Name: Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków Xenopus laevis przy użyciu 5-EU i mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia śledzenie przestrzennej i czasowej dynamiki transkrypcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium Matthew Gooda na Uniwersytecie Pensylwanii za szkolenie. Prace te były częściowo wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

Opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej.
1. Przygotowanie przed rozpoczęciem protokołu
UWAGA: Przed rozpoczęciem protokołu przygotuj następujące roztwory z użyciem wody wolnej od RNazy.
<ol>
	<li>Przygotuj 1× soli trisbuforowanej (TBS), pH 7,6: 50 mM Tris-HCl i 150 mM NaCl. Ustawij pH do 7,6. Przechowuj w temperaturze pokojowej. Wykorzystaj bufor w ciągu dwóch miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj 1× soli trisbuforowanej z Tween 20 (TBST), pH 7,6: dodaj Triton X-100 w końcowym stężeniu 0,1% (vol/vol) do 1× TBS (pH 7,6) przygotowanej w wodzie wolnej od RNazy. Przechowuj w temperaturze pokojowej. Wykorzystaj bufor w ciągu miesiąca.</li>
	<li>Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA)/1× MEM: wymieszaj 1 fiolkę (10 mL) 16% PFA i 4 mL 10× MEM (1000 mM 3- (N-morfolino)propanosulfonowego kwasu [MOPS], pH 7,4, 20 mM EGTA i 10 mM MgSO4). Dodaj wodę wolną od RNazy do 40 mL. Zaleć i przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwór wykorzystaj w ciągu 6 miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj 70%, 50% i 25% metanolu w 0,5× SSC: wymieszaj metanol i 0,5× SSC odpowiednio w proporcjach 3:1, 1:1 i 1:3. Użyj roztworu w ciągu sześciu miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj roztwór wybielający: Wymieszaj, aby uzyskać końcowe stężenie 2% (vol/vol)H2O2,5% formamidu (vol/vol) oraz 0,5× SSC w wodzie wolnej od RNazy. Przygotuj ten roztwór na świeżo tuż przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj roztwór blokujący: Dodaj końcowe stężenie 10% (objętość/objętość) surowicy koziej oraz 0,2% (masa/objętość) BSA w 1× TBST. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Zużywaj roztwór w ciągu 6 miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj odczynnik oczyszczający BABB: Wymieszaj 1 część alkoholu benzylowego (BA) i 2 części benzoianu benzylowego (BB). Przechowuj w temperaturze pokojowej. Użyj roztworu w ciągu 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Naprawa zarodków mikro-zaszczepionych 5-EU 
<ol>
	<li>Aby mikro-wstrzyknąć 5-etynylo-urydynę (5-EU) do zarodków jednokomórkowych, należy stosować procedury opisane wcześniej11. Pozwól zarodkom rozwinąć się do pożądanych etapów ZGA, np. etapu 9, gdy ZGA występuje aktywnie w większości komórek zarodka.</li>
	<li>Aby utrwalić zarodki mikrozastrzyknięte 5-EU, najpierw dodaj około 1,8 mL 4% PFA/1× MEM do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 2 mL. Następnie użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść ~20 zarodków do szklanej fiolki. Zminimalizuj ilość podłoża do szklanej fiolki.</li>
	<li>Napełnij szklaną fiolkę po wierzch dodatkowym 4% PFA/1× MEM. Zamknij fiolkę z nakrętką; Nie powinno się zostawiać żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodek z niską prędkością (np. 10 obr./min) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyj pipety, aby ostrożnie usunąć utrwalacz. Napełnij szklaną fiolkę 100% metanolem. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usuń metanol i dodaj nowy metanol. Powtórz rotację i odwodnienie co najmniej dwa razy, aby zarodki były całkowicie odwodnione.</li>
	<li>Przechowuj zarodki w metanolu w temperaturze -20 °C. UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj. Pozwól zarodkom pozostać w metanolu przez co najmniej 2 dni, zanim przejdziesz do kolejnych kroków. Zarodki mogą być użyte w ciągu 2 miesięcy.</li>
</ol>
3. Sprzężenie powstających RNA z fluoroforem za pomocą reakcji klikowej
<ol>
	<li>Aby nawodnić zarodki, najpierw usuń metanol ze szklanej fiolki, następnie dodaj 2 mL 75% metanolu w 0,5× SSC i zamknij fiolkę z kapslem. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 5 minut.</li>
	<li>Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki. Powtórz powyższy krok kolejno, używając 50% metanolu w 0,5× SSC, 25% metanolu w 0,5× SSC i 0,5× SSC. Aby całkowicie nawilżyć zarodki, powtórz ostatnie płukanie 0,5× SSC co najmniej dwa razy.</li>
	<li>Dodaj 2 mL świeżo przygotowanego roztworu wybielacza (2%H2O2 i 5% formamidu w stężeniu 0,5× SSC) do szklanej fiolki. Połóż szklaną fiolkę na kawałku folii aluminiowej, a następnie umieść ją pod światłem LED w takiej odległości, aby próbki nie przegrzały.</li>
	<li>Wybielaj zarodki pod światłem, aż wszystkie pigmenty staną się białe, co zazwyczaj zajmuje 5–6 godzin. Należy zauważyć, że ze względu na rozkładH2O2 naO2, powstają małe pęcherzyki powietrza, które mogą sprawić, że zarodki unoszą się na wodzie. Sprawdzaj zarodki okresowo (np. co 30 minut) i delikatnie obracaj szklaną fiolkę, aby zarodki mogły się osadzić w roztworze wybielającego.</li>
	<li>Ostrożnie usuń bufor wybielający. Dodaj 2 mL 0,5× SSC, aby szybko spłukać zarodki. Powtórz szybkie płukanie jeszcze raz, jeśli trzeba.</li>
	<li>Dodaj 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 1 godzinę. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.</li>
	<li>Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy. Należy zauważyć, że dokładne mycie zarodków jest kluczowe dla kolejnych kroków.</li>
	<li>Dodaj 2 mL 1× łyżeczki do szklanej fiolki. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 5 minut. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.</li>
	<li>Powtórz powyższy krok jeszcze raz.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę do reakcji klikowej w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, dodając następujące odczynniki, aby uzyskać końcowe stężenia 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM CuSO4, 25 μM tetrametylorodaminy (TAMRA)-azydu oraz 100 mM kwasu askorbinowego. Dodaj kwas askorbinowy na końcu do reakcji. Pipetuj w górę i w dół, żeby dobrze wymieszać.</li>
	<li>Dodaj mieszankę reakcji 200 μL do zarodków w szklanej fiolce. Upewnij się, że objętość mieszanki reakcji jest wystarczająca, aby zanurzyć wszystkie zarodki w fiolce. Inkubuj przez 12 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Ostrożnie usuń mieszankę reakcji klikowej. Należy zauważyć, że na zarodkach można zaobserwować fluorescencję niespecyficzną. Szybko przepłucz zarodki dwa razy 1× TBST, a następnie myj je 1× TBST przez co najmniej 5 razy, zmieniając roztwór co godzinę, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Kontynuuj mycie zarodków, zmieniając 1× TBST co 2 godziny i zostawiaj je na noc w temperaturze 4 °C na rotatorze. Przestań myć, gdy niespecyficzna fluorescencja jest prawie widoczna. Należy pamiętać, że ponieważ pozostałości reakcji klikowej mogą być szkodliwe dla immunobarwienia w dalszej fazie, należy dokładnie przemyć zarodki przez 1–2 dni, zanim przejdziemy do kolejnych kroków.</li>
</ol>
4. Immunobarwienie zarodków markerami podkomórkowymi (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Aby zablokować zarodki, usuń 1× TBST z fiolki szklanej w ostatnim kroku płukania powyżej i dodaj 200 μL roztworu blokującego (10% surowicy koziej/0,2% BSA/1× TBST). Owiń szklaną fiolkę kawałkiem folii aluminiowej, aby chronić zarodki przed światłem. Umieść szklaną fiolkę na nutatorze i delikatnie potrząsaj zarodkami przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej (lub przez noc w 4 °C).</li>
	<li>Rozcieńcz przeciwciało główne (np. przeciwciało przeciw H3) w proporcji 1:1 000 na 200 μL zawierającego 10% surowicy koziej/1× TBST. Dodaj rozcieńczone przeciwciało do szklanej fiolki i owiń ją kawałkiem folii aluminiowej. Inkubuj zarodki przez noc w temperaturze 4 °C na nutatorze z niską prędkością.</li>
	<li>Ostrożnie usuń przeciwciało ze szklanej fiolki. Szybko przepłucz zarodki dwa razy, dodając 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki i wyjmuj ją.</li>
	<li>Dodaj 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki, a następnie owiń ją kawałkiem folii aluminiowej. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 1 godzinę. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.</li>
	<li>Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy.</li>
	<li>Rozcieńcz przeciwciało wtórne (np. przeciwciało Alex Fluor 488) w stosunku 1:1 000 w 200 μL zawierającym 10% surowicy koziej/1× TBST. Jeśli konieczne jest barwienie DNA, rozcieńcz barwnik DNA (np. TO-PRO-3) razem z przeciwciałem wtórnym.</li>
	<li>Dodaj rozcieńczone przeciwciało do szklanej fiolki i owiń ją folią aluminiową. Inkubuj zarodki przez noc w temperaturze 4 °C na nutatorze z niską prędkością.</li>
	<li>Ostrożnie usuń przeciwciało ze szklanej fiolki. Szybko przepłucz zarodki dwa razy, dodając 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki i wyjmuj ją.</li>
	<li>Dodaj 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki, a następnie owiń ją kawałkiem folii aluminiowej. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 1 godzinę.</li>
	<li>Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie zarodków przed obrazowaniem konfokalnym
<ol>
	<li>Aby odwodnić zarodki, ostrożnie usuń bufor ze szklanej fiolki po ostatnim umyciu i dodaj 2 ml metanolu 100%. Owiń szklaną fiolkę folią aluminiową, umieść na rotatorze i pozwól zarodkom rotować z niską prędkością przez 5 minut. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.</li>
	<li>Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy.</li>
	<li>Aby całkowicie odwodnić zarodki, powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy, używając 2 ml metanolu bezwodnego w 100% bezwodnej.</li>
	<li>Ostrożnie usuń jak najwięcej metanolu ze szklanej fiolki.</li>
	<li>Użyj szklanej pipety, aby powoli dodawać 500 μL odczynnika oczyszczającego BABB do fiolki. Zarodki unoszą się w BABB i czekają 10 minut, aż wszystkie zarodki osiedlą się na dnie szklanej fiolki. Należy zauważyć, że zarodki stają się niemal niewidoczne i ostrożnie usuwaj BABB, nie uszkadzając zarodków.</li>
	<li>Powtórz powyższy krok co najmniej 2 razy lub aż nie będzie widocznych linii schlieren. Aby całkowicie oczyścić zarodki, trzymaj je w BABB przez 1–2 dni przed badaniem obrazowym.</li>
	<li>Tworzysz komory obrazujące, odcinając mały kwadrat (np. ~5 mm × 5 mm) z taśmy VHB o grubości ~ 1,1-1,2 mm (podobnej wielkości zarodka) i rozmiarze ~10 mm × 10 mm, a następnie przyklej go do szkła osłonowego o średnicy 24 mm × 40 mm.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś oczyszczone zarodki do komory, a następnie przykryj je kolejnym szkłem pokrywkowym. Zarodki będą znajdować się wewnątrz kanapki okularów osłonowych, aby można było sfotografować obie strony.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition%3A+Reprogramming+of+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus.</a> Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition revisited.</a> Development. 146 (11), dev161471(2019).</li>
<li>Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotic+genome+activation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Zygotic genome activation in vertebrates.</a> Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).</li>
<li>Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The timing of zygotic genome activation.</a> Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).</li>
<li>Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterning+of+zygotic+genome+activation+in+a+model+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo.</a> Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).</li>
<li>Chen, H., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcriptome+reveals+orchestration+of+zygotic+genome+activation+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis.</a> Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).</li>
<li>Chen, H., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nascent+transcription+in+whole-mount+vertebrate+embryos+to+characterize+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging nascent transcription in whole-mount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation.</a> Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li>
<li>Chan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+P300+confer+transcriptional+competency+during+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and P300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation.</a> Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).</li>
<li>Adar-Levor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinetic+abscission+is+part+of+the+midblastula+transition+in+early+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytokinetic abscission is part of the midblastula transition in early zebrafish embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (15), e2021210118(2021).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+nascent+transcription+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying nascent transcription in early embryogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+An+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów.

ZGA stanowi jeden z najważniejszych przejściów w najwcześniejszych etapach rozwoju zarodka 2,3. Tutaj opisaliśmy szczegółowe procedury przygotowania próbek do bezpośredniej wizualizacji ZGA w całych zarodkach Xenopus we wczesnym nasadzeniu, w tym fiksację zarodków mikro-EU, sprzężenie powstających RNA fluoroforem za pomocą reakcji klikowej, immunobarwienie markerów podkomórkowych po reakcji klikowej oraz oczyszczanie zarodków do obrazowania konfokalnego<...

W trakcie wczesnego rozwoju zarodek przechodzi przejście matczyno-zygotyczne (MZT), które stopniowo przenosi kontrolę rozwojową z czynników matczynych na geny zygotyczne. MZT wymaga aktywacji początkowo uśpionego genomu zygotycznego, procesu określanego jako aktywacja genomu zygoty (ZGA); geny wyrażane podczas ZGA są niezbędne do wczesnej specyfikacji losu komórkowego, gastrulacji oraz formowania osi 1,2. Co istotne, ZGA jest zachowana we wszystkich metazoach, a czas wystąpienia ZGA jest ściśle kontrolowany, choć różni się w zależności od gatunku 3,4. Zaburzenia regulacji ZGA mogą prowadzić do poważnych konsekwencji, od wad rozwojowych po śmierć embrionalną, taką jak poronienie. Dlatego badanie mechanizmów ZGA jest nie tylko ważne dla zrozumienia podstaw regulacji genów, ale ma także istotne implikacje kliniczne.
Głównym wyzwaniem w badaniu ZGA było bezpośrednie zobrazowanie dużych ZGA we wczesnych embrionach oraz badanie jego mechanizmów na poziomie pojedynczych komórek. Pokonaliśmy to wyzwanie, opracowując metodę wykorzystującą znakowanie metaboliczne początkujących transkryptów podczas ZGA z użyciem 5-etynylowurydyny (5-EU), a następnie konjugację powstających RNA EU z fluoroforami za pomocą chemii kliknięcia oraz wizualizację w embrionach całościowych za pomocą mikroskopii konfokalnej, wykorzystując Xenopus laevis jako model. Duży zarodek Xenopusa (~1,2 mm średnicy) zawiera gradient wielkości komórek, a duża skala ZGA występuje w okolicach środkowego stadium blastuli (z początkiem około stadium 7 i szczytem około 9), co czyni go idealnym modelem do badania wzorców ZGA5. Dzięki zastosowaniu oznakowania 5-EU we wczesnych zarodkach Xenopus mogliśmy bezpośrednio wizualizować i ilościowo określić dużą skalę ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków z pełnym montażem, co doprowadziło do odkrycia nowego wzorca czasoprzestrzennego ZGA, regulowanego głównie przez rozmiar komórki 5,6.
Tutaj opisujemy szczegóły tego podejścia, zaadaptowanego z wcześniejszych badań z optymalizacjami 5,7, w tym utrwalanie zarodków po metabolicznym znakowaniu początkujących transkryptów 5-EU, sprzężenie powstających RNA EU fluoroforem za pomocą reakcji klikowej8 oraz barwienie immunobarwne pod kątem markerów podkomórkowych, a następnie oczyszczanie zarodków do obrazowania konfokalnego. Metoda ta może być stosowana w innych układach embrionalnych, w tym daniopręgowanych 9,10, lub w sekwencjonowaniu do profilowania rodzącego się transkryptomu11, wspierając jej ogólne i szerokie zastosowanie w różnych typach próbek i analiz. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda stanowi nowy, ważny sposób badania mechanizmów regulacji genomu w pojedynczych komórkach.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehydu (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710-S</td><td>Do przygotowania roztworu utrwalacza</td></tr><tr><td>20& razy; SSC</td><td>Mediatech</td><td>MT46-020-CM</td><td>Do przygotowania roztworu wybielającego</td></tr><tr><td>Mieszacz 3D z nutacją</td><td>VWR</td><td>76595-802</td><td>Dla nutacji embrionów</td></tr><tr><td>Fiolki z gwintem 9 mm (2 mL)</td><td>VWR</td><td>46610-722</td><td>Do przetwarzania embrionów</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw-histon H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Do immunobarwienia</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7506</td><td>Za wywołanie reakcji kliknięcia</td></tr><tr><td>Benzylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>305197</td><td>Do oczyszczania zarodków</td></tr><tr><td>Benzoesan benzylowy</td><td>ACROS Organics</td><td>105860010</td><td>Do oczyszczania zarodków</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>Do tworzenia rozwiązania blokującego</td></tr><tr><td>Nakrętki na fiolki z gwintem 9 mm (2 mL)</td><td>VWR</td><td>46610-712</td><td>Do przetwarzania embrionów</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe (24 mm i razy; 40 mm)</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td>Do produkcji komory obrazującej</td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230</td><td>Za wywołanie reakcji kliknięcia</td></tr><tr><td>Etylenebis (oksyetylenenitrilo)kwas tetraoctowy (EGTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC409915000</td><td>Do przygotowania roztworu utrwalacza</td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Do przetwarzania obrazów</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC181090010</td><td>Do przygotowania roztworu wybielającego</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Za przeniesienie BABB</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwkrólikowe przeciw kozom Alex Fluor 488 wtórne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27034</td><td>Do immunobarwienia</td></tr><tr><td>Serum koziego</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Do tworzenia rozwiązania blokującego</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Do przygotowania roztworu wybielającego</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>Do przygotowania roztworu utrwalacza</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td>Do odwodnienia zarodków</td></tr><tr><td>Metanol, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415</td><td>Do odwodnienia zarodków</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC172631000</td><td>Do przygotowania roztworu utrwalacza</td></tr><tr><td>Wielomodowy mieszacz nutacyjny</td><td>VWR</td><td>76595-812</td><td>Dla nutacji embrionów</td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta transferowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Do transferu zarodków</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18-100-970</td><td>Do cięcia taśm</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP561-1</td><td>Do tworzenia rozwiązań wolnych od Rnazy</td></tr><tr><td>Roto-Mini PLUS (rotator)</td><td>VWR</td><td>470313-912</td><td>Do roracji embrionów</td></tr><tr><td>Tetrametylorrodamina (TAMRA)-azyd</td><td>Abcam</td><td>ab146486</td><td>Za wywołanie reakcji kliknięcia</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Do barwienia DNA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10789704001</td><td>Do robienia bufora do prania</td></tr><tr><td>Baza Trizma (Baza Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Do tworzenia bufora Tris</td></tr><tr><td>Taśmy VHB 3M GPH-110GF (45 mil.)</td><td>VWR</td><td>76524-608</td><td>Do produkcji komory obrazującej</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Do obrazowania konfokalnego</td></tr></tbody></table>

wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Visualizing Zygotic Genome Activation In Single Cells of Early Embryos

Wczesna embriogeneza wymaga przejścia matki do zygoty (MZT), które wymaga aktywacji genomu zygoty (ZGA). Podczas ZGA transkrybowane są setki do tysięcy genów, co jest niezbędne do różnych procesów wczesnego rozwoju zarodków, w tym utrzymania przeżywalności embrionalnej, określania losu komórek oraz tworzenia warstwy zarodkowej. Jednym z głównych wyzwań w badaniu ZGA było bezpośrednie zobrazowanie ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych embrionów. Tutaj opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków poprzez znakowanie metaboliczne powstających transkryptów za pomocą 5-etynylowoudrydyny (5-EU), następnie sprzężenie powstających RNA EU z fluoroforami za pomocą chemii kliknięcia oraz wizualizację ich w zarodkach całych za pomocą mikroskopii konfokalnej, wykorzystując Xenopus laevis jako model. Metoda ta umożliwiła nam śledzenie jednokomórkowego ZGA w zarodkach z pełnym montażem oraz ujawnienie heterogenicznego początku ZGA w przestrzeni i czasie podczas wczesnej embriogenezy. Może być stosowany w innych systemach embrionalnych lub tkankach do badania transkrypcji genów i regulacji genomu na poziomie pojedynczych komórek.

Zarodki Xenopus laevis na etapie 1-komórkowym były mikroiniekcjonowane 5-EU, a zarodki na etapie 9 były utrwalane, gdy w całym zarodku zachodziła duża skala ZGA. Zarodki były przetwarzane zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Powstające RNA w embrionach oznaczano TAMRA-azydem w reakcji klikowej, histon H3 za pomocą przeciwciała antyhistonowego H3, a DNA znakowano TO-PRO-3. Zarodki były obrazowane pod mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu 10×. Jak pokazano na Rysunku 1, powsta...

Opisujemy metody wizualizacji początkowej transkrypcji podczas aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach we wczesnej embriogenezie.

Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Early embryogenesis requires the maternal-to-zygotic transition (MZT) that necessitates the zygotic genome activation (ZGA). During ZGA, hundreds to ...

Nasze badania koncentrują się na tym, jak genom zostaje aktywowany w poszczególnych komórkach podczas wczesnego rozwoju embrionalnego. Istniejące metody, takie jak bezpośrednia wizualizacja aktywacji genów na dużą skalę z rozdzielczością pojedynczej komórki. Jego protokół może być stosowany w każdym systemie embrionalnym do badania aktywacji genomu pojedynczych komórek.Na początek dodaj około 1,8 mililitra 4% paraformaldehydu w MEM do dwumililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej. Za pomocą pipety transferowej plastikowej przenieś około 20 mikrowstrzykniętych zarodków z 5-etynyl urydyną do szklanej fiolki. Zminimalizuj ilość podłoża do szklanej fiolki.Napełnij szklaną fiolkę po wierzch dodatkowymi 4% paraformaldehydem w MEM. Zamknij fiolkę z nakrętką, upewniając się, że nie pozostaną w niej pęcherzyki powietrza. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.Następnie, używając pipety, ostrożnie usuń utrwalacz. Napełnij fiolkę 100% metanolem i obróć zarodki, jak pokazano wcześniej, przez pięć minut. Następnie ostrożnie usuń metanol i dodaj świeży metanol.Powtórz rotację i odwodnienie co najmniej dwa razy, aby zarodki były całkowicie odwodnione. Następnie przechowuj je w metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby nawodnić zarodki. Najpierw usuń metanol z szklanej fiolki.Dodaj dwa mililitry metanolu 75% w 0,5x SSC. Zamknij fiolkę z nakrętką i obróć zarodki, jak pokazano wcześniej. Kolejno zasteniaj roztworu 50% metanolem w 0,5X SSC, następnie 25% metanolu w 0,5X SSC, a na końcu 0,5X SSC.Obracaj zarodki z niską prędkością przez pięć minut podczas każdego kroku. Aby całkowicie nawilżyć zarodki, powtórz ostatnie płukanie 0,5X SSC co najmniej dwa razy. Następnie do szklanej fiolki dodaj dwa mililitry świeżo przygotowanego roztworu wybielającego zawierającego 2% nadtlenku wodoru i 5% formamidu w stężeniu 0,5X SSC.Umieść fiolkę szklaną na kawałku folii aluminiowej i umieść ją pod diodą elektrolumetingową w takiej odległości, aby nie przegrzewała próbek. Wybielaj zarodki pod światłem, aż wszystkie pigmenty staną się białe, co zazwyczaj zajmuje pięć do sześciu godzin. Następnie ostrożnie usuń bufor wybielający ze szklanej fiolki i dodaj dwa mililitry 0,5X SSC, aby szybko spłukać zarodki.Powtórz płukanie jeszcze raz, jeśli trzeba. Następnie dodaj dwa mililitry TBST do szklanej fiolki. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez godzinę.Po obrócie usuń płyn z szklanej fiolki, następnie powtórz płukania TBST pięć razy, a następnie dwa płukania TBS. Następnie w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra dodaj odczynniki, aby przygotować mieszaninę reakcji klikowej. Dodaj kwas askorbinowy do mieszaniny reakcji na końcu, a następnie wymieszaj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać.Teraz dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do zarodków w szklanej fiolce. Upewnij się, że objętość mieszaniny reakcji jest wystarczająca, by zanurzyć wszystkie zarodki w fiolce. Inkubuj zarodki przez 12 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie ostrożnie usuń mieszankę reakcji klikowej z fiolki szklanej. Szybko spłukaj zarodki dwa razy TBST. Następnie myj zarodki TBST co najmniej pięć razy, zmieniając roztwór co godzinę.Kontynuuj mycie zarodków, wymieniając TBST co dwie godziny. Zostawić zarodki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze. Przestań myć, gdy niespecyficzna fluorescencja jest ledwo widoczna.Aby odwodnić zarodki, ostrożnie usuń bufor ze szklanej fiolki po ostatnim myciu i dodaj dwa mililitry 100% metanolu. Owiń go folią aluminiową i umieść na rotatorze, aby przez pięć minut obracał zarodki z niską prędkością. Po obrócie wyjmij płyn z szklanej fiolki i powtórz proces odwodnienia z metanolem co najmniej pięć razy.Aby całkowicie odwodnić zarodki, dodaj do szklanej fiolki dwa mililitry metanolu bezwodnego w 100%. Umieść fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez pięć minut. Po obrotowaniu usuń metanol i powtórz odwodnienie co najmniej pięć razy.Ostrożnie usuń jak najwięcej metanolu ze szklanej fiolki. Używając szklanej pipety, powoli dodaj do szklanej fiolki 500 mikrolitrów odczynnika oczyszczającego benzylalkohol/benzoanu benzylowego. By całkowicie oczyścić zarodki.Trzymaj je w alkoholu benzylowym/benzoaianu przez jeden do dwóch dni przed badaniem obrazowym. Gdy zarodki osiadają na dnie, ostrożnie usuń roztwór, nie uszkadzając ich. Powtórz krok oczyszczania co najmniej dwa razy lub aż nie pojawią się żadne linie Schlierena.Następnie przekonuj badania obrazowe. Początkowo powstałe RNA 5-etynylowo-udrydynowe wykryto w jądrach komórek embrionalnych podczas dużej aktywacji genomu zygotycznego, przy czym Histone H3 służył jako marker jądrowy i znakowanie DNA, potwierdzając lokalizację jądrową. Połączony obraz wykazał, że sygnały RNA 5-etynylu udrydyny nakładały się na sygnały histonu H3 i DNA w jądrach komórek embrionalnych.Protokół ten pozwala naukowcom bezpośrednio wizualizować i ilościowo określać początkujące transkrypcje podczas wczesnej aktywacji genomu embrionalnego. Najważniejszym wyzwaniem dla tego protokołu jest oznakowanie powstających RNA w całych embrionach. Przyszłe badania obejmują mechanizmy pojedynczych komórek oraz przestrzenną koordynację regulacji genomu we wczesnej embriogenezie.

visualizing-zygotic-genome-activation-in-single-cells-of-early-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Dostarczamy szczegółowe metody metabolicznego oznaczania i oczyszczania początkujących transkryptów do analizy transkryptomu u wczesnych zarodków Xenopus z wykorzystaniem 5-etynylo-urydyny (5-EU).

Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus

Poznaj metodę wizualizacji aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków Xenopus laevis przy użyciu 5-EU i mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia śledzenie przestrzennej i czasowej dynamiki transkrypcji.

Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Przeglądaj więcej filmów