Name: Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę znakowania metabolicznego nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus laevis. Protokół ten umożliwia precyzyjną analizę aktywacji genomu zygoidalnego z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium Matthew Gooda na Uniwersytecie Pensylwanii za zapewnienie szkoleń. Prace te były częściowo wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

Prace ze zwierzętami opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej. Bezpieczeństwo laboratoryjne i utylizacja odpadów powinny być zgodne z przepisami instytucjonalnymi.
1. Przygotowanie odczynników i buforów
<ol>
	<li>20x MMR (Marc's Modified Ringer) roztwór: Wymieszaj 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 oraz 40 mM CaCl2. Ustaw pH do 7,8 z NaOH. Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>3% Ficoll (w/v)/0,5x MMR: Powoli dodaj 1,5 g Ficoll 400 do 50 mL 0,5x MMR, delikatnie mieszając magnetycznym batonem, aż Ficoll całkowicie się rozpuści. Autoklawuj i utrzymuj w temperaturze 4 °C do użycia.</li>
	<li>Roztwór 5-etynyloworydyny (5-EU): Aby przygotować 50 mM roztworu bulwarowego, należy dodać 372,8 μL buforu (należy zauważyć, że do fiolki 5 mg można użyć dowolnego buforu kompatybilnego z mikroiniekcją, np. 1x łyżeczki litrowej, pH 7,6). Dobrze wymieszaj i zrób 2 μL aliquoty. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja 5-EU do zarodków jednokomórkowych
<ol>
	<li>Aby uzyskać zarodki Xenopus , należy stosować standardowe protokoły przeprowadzania zapłodnienia in vitro (IVF) (np. zob. Sive i in., 2007)16. Zarodek powinien mieć 0,1x MMR, gotowy do użycia.</li>
	<li>Dodaj 1 mL 3% Ficoll/0,5x MMR do komory mikrowtryskowej wykonanej ze standardowego szkła szkła (25 mm x 75 mm). Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść 20 (lub więcej, jeśli trzeba) zarodków do środka komory mikroiniekcji.</li>
	<li>Użyj cienkiej pęsety, aby ostrożnie wyciąć bardzo cienki koniec szklanej igły i przybij ją pionowo (z końcówką skierowaną w dół) do modelingowej gliny na ścianie stołu. Użyj pipety P2 z końcówką mikroładowaczowej, aby dodać 0,5 μL 50 mM 5-EU z góry szklanej igły.</li>
	<li>Złóż igłę na mikromanipulatorze. Użyj pipety P10, aby dodać 10 μL oleju halowęglowego na mikrometr sceniczny i poddać go stereomikroskopowi.</li>
	<li>Aby skalibrować objętość wtrysku, najpierw użyj stopy, aby docisnąć podkładkę na podłodze połączoną z mikrowtryskiwaczem i wstrzyknąć kroplę do oleju halowęglowodorowego na mikrometrze. W zależności od wielkości kropli dostosuj ciśnienie i czas wstrzykiwania w mikrowtryskiwacz, aby określić objętość wtrysku na poziomie 10 nL, czyli 0,27 mm średnicy na mikrometrze.</li>
	<li>Użyj pęsety w jednej ręce, aby utrzymać zarodek, drugiej ręki mikromanipulatora, a w stadium 1-komórkowym wstrzyknij 10 nL 50 mM EU do zarodków. Końcowe stężenie 5-EU w zarodku wynosi ~0,5 mM.</li>
	<li>Po mikrowstrzyknięciu użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść zarodki z komory do iniekcji do nowej szklanej misy zawierającej 3% Ficoll/0,5x MMR. Przechowywać wstrzyknięte zarodki w Ficoll przez ~1 godzinę.</li>
	<li>Ostrożnie usuń roztwór Ficoll i zamień medium na 0,1x MMR. Zachowaj zarodki w 0,1x MMR do dalszego użycia. Stale monitoruj rozwój zarodków i usuwaj ewentualne nieprawidłowe zarodki, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Gdy zarodki osiągną pożądane stadium rozwoju, użyj pipety plastycznej do przeniesienia 10 zarodków do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Użyj pipety P200, aby ostrożnie usunąć resztki z rurki, a następnie zarodki zamrozić w ciekłym azocie. Uwaga: Aby zapewnić stężenie i powtarzalność, pobieraj tylko zarodki prawidłowe na podstawie ich wyglądu w porównaniu do grupy kontrolnej. Usuń i wyklucz wszelkie nieprawidłowe zarodki z dalszej analizy. W razie potrzeby należy również pobrać tę samą liczbę zarodków bez mikrozastrzyków jak negatywne kontrole.</li>
	<li>Przechowuj zarodki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Całkowita ekstrakcja RNA i pomiar stężenia
UWAGA: Użyj zestawu do całkowitej ekstrakcji RNA opartego na membranie krzemionkowej do izolacji całkowitych RNA z wczesnych zarodków oraz zestawu do ilościfikacji RNA opartego na fluorescencji o wysokiej czułości w celu określenia stężeń RNA. Stosuj się do instrukcji zawartych w zestawie, a poniższe kroki są nieco zmodyfikowane względem instrukcji. Wszystkie roztwory i odczynniki używane w kolejnych etapach powinny być wolne od RNaz.
<ol>
	<li>Próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C umrodziś na lodzie.</li>
	<li>Do każdej probówki należy dodać 700 μL buforu RLT z zestawu do ekstrakcji RNA. Używaj pipety P1000, aby pipetować w górę i w dół przez co najmniej 15 razy lub aż wszystkie zarodki się rozpuszczą.</li>
	<li>Trzymaj próbki na lodzie przez 20 minut. Delikatnie wymieszaj ponownie, pipetując w górę i w dół przez co najmniej 10 razy, aby całkowicie ujednolicić zarodki.</li>
	<li>Do zhomogenizowanych zarodków należy dodać 700 μL 70% etanolu. Pipetować w górę i w dół, aby dobrze wymieszać, i przelać 700 μL mieszanki do kolumny spinowej.</li>
	<li>Wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Zrezygnuj z przepływu. Powtarzaj wirówkę, aż reszta mieszanki będzie gotowa.</li>
	<li>Dodaj 350 μL buforu RW1 i wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Usuń przepływ.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 80 μL DNazy I do środka błony w kolumnie. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 350 μL buforu RW1 i wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Usuń przepływ.</li>
	<li>Dodaj 500 μL buforowego RPE i wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Usuń przepływ. Powtórz pranie jeszcze raz.</li>
	<li>Susz kolumnę, ponownie wirując w 10 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Przełóż kolumnę do nowej rurki wolnej od RNazy. Ostrożnie dodaj 35 μL wolnego od RNaz H2O do środka błony w kolumnie.</li>
	<li>Wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Zbierz eluowane RNA i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Aby zmierzyć stężenie RNA, najpierw przygotuj roztwór roboczy za pomocą zestawu do ilościowania RNA, rozcieńczając odczynnik RNA (barwnik) w kształcie 1:200 w buforze RNA. Oblicz całkowitą objętość roztworu roboczego w zależności od liczby standardów i przygotuj 200 μL dla każdego standardu lub próbki.</li>
	<li>Ustaw pasek 0,2 mL z 8 rurkami. Aby rozcieńczyć każdy standard, dodaj 10 μL do 190 μL roztworu roboczego. Aby rozcieńczyć każdą próbkę, dodaj 1 μL do 199 μL roztworu roboczego. Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Włóż pasek z 8 rurek do fluorometru. Wybierz test RNA, skalibruj według standardów i odczytaj stężenia próbek.</li>
</ol>
4. Początkująca biotynylacja i oczyszczanie EU-RNA
UWAGA: Do biotynylizacji i ściągnięcia powstających RNA EU-RNA używany jest zestaw do przechwytywania RNA powstającego na podstawie chemii klikowej. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, a kolejne kroki są nieco modyfikowane. RNA z zarodków nieiniekowanych, a także RNA EU bez biotinylacji, mogą służyć jako kontrola tła dla specyficzności pulldown.
<ol>
	<li>Biotinylacja i oczyszczanie RNA<ol>
		<li>Dla każdej próbki wymieszaj następujące składniki w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, aby uzyskać reakcję klikową 50 μL: całkowite RNA (1–10 μg), 1x bufor EU, 2 mM CuSO4, 0,25 mM biotynowy azyd, 10 mM dodatek 1 oraz 12 mM dodatek 2.</li>
		<li>Inkubuj mieszankę reakcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut na nutatorze.</li>
		<li>W każdej powyższej reakcji dodaj 1 μL glikogenu, 50 μL 7,5 M octaniego amonu oraz 700 μL schłodzonego 100% etanolu. Pipetuj pipetami 5 razy, żeby dobrze je wymieszać.</li>
		<li>Włóż tubkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowuj na noc.</li>
		<li>Wiruj probówkę w 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając granulki.</li>
		<li>Dodaj 700 μL etanolu 75% i delikatnie wymieszaj, aby ponownie zawiesić pellet. Wiruj probówkę w 13 000 x g przez 5 minut w 4 °C. Ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając granulki. Powtórz pranie jeszcze raz.</li>
		<li>Susz pellet na powietrzu przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesij pellet w 10 μL wolnym od RNaz H2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie EU-RNA<ol>
		<li>Aby zebrać powstające EU-RNA, na każdą próbkę należy podać 5 μL magnetycznych kulek powlekanych streptawidyną w nowej mikrowirówce o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Dodaj 9 μL buforu płukania 2. Dobrze wymieszaj i umieść lampę na magnetycznym stojaku. Zostaw to na 2 minuty. Usuń supernatant. Powtarzaj pranie jeszcze dwa razy. Ponownie zawiesz kulki w 5 μL Wash Buffer 2.</li>
		<li>Przygotuj następującą mieszankę główną w nowej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL (15 μL na każdą próbkę): 12,5 μL buforu wiążącego RNA (składnik G), 0,2 μL rozcieńczonej RNazy OUT oraz 2,3 μL wolnej od RNazy H2O. Dodaj 15 μL mieszanki do każdej probówki zawierającej próbkę RNA.</li>
		<li>Inkubuj przez 5 minut na bloku grzewczym w temperaturze 69 °C. Umieść probówkę na lodzie.</li>
		<li>Do każdej probówki zawierającej próbkę RNA należy dodać 5 μL powyższych wcześniej wypranych kulek. Inkubuj przez 30 minut na nutatorze w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 50 μL buforu płukania 1. Dobrze wymieszaj i umieść lampę na magnetycznym stojaku. Zostaw to na 2 minuty. Usuń supernatant. Powtórz pranie jeszcze 4 razy. Uwaga: Supernatant po pierwszym płukaniu, który prawdopodobnie zawiera tylko transkrypty matczyne, może być pobrany do pomiaru transkryptomu matki.</li>
		<li>Dodaj 50 μL buforu płukania 2. Dobrze wymieszaj i umieść lampę na magnetycznym stojaku. Zostaw to na 2 minuty. Usuń supernatant. Powtórz pranie jeszcze 4 razy.</li>
		<li>Ponownie zawiesz kulki w 5 μL Wash Buffer 2. Koraliki, które zawierają powstające EU-RNA, są gotowe do bezpośredniej syntezy cDNA i przygotowania biblioteki. Uwaga: Przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki wzbogacenie początkujących transkrypcji można ocenić, mierząc ekspresję znanych pojedynczych genów za pomocą reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji polimerazy (RT-PCR).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki RNA
<ol>
	<li>Używaj komercyjnie dostępnych zestawów do przygotowania bibliotek cDNA i postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi w zestawie. Użyj NEBNext Library Quant Kit for Illumina, aby ilościowo określić biblioteki i zgrupować je.</li>
	<li>Zgrupuj biblioteki zgodnie z instrukcjami powszechnie używanych zestawów sekwencjonowania nowej generacji. Rozcieńcz biblioteki do ~1,8 pM przed załadowaniem ich do sekwencera stacjonarnego, aby osiągnąć optymalną gęstość klastrów ~200k/mm2 podczas sekwencjonowania. Sekwencjonowanie bibliotek za pomocą powszechnie używanego sekwencjonowania nowej generacji. Zastosowano sekwencjonowanie parowe 75 bp dla ~20 milionów odczytów na próbkę.</li>
	<li>Ilościowo określić odczyty transkryptomiczne, dopasowując sekwencje do genomu Xenopus laevis build 9.2 przy użyciu salmon17 oraz przeprowadzić różnicową analizę ekspresji genów za pomocą DESeq218. Aby zwizualizować piki w przeglądarce genomu, przypisz sekwencje do genomu za pomocą STAR19 i wyświetl je w Integrative Genomics Viewer (IGV)19.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotic+genome+activation+during+the+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).</li>
<li>Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotic+genome+activation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Zygotic genome activation in vertebrates.</a> Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition revisited.</a> Development. 146 (11), (2019).</li>
<li>Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition%3A+Reprogramming+of+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus.</a> Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).</li>
<li>Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The timing of zygotic genome activation.</a> Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).</li>
<li>Tadros, W., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition%3A+A+play+in+two+acts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts.</a> Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).</li>
<li>Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-zygotic+transition%3A+Death+and+birth+of+rnas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas.</a> Science. 316 (5823), 406-407 (2007).</li>
<li>Chen, H., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcriptome+reveals+orchestration+of+zygotic+genome+activation+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis.</a> Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).</li>
<li>Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterning+of+zygotic+genome+activation+in+a+model+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo.</a> Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+nascent+transcription+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying nascent transcription in early embryogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).</li>
<li>Heyn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+transcribed+zygotic+genes+are+short%2C+newly+exmaved%2C+and+different+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species.</a> Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).</li>
<li>Bhat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slamseq+resolves+the+kinetics+of+maternal+and+zygotic+gene+expression+during+early+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis.</a> Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).</li>
<li>Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eu-rna-seq+for+in+vivo+labeling+and+high+throughput+sequencing+of+nascent+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).</li>
<li>Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+genome+activation+in+drosophila+is+extensive+with+an+initial+tendency+for+aborted+transcripts+and+retained+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns.</a> Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).</li>
<li>Chan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+p300+confer+transcriptional+competency+during+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation.</a> Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+in+vitro+fertilization+and+natural+mating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+rna-seq+data+with+deseq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+universal+rna-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ultrafast universal rna-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Chen, H., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nascent+transcription+in+wholemount+vertebrate+embryos+to+characterize+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation.</a> Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).</li>
<li>Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+nascent+transcription+reveals+sparse+genome+usage+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity.</a> Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).</li>
<li>Battich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+metabolically+labeled+transcripts+in+single+cells+reveals+mrna+turnover+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies.</a> Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów.

Przedstawiliśmy tutaj szczegółowy protokół znakowania metabolicznego nowo powstającego transkryptomu we wczesnej embriogenezie, w tym mikrowstrzyknięcie 5-EU do zarodków jednokomórkowych, ekstrakcję całkowitych RNA i pomiar ich stężeń oraz biotinylację i oczyszczanie powstających RNA EU do przygotowania i sekwencjonowania biblioteki (EU-RNA-Seq) (Rysunek 1). Dzięki wysokiej czułości i specyficzności podejścia w porównaniu z całkowitym RNA-seq, protokół ten pozwolił nam nie tylko dokładnie ok...

Po zapłodnieniu zarodek jest pod kontrolą czynników matczynych zdeponowanych w jaje, podczas gdy genom zygoty jest przez pewien czas transkrypcjonalnie nieobecny; Jest aktywowany do transkrypcji setek do tysięcy genów niezbędnych do dalszego rozwoju, w tym specyfikacji przeznaczenia komórek oraz tworzenia warstwy zarodkowej 1,2,3,4,5,6. To zjawisko aktywacji genomu zygoty (ZGA) podczas przejścia matki do zygoty (MZT) jest silnie zachowane we wszystkich gatunkach metazoa, choć czas wystąpienia ZGA różni się w zależności odgatunku 1,2,3,4,5,6. Zrozumienie, jak ZGA jest regulowane, jest ważne nie tylko dla naszego zrozumienia podstawowych zasad wczesnego rozwoju, ale także daje potencjał do opracowywania nowych strategii diagnozowania i leczenia zaburzeń rozwojowych oraz poprawy zdrowia reprodukcyjnego.
Głównym wyzwaniem w badaniu ZGA było dokładne wykrywanie nowych transkrypcji i określenie ich czasu powstania podczas aktywacji genomu zygoty (ZGA). Ze względu na dominację transkrypcji matki we wczesnych embrionach7, wysokie poziomy tych transkrypcji mogą maskować wykrywanie nowych transkrypcji podczas ZGA, szczególnie dla tych słabo aktywowanych genów, przy użyciu konwencjonalnego masowego RNA-seq. Aby pokonać to wyzwanie, opracowaliśmy metodę pomiaru początkującego transkryptomu poprzez metaboliczne znakowanie transkryptów za pomocą 5-etynylo-urydyny (5-EU), a następnie biotinylację powstających RNA EU za pomocą chemii klikowej i oczyszczanie ich do sekwencjonowania (EU-RNA-seq)8,9,10. W porównaniu z innymi początkującymi metodami profilowania transkryptów, takimi jak te wykorzystujące 4-tiourydynę (4sU)11,12, oznakowanie 5-EU jest wysoce specyficzne za pomocą klikowej chemii, może być stosowane zarówno do obrazowania, jak i sekwencjonowania, i nie wymaga konwersji chemicznej. Co więcej, początkujący EU-RNA-seq jest bardzo czuły i wykrywa setki genów, których aktywacji nie może wykryć konwencjonalny RNA-seq8. To podejście pozwoliło nam również precyzyjnie określić początek aktywacji genu zygotycznego oraz profilować wyraźne wzorce czasowo-przestrzenne ZGA podczas wczesnej embriogenezy8.
Opisujemy tutaj szczegółowe procedury przygotowania próbek do EU-RNA-seq w celu profilowania rodzącego się transkryptomu, wykorzystując wczesne zarodki Xenopus laevis jako model. Protokół ten jest adaptacją wcześniejszej metody10,13 z drobnymi optymalizacjami procedur, w tym mikroiniekcją 5-EU do zarodków w stadium 1-komórkowym, biotinylacją powstających RNA EU-RNA za pomocą reakcji klikowej oraz ich oczyszczaniem do sekwencjonowania (Rysunek 1). Aby zapewnić powtarzalność, w zależności od stadia wczesnych zarodków o różnej liczebności początkujących transkryptów, należy użyć 1–10 μg całkowitego RNA jako wejścia, choć nadal można użyć mniejszej ilości. Protokół ten można stosować w innych układach embrionalnych, takich jak Drosophila14 i daniodano 15, oraz w innych tkankach13. Metoda ta jest potężnym narzędziem dla naszego zrozumienia transkrypcji genów i mechanizmów regulacyjnych w różnych procesach biologicznych, w tym ujawniania nowych zasad wczesnej embriogenezy.

<table><tbody><tr><td>&mikro; Mikroinjektor PUPM</td><td>Światowe Precyzyjne Instrumenty</td><td>UPUMP</td><td>Do mikrowstrzykowania (mikrowstrzykiwania pod ciśnieniem)</td></tr><tr><td>5-ehtynylurydyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E10345</td><td>Do mikroiniekcji (oznakowanie początkujących traqnscriptów)</td></tr><tr><td>Stereomikroskopy ACCU-SCOPE 3075 Zoom</td><td>VWR</td><td>470351-130</td><td>Do mikrozastrzyków (wizualizacji embrionów)</td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td>Do wytrącenia RNA</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7506</td><td>Za reakcję kliknięcia</td></tr><tr><td>Naczynia włosowate ze szkła borokrzemowego</td><td>Światowe Precyzyjne Instrumenty</td><td>TW100-4</td><td>Do mikroiniekcji (robienie szklanych igieł)</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td>Dla wirówki</td></tr><tr><td>Zestaw do przechwytywania RNA z Click-iT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10365</td><td>Do biotinylacji i oczyszczania powstającego RNA</td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230</td><td>Za reakcję kliknięcia</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4716728001</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0300-10</td><td>Do mikrozastrzyków (inkubujących zarodków)</td></tr><tr><td>Szklanki do szalki Petriego (60 mm)</td><td>VWR</td><td>75845-542</td><td>Do zapłodnienia</td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>Do wytrącenia RNA</td></tr><tr><td>Olej halowęglowodowy 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Do mikroiniekcji (kalibracja objętości wtrysku)</td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td>Do dejellizacji embrionów</td></tr><tr><td>Końcówki mikroładowaczy</td><td>Naukowy kalibr</td><td>EPE-5242956003</td><td>Do mikroiniekcji (załadowanie 5-EU do szklanej igły)</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit dla Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630</td><td>Dla kwantyfikacji bibliotecznej</td></tr><tr><td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>Do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubi Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33327</td><td>Do pomiaru stężenia RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do wiązania kubitowego RNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32852</td><td>Do pomiaru stężenia RNA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Mikrometr etapowy</td><td>Ward's Science</td><td>470175-914</td><td>Do mikroiniekcji (kalibracja objętości wtrysku)</td></tr><tr><td>Uniwersalny RNA-seq z NuQuant</td><td>NuGEN</td><td>0364</td><td>Do przygotowania do biblioteki</td></tr></tbody></table>

znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie xenopus

Metabolic Labeling of the Nascent Transcriptome in Xenopus Early Embryogenesis

Wczesna embriogeneza wymaga nowej transkrypcji genów zygotycznych z początkowo uśpionego genomu zygoty po zapłodnieniu. Głównym wyzwaniem było dokładne wykrycie nowych transkrypcji i określenie czasu ich ekspresji podczas aktywacji genomu zygoty (ZGA). Przedstawiamy tutaj szczegółowe procedury znakowania metabolicznego początkujących transkryptów za pomocą 5-etynylo-udrydyny (5-EU) we wczesnych zarodkach Xenopus laevis . Po zapłodnieniu 5-EU jest mikrowstrzykiwane do zarodków w stadium 1 komórki, aby metabolicznie oznaczać nowo transkrybowane RNA podczas ZGA. Powstające RNA EU są następnie oczyszczane po biotinylacji za pomocą reakcji chemicznych pośredniczonych w klikach, a powstający transkryptom jest określany za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. Co ważne, metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością, co pozwala na charakteryzację słabo aktywowanych genów. W ten sposób takie podejście stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki transkrypcji genów podczas wczesnego rozwoju i może być uogólnione na inne systemy embrionalne lub tkanki.

Zarodki Xenopus laevis (cztery biologiczne repliki) w etapach od 5 do 9 godzin po zapłodnieniu (hpf) w temperaturze 22 °C, obejmujące stadia od stadium 5 (z niewielką ZGA) do 9. stadium (z wysokim ZGA), były przetwarzane zgodnie z protokołem powyżej8. Całkowite RNA, oczyszczone powstające RNA EU oraz RNA przepływowe zostały użyte do przygotowania bibliotek i zostały sekwencjonowane. Jak pokazano na Rysunku 2, porównując powstający transkryptom przy 6–9 hpf z ...

Dostarczamy szczegółowe metody metabolicznego oznaczania i oczyszczania początkujących transkryptów do analizy transkryptomu u wczesnych zarodków Xenopus z wykorzystaniem 5-etynylo-urydyny (5-EU).

Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus

Early embryogenesis requires new transcription of zygotic genes from the initially dormant zygotic genome after fertilization. A major challenge has been ...

W niniejszym badaniu badamy, jak zachodzi aktywacja genów zygotycznych oraz regulacja przejściowa podczas wczesnego powstawania zarodków xenopus. Istniejące metody mają trudności z wykrywaniem, że nowo aktywowane transkrypty zygotyczne emitują obfitość RNA matki. Ten protokół etykietuje i wzbogaca początkujące transkrypty.Na początek umieść komorę mikrowtryskową pod mikroskopem stereo i dodaj do komory jeden mililitr roztworu Ficoll. Pobierz zarodki Xenopus laevis przechowywane w 0,1X mark zmodyfikowanym roztworze ringerów lub MMR. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść 20 lub więcej zarodków do centrum komory mikroiniekcji.Przygotuj igłę do wstrzykiwania, przecinając cienką końcówkę szklanej igły pęsetą. Ustawij igłę pionowo z końcówką skierowaną w dół i załaduj 0,5 mikrolitra 50 mM 5-etynylurydyny lub 5 M EU za pomocą pipety P2 z końcówką mikroładowaną. Zamontuj igłę na mikromanipulatorze.Za pomocą pipety P10 umieść 10 mikrolitrów oleju halowęglowego na mikrometrze scenicznym umieszczonym pod mikroskopem stereo. Aby kalibrować objętość, naciśnij pedał stopy mikrowtryskiwacza i wstrzykni kroplę do oleju halowęglowego na mikrometrze. Dostosuj ciśnienie i czas wtrysku w mikrowtryskiwaczu do średnicy kropli do 0,27 milimetra.Trzymaj zarodek w jednym stadium komórki pęsetą i kontroluj igłę mikromanipulatorem, aby wstrzyknąć 10 nanolitrów 50 mM 5 EU. Przenieś wstrzyknięte zarodki do nowej szklanej misy z roztworem Ficoll i inkubuj przez godzinę. Usuń roztwór Ficoll i dodaj roztwór 0,1 XMMR. Wizualnie obejrzyj zarodki podczas rozwoju i usuwaj ewentualne nieprawidłowe zarodki, jeśli to konieczne.Przenieś 10 zarodków na pożądanym etapie rozwoju do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Usuń wszelkie pozostałości z rurki, zamroz zarodki w ciekłym azocie i przechowaj w zamrażarce o temperaturze do 80 stopni Celsjusza. Następnie wyodrębnić całkowite RNA z zarodków i zmierzyć jego stężenie za pomocą komercyjnych zestawów.Aby wykonać reakcję klikową o pojemności 50 mikrolitrów, wymieszaj składniki pokazane w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Inkubuj mieszankę reakcji na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Teraz do każdej mieszanki reagującej dodaj glikogen, octan amonu i schłodzony etanol.Dobrze wymieszaj, pipetując pięć razy. Inkubuj przez noc w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po inkubacji przez noc wiruj w wirówce przy 13 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie usuń supernatant bez zakłócania granulki.Przemyj granulat dwa razy 700 mikrolitrami 75% etanolu. Po wirowaniu i wyrzuceniu supernatantu susz granulat na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut, a następnie ponownie zawiesij pellet w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNazy. Podaj pięć mikrolitrów magnetycznych kulek powlekanych streptawidyną do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj dziewięć mikrolitrów buforu do mycia 2 do koralików i dobrze wymieszaj. Umieść rurkę na magnetycznym stojaku na dwie minuty. Usuń supernatant i powtórz mycie jeszcze dwa razy.Następnie ponownie zawiesij kulki w pięciu mikrolitrach buforu wash-2. Przygotuj mieszankę główną w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mikrolitra. Dodaj 15 mikrolitrów mieszanki głównej do każdej probówki zawierającej próbkę RNA.Umieść probówkę na bloku grzewczym i inkubuj ją w temperaturze 69 stopni Celsjusza przez pięć minut. Potem załóż rurkę na lod. Następnie dodaj pięć mikrolitrów wcześniej umytych kulek do każdej próbki RNA i inkubuj na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Kompleksy kulek RNA przemyj pięć razy buforem 1 o pojemności 50 mikrolitrów, a następnie pięć razy z buforem 2 o pojemności 50 mikrolitrów. Ponownie zawiesij kulki w pięciolitrowym buforze do mycia 2. Używaj kulek zawierających powstające RNA EU bezpośrednio do komplementarnej syntezy kwasu deoksyrybonukleinowego i przygotowania bibliotecznego.Rosnącą liczbę genów aktywowanych różnicowo wykryto podczas aktywacji genomu zygotycznego, gdy porównano powstający transkryptom sześć godzin po zapłodnieniu z tym po pięciu godzinach po zapłodnieniu, przy czym dalszy wzrost obserwowano po siedmiu godzinach po zapłodnieniu, ośmiu godzinach po zapłodnieniu i dziewięciu godzinach po zapłodnieniu. Geny zygotyczne wykryto na wyższych poziomach i w wcześniejszych momentach w danych sekwencjonowania RNA EU w porównaniu z całkowitą liczbą danych sekwencjonowania RNA. Staranne oczyszczanie metabolicznie oznakowanych RNA jest najważniejszym czynnikiem zapewniającym czułość i swoistość w tym protokole.Nowo powstałe RNA znakowane przez UE wyprodukowane za pomocą tego protokołu mogą być dodatkowo analizowane biochemicznie in vitro. Takie podejście umożliwia przyszłym badaniom badanie wzorców aktywacji genomu, specyficznej dla tkanek ekspresji genów oraz mechanizmów regulacyjnych jako pojedynczych komórek.

metabolic-labeling-nascent-transcriptome-xenopus-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Opisano metodę opartą na chemii klik, która umożliwia szybkie, nieinwazyjne i wiarygodne znakowanie glikanów z etykietą alkiniową w embrionach danio pręgowanego. W niniejszym badaniu obrazowano glikany fukozylowane w warstwie otaczającej embriony danio pręgowanego w późnej fazie gastrulacji.

Obrazowanie glikanów w embrionach danio pręgowanego za pomocą znakowania metabolicznego i bioortogonalnej chemii klik

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Opisujemy oryginalną platformę do analizy transferowego RNA o nazwie SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt jednocześnie mierzy poziomy komórkowe wszystkich tRNA w próbkach biologicznych, w zaledwie trzech krokach i w czasie krótszym niż 24 godziny.

Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Opisujemy metody wizualizacji początkowej transkrypcji podczas aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach we wczesnej embriogenezie.

Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Poznaj metodę znakowania metabolicznego nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus laevis. Protokół ten umożliwia precyzyjną analizę aktywacji genomu zygoidalnego z wysoką czułością.

Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus

Przeglądaj więcej filmów