Name: Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 9 s
Description: Poznaj metodę generowania miniembrionów Xenopus laevis poprzez fizyczną manipulację węzłami włosów, zwiększającą stosunek N:C i aktywującą wczesną transkrypcję genów. Ta technika pozwala badać mechanizmy rozwoju zależne od wielkości komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium Matthew Gooda na Uniwersytecie Pensylwanii za zapewnienie szkoleń. Prace te były częściowo wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

Opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotowywanie rozwiązań<ol>
		<li>Przygotuj 20× MMR przez mieszanie 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl2 i 40 mM CaCl2. Ustaw pH do 7,8 z NaOH. Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj roztwór medium gradientu gęstości 3% (masa/vol), mieszając 1,5 g medium gradientu gęstości z 50 mL 0,5× MMR. Delikatnie mieszaj magnetycznym batykiem, aż polimer się rozpuści. Utrzymuj temperaturę 4 °C do użycia.</li>
		<li>Przygotuj żel agarozowy o pojemności 1% w 60-mm szalce Petriego, mieszając 0,5 g agarozy z 50 mL 0,1× MMR. Podgrzej w mikrofalówce, aby rozpuścić agarozę, a następnie dodaj 5 ml agarozy, aby pokryć dno 60-mm miski Petriego cienką warstwą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie węzłów do zaciśnięć zarodków<ol>
		<li>Weź kilka cienkich włosów i przetnij je na kawałki ~5 cm.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby włożyć jeden koniec włosów do końcówki P10 o głębokości około ~1 cm.</li>
		<li>Nałóż wosk na łyżkę i podgrzej ją, żeby stopić wosk. Szybko zanurz końcówkę P10 z włosami w wosku i pozwól wyschnąć przez 1 minutę. Upewnij się, że włosy są utrwalone na końcu końcówki P10.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby ostrożnie zrobić supeł z włosów nad głową. Dostosuj rozmiar pętli na ~1,5 mm. Przytnij zwis, jeśli trzeba. Odłóż węzeł na bok na przyszłość.</li>
		<li>Powtarzaj powyższe kroki, aby w razie potrzeby zrobić więcej węzłów do włosów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Tworzenie mini embrionów Xenopusa 
<ol>
	<li>Aby uzyskać zarodki Xenopusa , należy stosować standardowy protokół przeprowadzania zapłodnienia in vitro (IVF) (na przykład zob. Sive i in., 2007)12. Zarodek powinien mieć 0,1× MMR i być gotowy do użycia.</li>
	<li>Aby zobrazować ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych embrionów i zbadać ich mechanizmy regulacyjne, mikrowstrzyknij zarodkom w stadium 1 komórki 5-etynylo-urydynę (5-EU), aby metabolicznie oznaczać początkujące transkrypty11,13, zanim przejdziesz do następujących procedur.</li>
	<li>Gdy zarodki są w stanie ~1 godziny po zapłodnieniu (hpf), użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść ~20 zarodków do 60-mm szalki Petriego (pokrytej żelem 1% agarozowym) zawierającej ~15 mL 3% pożywki gradientowej gęstości/0,5× MMR.</li>
	<li>Użyj pęsety w jednej ręce, aby obrócić zarodek pod stereomikroskopem o ~45–60 stopni, aby uzyskać dostęp do bieguna roślinnego (bladej półkuli). Trzymaj przechylony zarodek pęsetą, a w drugiej ręce użyj igły 30G, aby ostrożnie przekłuć wędkę roślinną. Uwolnij trochę cytoplazmy, delikatnie naciskając zarodek.</li>
	<li>Ostrożnie zakryj węzeł do włosów zamontowany w końcówce P10 na zarodku, tak aby zwierzęcy słup (ciemna półkula) znajdował się wewnątrz węzła. Dostosuj pozycję węzła zgodnie z pożądanym rozmiarem mini zarodka.</li>
	<li>Trzymaj pipetę P10 jedną ręką, a pęsetą drugą pociągaj oba końce węzła w przeciwnych kierunkach. Węzeł włosowy zaciska się wokół zarodka, pomiędzy biegunem zwierzęcia (nienaruszonym) a biegunem roślinnym (uwalnianym cytoplazmą). Odetnij węzeł w miejscu, gdzie przyczepia się do końcówki P10.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.4–2.6 powyżej, aby uzyskać pożądaną liczbę mini embrionów.</li>
	<li>Pozwól, by zarodki pozostały w średniej gęstości gradientu 3% / 0,5× MMR przez ~1–2 godziny. Następnie usuń podłoże pipetą P1000 bez zakłócania zarodków i uzupełnij 15 mL 0,1× MMR.</li>
	<li>Pozwól zarodkom rozwinąć się w pożądane stadia, a następnie użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć supełki z mini zarodków.</li>
	<li>Zbieraj zarodki do pożądanej analizy, na przykład wizualizując ZGA w pojedynczych komórkach11,13.</li>
</ol>

<ol><li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+Characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30 (3), 675-686 (1982).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+II.+Control+of+the+onset+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription.</a> Cell. 30 (3), 687-696 (1982).</li>
<li>Kane, D. A., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+midblastula+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish midblastula transition.</a> Development. 119 (2), 447-456 (1993).</li>
<li>Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+zygotic+transcription+to+mitotic+control+at+the+Drosophila+mid-blastula+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition.</a> Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).</li>
<li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+nuclear+size+and+DNA+amount+contribute+to+midblastula+transition+timing+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis.</a> Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).</li>
<li>Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+the+nucleo-cytoplasmic+ratio+in+early+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development.</a> Cell. 44 (2), 365-372 (1986).</li>
<li>Chen, H., Qian, W., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+cellular+dimensions+with+cell+differentiation+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development.</a> Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).</li>
<li>Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction+in+preimplantation+mouse+embryos+is+regulated+by+a+cytoplasmic+regulatory+factor+that+alters+between+1-+and+2-cell+stages+in+a+concentration-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner.</a> J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).</li>
<li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145 (11), dev161257(2018).</li>
<li>Clute, P., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+appearance+of+division+asynchrony+and+microtubule-dependent+chromosome+cycles+in+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos.</a> Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).</li>
<li>Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterning+of+zygotic+genome+activation+in+a+model+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo.</a> Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+in+vitro+fertilization+and+natural+mating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).</li>
<li>Chen, H., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nascent+transcription+in+wholemount+vertebrate+embryos+to+characterize+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation.</a> Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).</li>
<li>Meaders, J. L., Burgess, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+mechanisms+of+pronuclear+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning.</a> Cells. 9 (2), 505(2020).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów.

Tutaj opisujemy metodę generowania mini-embrionów u Xenopus poprzez fizyczne zwężenie zarodków w stadium 1 komórki za pomocą splotów włosowych. To podejście dostarcza bezpośrednich dowodów na to, że zmniejszenie rozmiaru komórek indukuje ZGA w zarodkumodelowym 11.
Kilka aspektów tego protokołu jest kluczowych dla skutecznego generowania mini-embrionów. Aby zrobić supełki do włosów, ważne jest używanie cienkich, trwałych włosów, najlepiej tych dla niemowląt. Im ...

Jedną z najbardziej uderzających cech wczesnej embriogenezy jest wykładnicze zmniejszanie rozmiaru poszczególnych komórek w zarodku, który utrzymuje stałą objętość. Szybka synteza DNA i zmniejszenie rozmiaru komórek prowadzą do wzrostu stosunku nukleocytoplazmatycznego (stosunek N:C), który odgrywa ważną rolę w regulacji kilku kluczowych aktywności przejścia środkowego blastuli (MBT) w modelowych układach embrionalnych, w tym transkrypcji genów zygotycznych, wydłużenia cyklu komórkowego oraz ruchliwości komórek 1,2,3,4 . Manipulacje stosunkiem N:C poprzez zmianę ploidii DNA potwierdzają jego funkcjonalne znaczenie we wczesnej embriogenezie w kilku systemach modelowych 3,4,5,6.
Fizyczna manipulacja rozmiarem zarodka stanowi ważną technikę badania mechanizmów regulacyjnych we wczesnym rozwoju embrionalnym7. Usuwanie cytoplazmatyczne przez aspirację, które zmienia stosunek N:C we wczesnych zarodkach myszy, indukuje przedwczesne zagęszczenie8. Co więcej, zmniejszenie wielkości zarodka danio pręgowanego przez cięcie ujawniło nowy mechanizm gradientowy skalowania somitu9. Ponadto zmniejszenie objętości cytoplazmatycznej w embrionach Xenopus ujawniło zależną od stosunku N:C dynamikę cyklu komórkowego10. Co ważne, poprzez generowanie mini embrionów Xenopus poprzez redukcję rozmiaru komórek i oznaczanie początkujących transkryptów 5-etynylo-urydyną (5-EU) w pojedynczych komórkach, wykazaliśmy, że zmniejszenie rozmiaru komórek indukuje aktywację genomu zygoticznego (ZGA) w sposób zależny od dawki11. Wyniki te potwierdzają kluczową rolę wielkości komórek we wczesnej embriogenezie.
Tutaj opisujemy szczegółową procedurę generowania mini embrionów Xenopus laevis poprzez fizyczną manipulację za pomocą węzłów do włosów (Rysunek 1)10,11. Podejście to opiera się na podstawowym zastosowaniu Newporta i Kirschnera (1982) zwężania pętli włosowej na wczesnych zarodkach Xenopus 1, dostarczając jasny i wiarygodny protokół generowania mini embrionów jako narzędzi eksperymentalnych. Dodatkowo ta metoda jest stosowalna w innych systemach embrionalnych7, co ułatwia odkrywanie nowych mechanizmów wczesnej embriogenezy.

<table><tbody><tr><td>Igła 30-G</td><td>BD Medical</td><td>305128</td><td>Do przebijania embrionów</td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego 60 mm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>Do inkubujących się zarodków</td></tr><tr><td>Stereomikroskopy ACCU-SCOPE 3075 Zoom</td><td>VWR</td><td>470351-130</td><td>Do wizualizacji zarodków</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9414</td><td>Do powlekania szalek Petriego</td></tr><tr><td>Pinceta Dumont, styl 5</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72701-D</td><td>Do dopracowywania i przechowywania embrionów</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0300-10</td><td>Do inkubujących się zarodków</td></tr><tr><td>TipOne Pipette Tip, 10 & micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3700</td><td>Do mocowania węzłów do włosów</td></tr><tr><td>Blok woskowy,</td><td>Carolina Biological Supply Co.</td><td>974228</td><td>Do mocowania węzłów do włosów</td></tr></tbody></table>

manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów xenopusa

Physical Manipulation to Generate Xenopus Mini Embryos

Cechą charakterystyczną wczesnej embriogenezy jest szybkie, wykładnicze zmniejszanie rozmiaru pojedynczych komórek, podczas gdy całkowita objętość zarodka pozostaje stała. Stosunek nukleocytoplazmatyczny (N:C) odgrywa kluczową rolę w regulacji aktywności komórkowej i molekularnej niezbędnej do wczesnej embriogenezy. Fizyczna manipulacja rozmiarem zarodka stanowi zatem ważny sposób badania tych mechanizmów rozwojowych. Duży rozmiar (~ 1,2 mm średnicy) oraz wysoka plastyczność rozwojowa wczesnych zarodków Xenopus laevis czynią je idealnym modelem do fizycznej sekcji i manipulacji w celu analizy mechanizmów regulacyjnych rozwoju. Tutaj opisujemy podejście do generowania mini embrionów o zmienionej objętości cytoplazmatycznej i stosunku N:C poprzez zwężenie jednokomórkowych zarodków Xenopus laevis za pomocą węzłów włosowych. Uzyskane mini embriony wykazano, że inicjują wczesną aktywację genomu zygoticznego (ZGA), bezpośrednio wywołaną przez zmniejszenie wielkości komórek i wzrost stosunku N:C. Te mini embriony, które można uogólnić na inne systemy embrionalne, stanowią zatem unikalne, potężne narzędzie do rozkładania mechanizmów wczesnego rozwoju zarodków zależnych od rozmiaru.

Zarodki Xenopus laevis w stadium jednokomórkowym były zwężone przez węzły włosowe, jak opisano powyżej. Kontrolne i mini zarodki w ~Stadium 9 (8,5 hpf przy 23 °C) zostały zobrazowane pod stereomikroskopem. Jak pokazano na Rysunku 2, objętość niektórych mini zarodków jest ~1/3 objętości zarodków kontrolnych. Ten wynik sugeruje, że wczesne zarodki Xenopusa mogą być manipulowane w celu generowania mini embrionów, co stanowi unikalny model do badania wpływu wielkości komórek na...

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

A defining characteristic of early embryogenesis is the rapid, exponential decrease in individual cell size while the overall embryo volume remains ...

Nasze badania analizują, jak rozmiar komórek reguluje wczesną aktywację genomu embrionalnego poprzez fizyczne generowanie miniaturowych embrionów na początku wczesnego rozwoju. Istniejące metody, takie jak bezpośrednia ocena rozmiaru, wpływają na aktywację genomu, a ta metoda rozwiązuje ten problem poprzez bezpośrednią zmianę rozmiaru jednego zarodka komórki. Na początek przygotuj węzły do włosów do zwężania zarodków, przecinając cienkie włosy na około pięć centymetrów.Za pomocą pęsety włóż jeden koniec włosów do końcówki P10 na głębokości około jednego centymetra. Następnie weź wosk na łyżkę i podgrzej go, żeby się rozpuścił. Szybko zanurz końcówkę P10 z włosami w wosku i pozwól wyschnąć przez minutę.Upewnij się, że włosy są utrwalone na końcu końcówki P10. Użyj pęsety, aby ostrożnie zrobić supeł z włosów nad głową. Dostosuj rozmiar pętli do około 1,5 milimetra.Przytnij zwisające włosy. Na początek należy uzyskać zarodki Xenopusa wygenerowane standardowymi procedurami in vitro i mikroiniekcjonowane pięcioma urydynami etanolu do oznaczania początkujących transkryptów. Następnie dodaj 15 mililitrów medium gradientowego o gęstości 3% zawierającego 0,5x MMR do wcześniej przygotowanej 60-milimetrowej szalki Petriego pokrytej agarozą.Godzinę po zapłodnieniu przenieś zarodki do szalki Petriego. Pod mikroskopem stereo użyj pęsety, aby obrócić zarodek o około 45 do 60 stopni, aby uzyskać dostęp do bieguna roślinnego. Trzymaj zarodek pęsetą, a w drugiej ręce delikatnie przekłuj wędkę roślinną igłą 30 gauge.Umieść węzeł do włosów przymocowany do końcówki P10 na zarodku tak, aby zwierzęcy pręt znowu był zamknięty w węzełku. Dostosuj pozycję węzła do wielkości mini zarodka. Używając końcówki pipety P10 i pęsety, pociągnij końce węzłów w przeciwnych kierunkach, aby zacisnąć je wokół zarodka między zwierzęciem a wędkiem roślinnym.Delikatnie dociśnij zarodek i uwolnij trochę cytoplazmy. Następnie przetnij węzeł w miejscu, gdzie przyczepia się do końcówki P10. Po wygenerowaniu wymaganej liczby mini embrionów pozwól im leżeć w ośrodku gradientu 3% gęstości przez około jedną do dwóch godzin.Następnie pipetą P1000 usuń podłoże bez zakłócania zarodków i dodaj 15 mililitrów 0,1x MMR. Gdy zarodki osiągną pożądane stadia, usuń supły włosowe. Mikroskopowe zdjęcie zarodków uzyskane 8,5 godziny po zapłodnieniu wykazało, że objętość niektórych mini zarodków była około jednej trzeciej objętości zarodków kontrolnych, co sugeruje, że wczesne zarodki Xenopus mogą być manipulowane do tworzenia mini embrionów.Najważniejszym wyzwaniem podczas realizacji tego protokołu jest podwiązanie jednokomórkowych zarodków, aby stworzyć mini embriony. Mini embriony uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być wykorzystywane w obrazowaniu i sekwencjonowaniu w badaniach mechanistycznych. Przyszłe badania mogłyby zbadać, jak wielkość zarodków i komórek reguluje wczesny rozwój oraz mechanizmy leżące u podstaw.

physical-manipulation-to-generate-xenopus-mini-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Ten film demonstruje procedury używane do hodowli pierwotnych kultur embrionalnych komórek nerwowych i mięśniowych Xenopus oraz przydatność tego preparatu do jednoczesnego wykonywania nagrań pre- i post-synaptycznych klamerów.

Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Opracowano metodę ilościowego określania wielkości i kształtu zarodków Xenopus laevis. W tym protokole tradycyjne pomiary wielkości są połączone z morfometrią geometryczną, aby umożliwić bardziej wyrafinowane analizy rozwoju i wad ustno-twarzowych.

Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Poznaj metodę generowania miniembrionów Xenopus laevis poprzez fizyczną manipulację węzłami włosów, zwiększającą stosunek N:C i aktywującą wczesną transkrypcję genów. Ta technika pozwala badać mechanizmy rozwoju zależne od wielkości komórki.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

Przeglądaj więcej filmów