+in+response+to+constitutive+MEK%2FMAPK+mitogenic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling.</a> Genes Dev. 12 (19), 3008-3019 (1998).</li>
<li>Okamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+and+altered+expression+of+p16INK4+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (23), 11045-11049 (1994).</li>
<li>Serrano, M., Hannon, G. J., Beach, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+regulatory+motif+in+cell-cycle+control+causing+specific+inhibition+of+cyclin+D%2FCDK4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.</a> Nature. 366 (6456), 704-707 (1993).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wong, H., Riabowol, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+CDK-inhibitor+gene+expression+in+aging+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Differential CDK-inhibitor gene expression in aging human diploid fibroblasts.</a> Exp Gerontol. 31 (3), 311-325 (1996).</li>
<li>Gustafson, B., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+subcutaneous+adipogenesis+in+human+hypertrophic+obesity+is+linked+to+senescent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced subcutaneous adipogenesis in human hypertrophic obesity is linked to senescent precursor cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 2757(2019).</li>
<li>Barinda, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progeria+induces+adipose+tissue+senescence+and+impairs+insulin+sensitivity+through+senescence+associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype.</a> Nat Commun. 11 (1), 481(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Senescence-associated β-galaktozydaza jest jednym z najczęściej stosowanych markerów do identyfikacji senescencyjnych komórek; jednak tradycyjne metody wykrywania w świetle jasnym są ograniczone niską czułością i dużym stopniem subiektywności. Obrazowanie światłem odbitym komórek SVF barwionych X-gal zapewnia bardziej wrażliwe i powtarzalne podejście do pomiaru aktywności SA-β-gal na poziomie pojedynczych komórek, zachowując jednocześnie kompatybilność z barwieniem przeciwciałami fluorescencyjnymi. Poprzez optymalizację tej metody dla SVF, aktywność SA-β-gal można wykrywać wraz z markerami specyficznymi dla komórek, takimi jak CD31, umożliwiając analizę heterogenicznych pierwotnych populacji komórek bez konieczności sortowania komórek.
Kilka parametrów technicznych jest krytycznych dla niezawodnej implementacji. Dokładna kalibracja pH roztworu barwnika X-gal jest niezbędna, ponieważ małe odchylenia mogą zmieniać aktywność enzymatyczną i wpływać na wykrywanie sygnału. Miernik pH powinien być skalibrowany bezpośrednio przed użyciem za pomocą standardowych buforów (np. pH 4,0 i pH 7,0), a pH roztworu barwnika powinno być zweryfikowane po przygotowaniu. Ponadto, akwizycja Z-stack musi uchwycić pełną objętość komórki, ponieważ niekompletne pokrycie prowadzi do niedoceniania intensywności światła odbitego. Parametry obrazu, w tym moc lasera i wzmocnienie detektora, powinny być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować sygnał bez nasycenia i zachować spójność między próbkami.
W porównaniu z alternatywnymi testami senescencji, obrazowanie światłem odbitym oferuje kilka zalet. Wykrywanie SA-β-gal w świetle jasnym polega na wizualnym identyfikowaniu osadu i dlatego ma ograniczoną czułość i nie jest łatwo kompatybilne z analizą wielokrotną. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie światłem odbitym wykrywa gęstość optyczną osadu X-gal, zachowując pH-zależną definicję enzymatyczną SA-β-gal. Umożliwia to jednoczesne wykrywanie aktywności SA-β-gal obok markerów opartych na fluorescencji, pozwalając na ocenę senescencji za pomocą wielu cech w pojedynczych komórkach.
Mimo tych zalet, metoda ma ograniczenia. Obrazowanie światłem odbitym wykrywa gęstość optyczną osadu X-gal, ale nie może jednoznacznie odróżnić tego sygnału od innych gęstych struktur wewnątrzkomórkowych, co sprawia, że warunki kontrolowane pH są niezbędne. Warunek pH 8 zapewnia bazę dla tła światła odbitego i wspiera rozróżnienie między sygnałami specyficznymi i niespecyficznymi. Podejście to wymaga również mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi możliwościami wykrywania światła odbitego, które mogą nie być dostępne we wszystkich systemach. Ponadto właściwości powierzchni obrazu mogą wpływać na jakość sygnału: talerze z tworzywa sztucznego zwiększają tło z powodu odbicia i zmniejszają kontrast, podczas gdy powierzchnie szklane zapewniają bardziej niezawodne wykrywanie.
Ta metoda opiera się na pracy Dedic i wsp., którzy ustanowili obrazowanie światłem odbitym dla wykrywania SA-β-gal w dojrzałych adipocytech, i rozszerza podejście na szerszy zakres typów komórek26. Zastosowanie do świeżo izolowanej SVF pokazuje, że wykrywanie światłem odbitym osadu X-gal jest kompatybilne z różnorodnymi pierwotnymi populacjami komórek ludzkich. Możliwość łączenia wykrywania SA-β-gal z markerami linii takimi jak CD31 umożliwia również analizę określonych subpopulacji w heterogenicznych tkankach.
Chociaż oczekuje się zmienności między donorami w pierwotnych próbkach ludzkich, celem niniejszego badania jest ustalenie technicznej implementacji metody, a nie charakterystyka zmienności biologicznej. Przyszłe zastosowania na wielu próbkach biologicznych lub warunkach eksperymentalnych powinny uwzględniać odpowiednie analizy statystyczne. Ponadto, walidacja w uznanych modelach indukcji senescencji i integracja z ortogonalnymi markerami senescencji dalece wyraźnie określi interpretację aktywności SA-β-gal w złożonych populacjach komórek.

Starzenie komórkowe jest wieloaspektową reakcją, która może powstać w wyniku wielu rodzajów stresu, w tym uszkodzenia DNA, zużycia telomerów i aktywacji onkogenów. Prowadzi do stabilnego zatrzymania cyklu komórkowego wraz ze zwiększoną odpornością na apoptozę, napędzane częściowo przez indukcję białek przeciw apoptotycznych1,2. Starzenie się zostało powiązane z lepszym przeżyciem komórek w kontekstach, gdzie zachowanie integralności tkanki jest istotne, takie jak naprawa i utrzymanie3,4. Poza swoją rolą w homeostazie tkankowej, starzenie się przyczynia się również do normalnego rozwoju poprzez kształtowanie wzorców embrionalnych5,6oraz jako bariera dla powstawania guzów poprzez promowanie usuwania uszkodzonych lub potencjalnie złośliwych komórek7,8,9. Chociaż starzenie się może pełnić korzystne funkcje, wiele badań podkreśla kontrastujący aspekt, w którym komórki starsze nabywaja prozapalny profil sekrecyjny, który może zakłócać lokalny metabolizm, uszkodzić otaczającą tkankę, a nawet wspierać progresję nowotworową10,11,12,13.
Starzenie się zostało wykryte w różnorodnych typach komórek w wielu tkankach i często wiąże się ze starzeniem, chorobą, dysfunkcją tkanki lub rakiem. W wątrobie starzenie się komórek gwiaździstych wątroby wykazało, że promuje progresję nowotworową poprzez zmianę homeostazy metabolicznej poprzez wydzielane czynniki14,15. Badania dotyczące hepatocytów16 lub pełnych biopsji wątroby17 wskazują, że starzenie się w tych komórkach może przyczyniać się do przewlekłych chorób metabolicznych, takich jak metaboliczna choroba wątroby skojarzona ze stłuszczeniem i stłuszczeniem wątroby skojarzone z dysfunkcją. Ponadto, związek między cukrzycą typu 2 a starzeniem się zyskał znaczną uwagę w ciągu ostatniej dekady, ze wskazaniami łączącymi starzenie się z powikłaniami związanymi z cukrzycą w komórkach β trzustki, hepatocytach16 i adipocytach18,19,20,21. Te odkrycia podkreślają znaczenie dokładnego identyfikowania starzejących się komórek w tkankach metabolicznych, gdzie ich akumulacja i heterogeniczność przyczyniają się do progresji choroby i docelowego leczenia22.
Zmiany w sygnalizacji i ekspresji białek związane z starzeniem są często specyficzne dla komórek i tkanek; jednak kilka cech jest ogólnie charakterystycznych dla starzejących się komórek. Jednym z najczęściej stosowanych markerów jest zwiększona aktywność enzymatyczna β-galaktozydazy w pH 6,0, nazywana starzeniową β-galaktozydazą (SA-β-gal)23. β-galaktozydaza jest hydrolazą lizosomalną obecną we wszystkich komórkach i jest normalnie aktywna w kwaśnym pH (~4,5–5,0), gdzie przyczynia się do degradacji glikozylowanych substratów. Definiującą cechą SA-β-gal jest utrzymanie aktywności β-galaktozydazy w nieoptymalnych warunkach pH. W klasycznym postępowaniu komórki są inkubowane z syntetycznym substratem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktozydydem (X-gal) w pH 6,0, gdzie aktywność enzymatyczna jest zmniejszona w większości komórek, ale pozostaje wykrywalna w komórkach starzejących się. Prowadzi to do powstania nierozpuszczalnego niebieskiego osadu, który można uwidocznić mikroskopowo24.
Mimo że to badanie zostało szeroko przyjęte, wykrywanie osadu X-gal tradycyjnie polegało na mikroskopi jasnopolowej. Jasnopolowa detekcja polega na wizualnym rozpoznaniu niebieskiego osadu i dlatego ma ograniczoną czułość dla niskiego poziomu sygnałów i wczesnych stanów starzenia się. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie światłem odbitym rejestruje gęstość optyczną osadu X-gal, umożliwiając ilościowe wykrywanie w szerszym zakresie dynamicznym. Bardziej niedawno, związki fluorogeniczne zostały opracowane, aby poprawić czułość25. Jednak te podejścia zazwyczaj mierzą aktywność β-galaktozydazy w warunkach, które nie zachowują klasycznej definicji pH-zależnej SA-β-gal. W rezultacie mogą zwiększać intensywność sygnału, ale zmniejszać specyficzność dla starzenia się. Natomiast, naturalna nieprzezroczystość osadu X-gal umożliwia jego wykrywanie za pomocą konfokalnego obrazowania światłem odbitym, zapewniając bardziej czuły i ilościowy odczyt, zachowując oryginalną enzymatyczną definicję SA-β-gal26.
Przez lata, zidentyfikowano dodatkowe cechy charakterystyczne dla starzenia się, w tym zwiększone występowanie inhibitorów kinazy zależnej od cyklin P16 i P21, a także czynnika transkrypcyjnego P53,

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>BioSphere</td><td>72.706.200</td><td>Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC</td></tr><tr><td>5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td>Eppendorf&nbsp;tubes&nbsp;5.0&nbsp;mL microtube</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>4680</td><td>Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom</td></tr><tr><td>CD31 primary antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab9498</td><td>Anti-CD31 antibody clone JC/70A</td></tr><tr><td>Confocal microscope with reflected light capabilities</td><td>Evident</td><td>FV-4000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Epredia</td><td>BB02400500A113MNZO</td><td>Coverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td></tr><tr><td>Fixation buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00496.5000</td><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500mL</td><td>Hydrochloric acid (37%)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Stuart</td><td>S130H</td><td>Hybridization oven/shaker</td></tr><tr><td>Microscopy slides</td><td>Avantor VWR</td><td>631-1560</td><td>Single-frosted slides, coloured ends</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Invitrogen</td><td>P36984</td><td>ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm</td></tr><tr><td>Mouse IgG1&nbsp;isotype control</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB002</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>Sodium hydroxide &ge; 98%</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>MeterLab</td><td>R21M002&nbsp;</td><td>PHM210 standard pH meter&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette tips (1000 &micro;L)</td><td>Biosphere</td><td>70.1186.210</td><td>1250&micro;L filtered pipette tips</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 &micro;L)</td><td>Corning</td><td>4823</td><td>200&micro;L filtered pipette tips</td></tr><tr><td>SABG Kit</td><td>Cell signaling</td><td>9860S</td><td>Senescence beta-galactosidase staining kit</td></tr><tr><td>Secondary antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max 553/568 nm</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>10419000</td><td>Pure, Fisher chemical</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Rowe Scientific</td><td>SWB20D</td><td>Standard water bath</td></tr><tr><td>WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td>Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm</td></tr></tbody></table>

wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej

Senescence Detection Using Reflected Light in Adipose Stromal Vascular Fraction

Senescencja komórkowa to stan indukowany stresem, charakteryzujący się trwałym zatrzymaniem cyklu komórkowego i rozwojem charakterystycznego profilu sekrecyjnego, który wpływa na funkcjonowanie tkanek i przyczynia się do starzenia i chorób przemiany materii. Aktywność senescencji-związanej β-galaktozydazy (SA-β-gal) jest szeroko stosowana jako marker senescencyjnych komórek; jednak konwencjonalne testy SA-β-gal często polegają na subiektywnej ocenie wizualnej i dostarczają ograniczone informacje ilościowe. Ograniczenia te są szczególnie widoczne w pierwotnych populacjach ludzkich komórek, takich jak frakcja stromalno-naczyniowa (SVF) pochodząca z tkanki tłuszczowej, która zawiera heterogeniczną mieszankę preadipocytów, komórek odpornościowych i komórek śródbłonka. Przedstawiamy tu zoptymalizowane podejście do konfokalnej mikroskopii światła odbitego, umożliwiające wysokiej rozdzielczości, ilościowe wykrywanie aktywności SA-β-gal w ludzkich komórkach SVF. Protokół ten umożliwia obiektywną analizę pojedynczych komórek pod kątem aktywności SA-β-gal, pozwala na jednoczesne wykonywanie immunocytochemii dla wielokrotnego wykrywania dodatkowych markerów senescencji lub linii komórkowych oraz zawiera kontrole dopasowane do pH. Łącząc te cechy, metoda ta zapewnia wrażliwe, powtarzalne i ilościowe podejście do badania senescencji komórkowej w heterogenicznych pierwotnych populacjach ludzkich komórek. Oferuje lepszą alternatywę dla konwencjonalnego barwienia SA-β-gal.

Odzwierciedlone światło SA-β-gal barwienie ludzkich komórek SVF wytworzyło jasne i powtarzalne wzorce w trzech warunkach kontrolowanych pH. Barwienie CD31 zostało włączone w celu zidentyfikowania komórek śródbłonka w SVF, co pozwoliło na odróżnienie tych komórek od innych populacji. Chociaż obecne było tylko niewiele komórek CD31-dodatnich, marker potwierdził obecność komórek śródbłonka i wykazał zgodność metody z heterogenicznymi próbkami pierwotnymi.
Warunek pH 5 wygenerował silny sygnał w większości komórek, zgodnie z wysoką endogenną aktywnością beta galaktozydazy w kwaśnym pH (Rysunek 1Aa–Ac). Przy pH 6, warunku stosowanym do oceny aktywności SA-β-gal, intensywność barwienia była niższa w porównaniu z pH 5, a tylko podzbiór komórek wykazywał sygnał powyżej poziomu tła (Rysunek 1Ba–Bc). Ta zmiana zarówno w intensywności sygnału, jak i częstotliwości jest zgodna z oczekiwaną zależnością pH od badania i umożliwia identyfikację komórek z zachowaną aktywnością SA-β-galaktozydazy w warunkach suboptymalnych. Warunek pH 8 wytworzył minimalny sygnał odzwierciedlonego światła, przy czym większość komórek była na poziomie bliskim tłu czy nawet na jego poziomie (Rysunek 1Ca–Cc). Ten warunek został użyty do zdefiniowania progu pozytywności SA-β-gal, wskazanego czerwoną kropkowaną linią na Rysunku 1Ac,Bc,Cc.
Do analizy ilościowej próg dla aktywności SA-β-gal został zdefiniowany jako średnia intensywność odzwierciedlonego światła warunku pH 8 plus trzy odchylenia standardowe. Komórki w warunku pH 6 o wartościach intensywności przekraczających ten próg zostały sklasyfikowane jako SA-β-gal dodatnie. Takie podejście zapewnia obiektywny, oparty na danych próg, który uwzględnia sygnał tła i minimalizuje fałszywie dodatnie klasyfikacje.
Aby ocenić wrażliwość wykrywania i zgodność z immunocytochemią, porównano odzwierciedlone światło i obrazowanie światłem przeciwstawnym we wszystkich warunkach pH. Przy pH 5 (Rysunek 2Aa–Ad), odzwierciedlone światło ujawniło silny osad X-gal, podczas gdy światło przeciwstawnye wykryło tylko najbardziej widoczne osady. Przy pH 6 (Rysunek 2Ba–Bd), odzwierciedlone światło zidentyfikowało komórki SA-β-gal dodatnie, które nie były niezawodnie wykrywalne przez światło przeciwstawnye, gdzie sygnał wydawał się słaby lub rozproszony. Przy pH 8 (Rysunek 2Ca–Cd), odzwierciedlone światło wykryło minimalny sygnał, zgodny z niską aktywnością enzymatyczną, podczas gdy światło przeciwstawnye nie ujawniło wykrywalnego osadu. Te obserwacje wskazują, że odzwierciedlone światło obrazowanie zapewnia lepsze wykrywanie osadu X-gal, szczególnie na średnich i niskich poziomach aktywności.
Badanie SA-β-gal odzwierciedlonego światła zostało również przeprowadzone na 96-dołkowej płytce (Dodatkowy Rysunek 3). Ta konfiguracja skutkowała zwiększonym sygnałem tła z powodu odbicia od powierzchni plastikowej, co zmniejszyło kontrast między komórkami dodatnimi a ujemnymi. Niedoskonałości powierzchni, takie jak rysy, dalsze zwiększały odbicie tła (Dodatkowy Rysunek 3, czarne strzałki). W rezultacie, ilościowa analiza była mniej wiarygodna w porównaniu z obrazowaniem na szklanych pokrywach. Jeśli format płytki jest wymagany, płytki ze szklanym dnem są zalecane dla optymalnego wykrywania sygnału.
Wszystkie te wyniki pokazują wyraźne rozdzielenie między silnie dodatnim warunkiem pH 5, średnim sygnałem przy pH 6 i minimalnym tłem przy pH 8. Ten wzorzec jest zgodny z oczekiwanym zachowaniem badania i wspiera użycie odzwierciedlonego światła obrazowania dla wykrywania aktywności SA-β-gal w heterogenicznych populacjach komórek pierwotnych.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70588/70588fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: pH-zależne odzwierciedlone światło SA-β-gal wykrywanie w komórkach SVF. 
WGA (Aa, Ba, Ca) i odzwierciedlone światło obrazowanie (Ab, Bb, Cb) wykrywają osad X-gal w warunkach pH 5, 6 i 8. Sygnał jest najsilniejszy przy pH 5, zmniejsza się przy pH 6 i jest minimalny przy pH 8. Kwantyfikacja intensywności odzwierciedlonego światła (Ac, Bc, Cc) pokazuje rozkład aktywności β-galaktozydazy w każdym warunku. Każdy punkt reprezentuje pojedynczą komórkę, a czerwon

Ten protokół przedstawia mikroskopie konfokalną światła odbitego do obiektywnej, pojedynczej komórkowej detekcji aktywności senescencji związanej z beta-galaktozydazą (SA-β-gal) w frakcji naczyniowej stromy izolowanych z ludzkiego tkanki tłuszczowej. Metoda jest kompatybilna z immunocytochemią, zawiera kontrole pH do oceny ilościowej i dodatkowo zapewnia bardziej wrażliwą i mniej subiektywną alternatywę dla konwencjonalnego barwienia SA-β-gal.

Wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej

Cellular senescence is a stress-induced state characterized by permanent cell-cycle arrest and the development of a distinctive secretory profile that ...

Badamy starzenie się adipocytów na różne złożenia tkanki tłuszczowej i warunki metaboliczne, takie jak otyłość i hiperinsulinemia. Tradycyjne testy SABG oparte na jasnym polu nie pozwalają naprawdę na multiplexing i są bardzo subiektywne. Nasz nowy protokół jest mniej subiektywny i pozwala na multiplexing.Na początek pobieraj probówkę zawierającą ludzką tkankę tłuszczową. Zhomogenizuj 10 gramów tkanki tłuszczowej i dodaj do probówki zawierającej 0,05% enzymu kolagenowego typu jeden, aby uzyskać około milion komórek frakcji śródnaczyniowej, lub SVF. Włóż po 500 000 komórek do każdej mikrocentrfużującej probówki o pojemności 1,5 ml.Dodaj jeden mililitr 2% paraformaldehydu do probówki w celu fiksacji komórek. Następnie inkubuje się na wahadle w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Wiruje się przez 10 minut przy 600G i usuwa się nadstan. Przygotuj roztwór barwienia X-Gal za pomocą zestawu do barwienia beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się zgodnie z instrukcjami producenta. Włóż jeden mililitr roztworu barwnikowego do trzech świeżych probówek. I wyreguluj pH do pięciu, sześciu i ośmiu za pomocą jednomolarnego kwasu solnego lub jednomolarnego roztworu wodorotlenku sodu.Użyj kalibrowanego miernika pH, aby zweryfikować pH. Dodaj dostosowany pH X-Gal do każdej z etykietowanych probówek zawierających 500 000 komórek. Inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny bez dwutlenku węgla.Wiruje się komórki przez 10 minut przy 600G. Po usunięciu nadstanu, przepłukuj komórki za pomocą PBS. I wiruje się ponownie przez 10 minut przy 600G.Po usunięciu nadstanu, aby zidentyfikować komórki śródbłonkowe w obrębie heterogenicznej SVF, inkubowano komórki z komórkami śródbłonkowymi oznaczonymi antyciałami pierwotnymi CD31 lub kontrolnym IgG przez całą noc w czterech stopniach Celsjusza. Przepłukuj komórki trzy razy z 0,1% PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wahadle, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwotne. I wiruje się przez 10 minut przy 600G.Po odrzuceniu nadstanu, inkubowano komórki z przeciwciałami wtórnymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wahadle. Wiruje się przez 10 minut przy 600G, aby usunąć roztwór barwnika przeciwciała wtórnego. Przepłukuj komórki trzy razy za pomocą PBST, a następnie wiruje się zgodnie z wcześniejszymi wskazówkami.Ponownie zawiesz komórki w środku przeciwsłaniającym. Wypij zawiesinę komórek na szkiełka mikroskopowe i wylecz przez noc w temperaturze pokojowej, aby unieruchomić komórki. Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów 100% glicerolu.Umieść pokrywkę na wierzchu i uszczelnij go lakierem do paznokci. Umieść przygotowane szkiełko na stole mikroskopowego konfokalnego. W interfejsie oprogramowania mikroskopu wybierz opcję Ścieżka świetlna i wyreguluj ustawienie dzielacza wiązki do T90R10.Następnie zweryfikuj wartości długości fali odcięcia dla wtórnych luster dwóch kierunków, lub SDM, w ustawieniach Lustro. W menu Detektora kliknij opcję Farba i Wybór Detektora, aby przypisać kanały i długości fal wzbudzenia. Następnie ustaw wartości procentowe intensywności mocy lasera dla każdego konkretnego lasera w zakresie od 10 do 15% W menu Seria, w sekcji LSM, przełącz opcję Z na Wł.Ustaw wielkość kroku Z na optymalną wartość systemową 0,74 mikrometra.Następnie, pod menu Z Sekcja, wprowadź wartość dla pola wejściowego start i zdefiniuj stos Z na podstawie sygnału membrany, aby uchwycić pełną objętość komórki. Pod panelem Nabywania, wprowadź nazwę pliku i lokalizację zapisu pliku w polu wejściowym LSM. I kliknij na LSM Start, aby rozpocząć akwizycję obrazu.I zapisz pliki w natywnym formacie mikroskopu oir. Po nabyciu użyj strzałek nawigacyjnych Z, aby zweryfikować sygnał i dystrybucję ogniskowania różnych barwników w całym stosie Z. Prześlij zapisany plik oir do Image J. W oknie wyskakującym Opcje importu Bio-Formats kliknij OK.Kliknij na menu Obraz, aby otworzyć plik. I z opcji rozwijanych, wybierz Kolor, a następnie opcję Podziel kanały, aby otworzyć różne kanały jako oddzielne okna. Następnie dostosuj kontrast jasności i zoptymalizuj wartości LUT za pomocą opcji Dostosuj w menu Obraz dla lepszej wizualizacji obrazu.Użyj paska przewijania osi Z na dole ramki, aby przejść przez sekcje optyczne i zweryfikować cechy komórkowe w całym stosie. W menu Obraz wybierz Stos. Następnie wybierz funkcję Z Project, aby wygenerować sumujące projekcje intensywności trójwymiarowego obrazu konfokalnego.W oknie dialogowym Z Projekcja, zdefiniuj zakresy początkowych i końcowych krojów. Wybierz typ projekcji i kliknij OK, aby uzyskać końcowy obraz składowy 2D. Następnie przejdź do menu Obraz.Wybierz opcję Typ, aby dostosować typ obrazu do 16-bitowego. Następnie zapisz i eksportuj obrazy jako 16-bitowe pliki TIF. Zaimportuj zapisane obrazy do CellProfiler wersja 4.2.8 do zautomatyzowanej segmentacji komórek, ilościowego pomiaru intensywności odbijanego światła dla każdej kom

senescence-detection-using-reflected-light-adipose-stromal-vascular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tradycyjne metody oceny różnicowania adipogennego są tanie i łatwe w użyciu, ale nie są specyficzne dla zmian w ekspresji genów. Opracowaliśmy test do ilościowego określania różnicowania komórek mezenchymalnych w dojrzałe adipocyty przy użyciu markera specyficznego dla linii. Test ten ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i medycynie klinicznej.

Wizualizacja i kwantyfikacja potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych za pomocą markera specyficznego dla linii

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Przedmiotem niniejszego badania jest zademonstrowanie techniki barwienia immunologicznego i wizualizacji jako idealnej metody do obrazowania 3D architektury tkanki tłuszczowej i komponentu komórkowego.

Wizualizacja struktury 3D białej tkanki tłuszczowej za pomocą barwienia całościowego

Tworzenie nowych naczyń krwionośnych i unerwienie współczulne odgrywają kluczową rolę w przebudowie tkanki tłuszczowej. Pozostają jednak kwestie techniczne związane z wizualizacją i ilościowym pomiarem tkanki tłuszczowej. Poniżej przedstawiamy protokół, który pozwala skutecznie oznaczyć i ilościowo porównać gęstości naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w różnych tkankach tłuszczowych.

Współbarwienie naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w tkance tłuszczowej

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj metodę wykrywania starzenia się komórek w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej przy użyciu odbitego światła w mikroskopii konfokalnej. Ta technika umożliwia ilościową, obiektywną analizę pojedynczych komórek z możliwością multipleksowego barwienia immunocytochemicznego.

Wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej

Przeglądaj więcej filmów