Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus

W niniejszym badaniu badamy, jak zachodzi aktywacja genów zygotycznych oraz regulacja przejściowa podczas wczesnego powstawania zarodków xenopus. Istniejące metody mają trudności z wykrywaniem, że nowo aktywowane transkrypty zygotyczne emitują obfitość RNA matki. Ten protokół etykietuje i wzbogaca początkujące transkrypty.

Na początek umieść komorę mikrowtryskową pod mikroskopem stereo i dodaj do komory jeden mililitr roztworu Ficoll. Pobierz zarodki Xenopus laevis przechowywane w 0,1X mark zmodyfikowanym roztworze ringerów lub MMR. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść 20 lub więcej zarodków do centrum komory mikroiniekcji.

Przygotuj igłę do wstrzykiwania, przecinając cienką końcówkę szklanej igły pęsetą. Ustawij igłę pionowo z końcówką skierowaną w dół i załaduj 0,5 mikrolitra 50 mM 5-etynylurydyny lub 5 M EU za pomocą pipety P2 z końcówką mikroładowaną. Zamontuj igłę na mikromanipulatorze.

Za pomocą pipety P10 umieść 10 mikrolitrów oleju halowęglowego na mikrometrze scenicznym umieszczonym pod mikroskopem stereo. Aby kalibrować objętość, naciśnij pedał stopy mikrowtryskiwacza i wstrzykni kroplę do oleju halowęglowego na mikrometrze. Dostosuj ciśnienie i czas wtrysku w mikrowtryskiwaczu do średnicy kropli do 0,27 milimetra.

Trzymaj zarodek w jednym stadium komórki pęsetą i kontroluj igłę mikromanipulatorem, aby wstrzyknąć 10 nanolitrów 50 mM 5 EU. Przenieś wstrzyknięte zarodki do nowej szklanej misy z roztworem Ficoll i inkubuj przez godzinę. Usuń roztwór Ficoll i dodaj roztwór 0,1 XMMR. Wizualnie obejrzyj zarodki podczas rozwoju i usuwaj ewentualne nieprawidłowe zarodki, jeśli to konieczne.

Przenieś 10 zarodków na pożądanym etapie rozwoju do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Usuń wszelkie pozostałości z rurki, zamroz zarodki w ciekłym azocie i przechowaj w zamrażarce o temperaturze do 80 stopni Celsjusza. Następnie wyodrębnić całkowite RNA z zarodków i zmierzyć jego stężenie za pomocą komercyjnych zestawów.

Aby wykonać reakcję klikową o pojemności 50 mikrolitrów, wymieszaj składniki pokazane w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Inkubuj mieszankę reakcji na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Teraz do każdej mieszanki reagującej dodaj glikogen, octan amonu i schłodzony etanol.

Dobrze wymieszaj, pipetując pięć razy. Inkubuj przez noc w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po inkubacji przez noc wiruj w wirówce przy 13 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie usuń supernatant bez zakłócania granulki.

Przemyj granulat dwa razy 700 mikrolitrami 75% etanolu. Po wirowaniu i wyrzuceniu supernatantu susz granulat na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut, a następnie ponownie zawiesij pellet w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNazy. Podaj pięć mikrolitrów magnetycznych kulek powlekanych streptawidyną do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj dziewięć mikrolitrów buforu do mycia 2 do koralików i dobrze wymieszaj. Umieść rurkę na magnetycznym stojaku na dwie minuty. Usuń supernatant i powtórz mycie jeszcze dwa razy.

Następnie ponownie zawiesij kulki w pięciu mikrolitrach buforu wash-2. Przygotuj mieszankę główną w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mikrolitra. Dodaj 15 mikrolitrów mieszanki głównej do każdej probówki zawierającej próbkę RNA.

Umieść probówkę na bloku grzewczym i inkubuj ją w temperaturze 69 stopni Celsjusza przez pięć minut. Potem załóż rurkę na lod. Następnie dodaj pięć mikrolitrów wcześniej umytych kulek do każdej próbki RNA i inkubuj na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Kompleksy kulek RNA przemyj pięć razy buforem 1 o pojemności 50 mikrolitrów, a następnie pięć razy z buforem 2 o pojemności 50 mikrolitrów. Ponownie zawiesij kulki w pięciolitrowym buforze do mycia 2. Używaj kulek zawierających powstające RNA EU bezpośrednio do komplementarnej syntezy kwasu deoksyrybonukleinowego i przygotowania bibliotecznego.

Rosnącą liczbę genów aktywowanych różnicowo wykryto podczas aktywacji genomu zygotycznego, gdy porównano powstający transkryptom sześć godzin po zapłodnieniu z tym po pięciu godzinach po zapłodnieniu, przy czym dalszy wzrost obserwowano po siedmiu godzinach po zapłodnieniu, ośmiu godzinach po zapłodnieniu i dziewięciu godzinach po zapłodnieniu. Geny zygotyczne wykryto na wyższych poziomach i w wcześniejszych momentach w danych sekwencjonowania RNA EU w porównaniu z całkowitą liczbą danych sekwencjonowania RNA. Staranne oczyszczanie metabolicznie oznakowanych RNA jest najważniejszym czynnikiem zapewniającym czułość i swoistość w tym protokole.

Nowo powstałe RNA znakowane przez UE wyprodukowane za pomocą tego protokołu mogą być dodatkowo analizowane biochemicznie in vitro. Takie podejście umożliwia przyszłym badaniom badanie wzorców aktywacji genomu, specyficznej dla tkanek ekspresji genów oraz mechanizmów regulacyjnych jako pojedynczych komórek.