Name: Zgromadzenie i użycie gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin do badań nad interakcją roślina-mikrob w zbożach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj system gnotobiotyczny GNOVA do badań nad interakcjami roślina-mikrob w zbożach. Ta metoda umożliwia hodowlę pszenicy i kukurydzy z kontrolowanym nawadnianiem, zapewniając 100% kiełkowanie i lepszy wzrost.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie to było sfinansowane przez Fundację Novo Nordisk (INTERACT, Numer grantu: NNF19SA0059360) oraz Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych w ramach kontraktu nr 2022-67013-36672.

<ol><li>Batista, B. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realities+and+hopes+in+the+application+of+microbial+tools+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Realities and hopes in the application of microbial tools in agriculture.</a> Microbial Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Parnell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+Lab+to+the+Farm%3A+An+Industrial+Perspective+of+Plant+Beneficial+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">From the Lab to the Farm: An Industrial Perspective of Plant Beneficial Microorganisms.</a> Frontiers in Plant Science. , (2016).</li>
<li>Busby, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+priorities+for+harnessing+plant+microbiomes+in+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture.</a> PLOS Biology. , (2017).</li>
<li>Compant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+plant+microbiome+for+sustainable+crop+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing the plant microbiome for sustainable crop production.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2025).</li>
<li>Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Causality%3A+Opportunities+of+Synthetic+Communities+for+Plant+Microbiome+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Establishing Causality: Opportunities of Synthetic Communities for Plant Microbiome Research.</a> Cell Host and Microbe. , (2017).</li>
<li>Liu, Y. X., Qin, Y., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductionist+synthetic+community+approaches+in+root+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Basic, M., Bleich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotics%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotics: Past, present and future.</a> Laboratory Animals. , (2019).</li>
<li>Williams, S. C. P. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2014).</li>
<li>Bennett, R. A., Lynch, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Growth+and+Development+in+the+Rhizosphere+of+Gnotobiotic+Cereal+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Growth and Development in the Rhizosphere of Gnotobiotic Cereal Plants.</a> Microbiology. , (1981).</li>
<li>Lindberg, T., Granhall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylene+reduction+in+gnotobiotic+cultures+with+rhizosphere+bacteria+and+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Acetylene reduction in gnotobiotic cultures with rhizosphere bacteria and wheat.</a> Plant and Soil. , (1986).</li>
<li>Maplestone, P. A., Campbell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+roots+of+wheat+seedlings+by+bacilli+proposed+as+biocontrol+agents+against+take-all%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Colonization of roots of wheat seedlings by bacilli proposed as biocontrol agents against take-all.</a> Soil Biology and Biochemistry. , (1989).</li>
<li>Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+System+for+Studying+Rhizosphere+Colonization+by+Plant+Growth-Promoting+Pseudomonas+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MPMI%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic System for Studying Rhizosphere Colonization by Plant Growth-Promoting Pseudomonas Bacteria.</a> MPMI. , (1996).</li>
<li>Walley, F. L., Germida, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+spring+wheat+to+interactions+between+Pseudomonas+species+and+Glomus+clarum+NT4%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+and+Fertility+of+Soils%22%5BJournal%5D)">Response of spring wheat to interactions between Pseudomonas species and Glomus clarum NT4.</a> Biology and Fertility of Soils. , (1997).</li>
<li>Ma, K. W., Ordon, J., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+Plant+Systems+for+Reconstitution+and+Functional+Studies+of+the+Root+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic Plant Systems for Reconstitution and Functional Studies of the Root Microbiota.</a> Current Protocols. , (2022).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2017).</li>
<li>Hsu, P. C. L., O’Callaghan, M., Condron, L., Hurst, M. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+gnotobiotic+plant+assay+for+assessing+root+colonization+and+mineral+phosphate+solubilization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Use of a gnotobiotic plant assay for assessing root colonization and mineral phosphate solubilization.</a> Plant and Soil. , (2018).</li>
<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Glass+Jar+System+for+Semihydroponic+Root+Exudate+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Versatile Glass Jar System for Semihydroponic Root Exudate Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2023).</li>
<li>Miebach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Litterbox%E2%80%94A+gnotobiotic+Zeolite-Clay+System+to+Investigate+Arabidopsis%E2%80%93Microbe+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Litterbox—A gnotobiotic Zeolite-Clay System to Investigate Arabidopsis–Microbe Interactions.</a> Microorganisms. , (2020).</li>
<li>Salvato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Protein+Extraction+Methods+for+Metaproteomic+Analyses+of+Root-Associated+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Protein Extraction Methods for Metaproteomic Analyses of Root-Associated Microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. , (2022).</li>
<li>Kawasaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sterile+hydroponic+system+for+characterising+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A sterile hydroponic system for characterising root exudates.</a> Plant Methods. , (2018).</li>
<li>Kremer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peat-based+gnotobiotic+plant+growth+systems+for+Arabidopsis+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Peat-based gnotobiotic plant growth systems for Arabidopsis microbiome research.</a> Nature Protocols. , (2021).</li>
<li>Nezhad, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecosystem+Fabrication+protocols+for+plant-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ecosystem Fabrication protocols for plant-microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoFAB+3.0%3A+a+sterile+system+for+studying+sorghum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">EcoFAB 3.0: a sterile system for studying sorghum.</a> Frontiers in Plant Science. , (2024).</li>
<li>Verma, S. K., et al. Exploring Endophytic Communities of Plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerma%2C+SK+%22Seed+Endophytes%3A+Biology+and+Biotechnology%22">Seed Endophytes: Biology and Biotechnology</a>. , Springer. Cham. (2019).</li>
<li>Parnell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Seed+Sterilization+Methods+Require+Optimization+Across+Maize+Genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Phytobiomes+Journal%22%5BJournal%5D)">Effective Seed Sterilization Methods Require Optimization Across Maize Genotypes.</a> Phytobiomes Journal. , (2024).</li>
<li>Lee, J., Kim, H. S., Jo, H. Y., Kwon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+soil+bacterial+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Revisiting soil bacterial counting methods.</a> PLOS One. , (2021).</li>
<li>Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+single+plate-serial+dilution+spotting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of single plate-serial dilution spotting method.</a> Biotechnology Reports. , (2015).</li>
<li>Munkager, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AgNO3+Sterilizes+Grains+of+Barley+without+Inhibiting+Germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">AgNO3 Sterilizes Grains of Barley without Inhibiting Germination.</a> Plants. , (2020).</li>
<li>Wagner, M. R., et al. Microbe-dependent heterosis in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2021).</li>
<li>Poorter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pot+size+matters%3A+effects+of+rooting+volume+on+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pot size matters: effects of rooting volume on plant growth.</a> Functional Plant Biology. , (2012).</li>
<li>Ferrante, A., Mariani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agronomic+management+for+enhancing+plant+tolerance+to+abiotic+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Agronomic management for enhancing plant tolerance to abiotic stresses.</a> Horticulturae. , (2018).</li>
<li>Vollmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Gas+Exchange+Rate+and+Vessel+Type+on+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Effect of Gas Exchange Rate and Vessel Type on plant growth.</a> Plants. , (2024).</li>
<li>Cardoso, E. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+health%3A+suitable+indicators+for+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Agricola%22%5BJournal%5D)">Soil health: suitable indicators for assessment.</a> Scientia Agricola. , (2013).</li>
<li>Sinclair, T. R., Ludlow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+soil+water+supply+on+plant+water+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of soil water supply on plant water balance.</a> Australian Journal of Plant Physiology. , (1986).</li>
<li>Döll, S., Koller, H., van Dam, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+collecting+root+exudates+from+soil+grown+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Protocol for collecting root exudates from soil grown plants.</a> Rhizosphere. , (2024).</li>
<li>Williams, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+root+exudate+collection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparing root exudate collection techniques.</a> Soil Biology and Biochemistry. , (2021).</li>
<li>Carlström, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains.</a> Nature Ecology and Evolution. , (2019).</li>
<li>Seethepalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhizoVision+Explorer%3A+software+for+root+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+Plants%22%5BJournal%5D)">RhizoVision Explorer: software for root image analysis.</a> AoB Plants. , (2021).</li>
<li>Pace, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+maize+seedling+roots+using+ARIA%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of maize seedling roots using ARIA.</a> PLOS One. , (2014).</li>
<li>Jensen, T. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+DNA+extraction+and+metagenome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput DNA extraction and metagenome preparation.</a> PLOS One. , (2024).</li>
<li>Romero-Salas, E. A., Ibarra-Sánchez, C. L. Isolation of Metagenomic DNA from Plant Roots. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRomero-Salas%2C+EA+%22Plant+Microbiome+Engineering%22">Plant Microbiome Engineering</a>. , Springer. New York. (2025).</li>
<li>Su, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+metagenome-assembled+genomes+from+rice+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Recovery of metagenome-assembled genomes from rice phyllosphere.</a> Scientific Data. , (2022).</li>
<li>Northen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+standards+for+synthetic+communities+in+plant%E2%80%93microbiota+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Community standards for synthetic communities in plant–microbiota research.</a> Nature Microbiology. , (2024).</li>
<li>Poursalavati, A., Javaran, V. J., Laforest-Lapointe, I., Fall, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+Metatranscriptomics%3A+improved+RNA+extraction+method%5BTitle%5D)+AND+%22Phytobiomes+Journal%22%5BJournal%5D)">Soil Metatranscriptomics: improved RNA extraction method.</a> Phytobiomes Journal. , (2023).</li>
<li>Vannier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-resolved+metatranscriptomics+reveals+conserved+root+colonization+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome-resolved metatranscriptomics reveals conserved root colonization determinants.</a> Nature Communications. , (2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. Extraction of Proteins from Soil. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZheng%2C+L+%22Metaproteomics%3A+Methods+and+Protocols%22">Metaproteomics: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. (2024).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+physiological+and+proteomic+response+to+phosphate+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative physiological and proteomic response to phosphate deficiency.</a> Journal of Proteomics. , (2023).</li>
<li>Rieusset, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-metabolomic+approach+in+wheat%E2%80%93Pseudomonas+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Cross-metabolomic approach in wheat–Pseudomonas interaction.</a> Metabolites. , (2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite-mediated+responses+of+phyllosphere+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Metabolite-mediated responses of phyllosphere microbiota.</a> Microbiology Spectrum. , (2023).</li>
<li>Swenson, T. L., Northen, T. R. Untargeted Soil Metabolomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwenson%2C+TL+%22Microbial+Metabolomics%3A+Methods+and+Protocols%22">Microbial Metabolomics: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. (2019).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tu system gnotobiotyczny dla roślin, GNOVA, zapewnia przystępne i wszechstronne narzędzie do badania interakcji roślina–mikrob w uprawach zbożowych. Jego kluczowe cechy obejmują zwiększoną zdolność wzrostu i wbudowane nawadnianie, przedłużające wzrost zbóż poza stadium siewek w sterylnych warunkach. Osiągi tego systemu są porównywalne z EcoFAB 3.0 i zapewniają przystępną alternatywę dla gnotobiotycznego systemu roślin. System jest zbudowany z dostępnych w handlu komponentów wybranych pod względem kosztów, prostoty i zgodności ze średniej wielkości autoklawami, co ułatwia wprowadzenie do laboratoriów. Montaż i eksploatacja są proste i nie wymagają specjalistycznego sprzętu, co zmniejsza bariery wdrażania. GNOVA może być dostosowany do różnych celów badawczych dzięki kompatybilności z szeroką gamą podłoży glebowych, protokołów sterylizacji nasion, inokulantów mikrobiowych (wolnych od zaraz, SynCom lub naturalna społeczność) i różnorodnych analiz dolnoprądowych.
Minimalne zanieczyszczenie jest niezbędne w eksperymentach gnotobiotycznych z roślinami, aby upewnić się, że obserwowane efekty można przypisać mikrobom interesującym nas i nie zarazeniom. Prosty działanie GNOVA zmniejsza ryzyko skażenia. Ściśle przestrzegać techniki aseptycznej i następujących kluczowych zaleceń, aby zapewnić utrzymanie sterylności. Podczas przygotowywania eksperymentu zalecamy dezynfekcję kaptura laminarnego między inokulantami mikrobicznymi, aby zminimalizować wzajemne skażenie traktowań. Kolejność, w której stosuje się traktowania, może również zmniejszyć wzajemne skażenie. Stosowane traktowanie wolne od zaraz przed jakimkolwiek żywym traktowaniem mikrobicznym jest idealne. Obce mikroby mogą również być wprowadzane przez nasiona. Protokoły sterylizacji nasion powinny zatem być zoptymalizowane dla każdego gatunku rośliny lub źródła nasion, aby zbilansować sterylność i kiełkowanie26. Protokoły sterylizacji dla niemodelowych zbożowych, takich jak sorgo24, jęczmień29, trawa przełącznikowa i owies23, mogą być łatwo wdrożone w GNOVA. Jeśli sterylizacja negatywnie wpływa na kiełkowanie, można użyć nasion wstępnie wykiełkowanych. Nawadnianie stanowi główne źródło skażenia w systemach gnotobiotycznych. Najbardziej krytycznym punktem w tym procesie jest przymocowanie filtrów do linii nawadniających. Końcówki przewodów linii nawadniających i filtrów muszą pozostać sterylne przez cały proces. Sterylizacja płomieniem wymaga zręczności i może być pracochłonna, szczególnie w dużych eksperymentach (n >50). Dlatego alternatywna metoda na bazie wybielacza jest zalecana dla dużych eksperymentów lub gdy sterylizacja płomieniem nie jest praktyczna. Zachowanie dodatkowych sterylnych filtrów i posiadanie wybielacza lub etanolu podczas nawadniania jest również zalecane na wypadek skażenia podczas obsługi materiałów systemu. Ponadto, zaleca się mocne uwzględnienie jednostek kontroli skażenia (tzn. bez rośliny, bez mikroba, traktowanie i odbiór nawadniania) w celu monitorowania sterylności i identyfikacji skażeń.
Aby przeciwdziałać ryzyku skażenia podczas nawadniania, najwcześniejsze systemy gnotobiotyczne dla roślin były całkowicie zamknięte i nie posiadały możliwości nawadniania, co ograniczyło czas trwania eksperymentów. Kukurydza była uprawiana gnotobiotycznie w torebkach19,30, szklanych rurek i naczyń Petriego15 między dwoma a czterema tygodniami. Aby uzupełniać wodę i składniki odżywcze podczas wzrostu roślin, alternatywne systemy takie jak EcoFAB23, FlowPot i GnotoPot21 umożliwiają nawadnianie poprzez częściowe demontaż w kapturach laminarnych. Ograniczyło to ich rozmiar i kompatybilność z większymi roślinami. Ponieważ linie nawadniające są łatwo dostępne poza GNOVA, demontaż nie jest wymagany, a system nie jest ograniczony do rozmiarów kaptura laminarnego. To nie tylko umożliwia ciągłą dostawę składników odżywczych i wody, ale także zwiększa dostępną przestrzeń do wzrostu. Zmniejszona przestrzeń dla pędów może zmniejszyć zdolność fotosyntetyczną i przyczynić się do zahamowania wzrostu24, a ograniczenie objętości korzeni może prowadzić do wiązania się korzeni i zmniejszać pobieranie wody i składników odżywczych31. Połączenie małej przestrzeni do wzrostu i brak nawadniania w systemie torebkowym może wyjaśniać zmniejszoną biomasę i brak postępów fenologicznego kukurydzy i pszenicy w porównaniu z systemem GNOVA. Ten nowy system umożliwił gnotobiotyczny wzrost kukurydzy przez czas porównywalny z sorgo w EcoFAB 3.024. Co więcej, przewyższa gnotobiotyczny wzrost pszenicy przez cztery tygodnie w systemie hydroponicznym (20) w bardziej reprezentatywnym systemie glebowym. Oprócz fizycznych ograniczeń, systemy gnotobiotyczne często polegają na ograniczonym przepływie powietrza, aby utrzymać steryl

Opracowania rolnicze oparte na drobnoustroju wzbudzają znaczące zainteresowanie od kilku ostatnich dekad ze względu na ich potencjał polepszenia wydajności upraw poprzez poprawę wzrostu roślin i odporności na stres środowiskowy. Jednocześnie mechanizmy działania molekularnego tych biostymulantów pozostają słabo poznane, co może przyczyniać się do ich niekonsekwentnych wyników w różnych glebach, lokalizacjach i warunkach środowiskowych1,2. Popieranie poprawy efektywności istniejących opracowań opartych na drobnoustroju oraz rozwój nowych technologii wymaga głębszego zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji roślina–mikrob3,4. Jednakże rozdzielanie tych mechanizmów pozostaje wyzwaniem z powodu złożoności naturalnych społeczności mikrobiologicznych5,6. Aby zidentyfikować drobnoustroje i interakcje mikrobialne napędzające korzyści dla roślin, możemy zmniejszyć złożoność naturalnych systemów poprzez zastosowanie syntetycznych społeczności mikrobiologicznych (SynComs) w systemach wzrostowych, które pozwalają na kontrolowanie warunków środowiskowych i społeczności mikrobiologicznej. Gnotobiologię, badanie gospodarzy związanych z określonymi społecznościami mikrobiologicznymi7, pozwala badaczom porównywać wolne od zaraz gospodarzy z tymi skolonizowanymi znanymi społecznościami mikrobiologicznymi w celu powiązania funkcji mikrobiologicznej z fenotypem rośliny8.
Wczesne systemy gnotobiotyczne były budowane za pomocą szklanych probówek9,10,11,12 i słoików13. Od tego czasu, zobaczyliśmy szybki rozwój nowych systemów opracowanych do badania roślin gnotobiotycznie. Najczęściej stosowane systemy dziś obejmują użycie naleśników Petriego14, probówek15,16, szklanych słoików17, magenta boxów18, uszczelnionych torebek19, hydroponicznych20, FlowPot i GnotoPot21, systemów mikrofluidycznych22 i EcoFAB23. Mimo tego postępu, większość systemów jest albo zoptymalizowana pod kątem obrazowania22 lub zbierania eksudatów17,20 albo zaprojektowana dla małych gatunków modelowych14,18,21. Wiele to zamknięte systemy, które ograniczają kontrolę nawadniania i czas trwania eksperymentu. Te ograniczenia stanowią wyzwanie dla badań nad większymi roślinami rolniczymi, takimi jak zboża, które wymagają dodatkowego miejsca, przepływu powietrza i zarządzania wodą.
Rozumiejąc potrzebę systemu, który może pomieścić większe rośliny i dłuższe badania, ostatnio opracowano EcoFAB 3.0, aby rozszerzyć gnotobiotyczne uprawy na większe rośliny24. EcoFAB 3.0 oferuje większy objętość korzeni i przestrzeni głowowej, co wspiera wzrost Sorghum bicolor do 4 tygodni i pozwala na zbieranie eksudatów i obrazowanie korzeni24. Mimo że ten nowy system jest obiecującym przykładem rozszerzenia gnotobiotycznych systemów na uprawy rolnicze, nadal istnieje potrzeba dostępnej i wszechstronnej platformy, która może być łatwo przyjęta w laboratoriach i jest kompatybilna z szerokim zakresem przepływów eksperymentów. Z tego powodu opracowałyśmy GNOVA (GNotobiotic system for Versatile plant Applications), system zaprojektowany do akomodacyjnia upraw zbożowych w warunkach gnotobiotycznych. Tutaj, dostarczamy szczegółowy protokół montażu i eksploatacji GNOVA oraz demonstrujemy jego wydajność w porównaniu z gnotobiotycznym systemem torebkowym rutynowo używanym w naszym laboratorium. Dzięki opracowaniu tego nowego systemu, poprawiliśmy zdolność do uprawiania pszenicy i kukurydzy w warunkach sterylnych, zapewniając większą przestrzeń do wzrostu i wbudowane nawadnianie w porównaniu z wcześniejszymi zamkniętymi systemami. Wydajność GNOVA jest porównywalna z EcoFAB 3.0, rozszerzając tym samym arsenał narzędzi do badania interakcji roślina—mikrobiota u nie-modelowych upraw zbożowych. Co więcej, wszechstronność i przystosowawczość gnotobiotyki roślin są zwiększone przez prosty projekt GNOVA, użycie komercyjnie dostępnych materiałów i dostępne pliki obiektów 3D, które pozwalają badaczom zmieniać materiały i projekt aby dostosować ich potrzeby badań i budżet.

<table><tbody><tr><td>Powerconnect cordless drill &amp; 100-Piece Kit</td><td>Black+Decker</td><td>BDC120VA100</td><td>1/4" and 1/8" drill bits needed. </td></tr><tr><td>Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards </td><td>3M</td><td>471</td><td>Consumable material</td></tr><tr><td>Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)</td><td>Amazon</td><td>B001I1QO00</td><td>Consumable material. </td></tr><tr><td>Wheat seed</td><td></td><td></td><td>Cultivar used in this experiment: Catawba</td></tr><tr><td>Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)</td><td>Lowe's</td><td>28930</td><td>Cut into 2 7/8 " (7.3 cm) diam circles. Consumable material. For high throughput production of circles roll out the wrap insulation and use the open edge of the pot to cut the circle by placing the pot on top of the insulation wrap and applying pressure and twisting. </td></tr><tr><td>DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)</td><td>Class Biological Clean, Ltd</td><td>NA</td><td>Cut into 6.3 " (16.02 cm) diam circles. CBC has other pre-cut or standard roll sizes that can be purchased instead if desired.  Consumable material. cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area of the DW4 media and cut with scissors.</td></tr><tr><td>Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thickness</td><td>Saint-Gobain</td><td>ABX00007</td><td>Cut into two long pieces ( 16" // 40.64 cm) and three short pieces (2.5" // 6.35 cm) </td></tr><tr><td>Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solution</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Dilute to 2% v/v and use for maize sterilization protocol</td></tr><tr><td>Murashige &amp; Skoog medium, micro and macro elements. 25 L</td><td>Research Products International</td><td>M10200-25.0</td><td>Diluted to 0.5x strength</td></tr><tr><td>Ethanol, 100%, Deacon Labs</td><td>Fisher scientific</td><td>04-355-451</td><td>Diluted to 95% v/v</td></tr><tr><td>Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-817-117</td><td>Discard plunger and only keep the barrel, fill with glass wool and cap with foil.</td></tr><tr><td>Glass beakers, 250 mL </td><td>VWR</td><td>470191-150</td><td>Five are needed for wheat seed sterilization</td></tr><tr><td>Maize seed</td><td></td><td></td><td>Genotype used in this experiment: Mexico 21–22 B73XMo17</td></tr><tr><td>Aluminum baking tray 18" x 26" </td><td>Amazon</td><td>B01FIK54LQ</td><td>Make sure it fits the dimensions of your flow hood</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-1</td><td>Prepare 0.145 M solution.</td></tr><tr><td>3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)</td><td>Protolabs</td><td>NA</td><td>Printing and editable files can be found in supplemental materials. Files available at Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. DO NOT AUTOCLAVE if PLA was used as filament to produce the base. PLA will melt above 150 °C and can get deformed above 60 °C. It is recommended that the integrity of the PLA 3D printed base is tested if it is to be used at temperatures above 40 °C. For higher heat resistance materials such as PETG (Polyethylene Terephthalate Glycol) or PC (polycarbonate) can be used instead; this will increase the cost of the part and might still not be autoclaveable. 3D printing of the base prototypes were accomplished in a personal printer with build volumes of of 256 × 256 × 256 mm (length × width × height). For speed and cost efficiency we recommend printing in bulk at local commercial 3D-printing service providers. </td></tr><tr><td>Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-69</td><td>Refered as fitting 1 in the protocol</td></tr><tr><td>Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-63</td><td>Refered as fitting 2 in the protocol</td></tr><tr><td>201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)</td><td>Grainger</td><td>5CZF2</td><td>Refered as hose clamps in protocol</td></tr><tr><td>Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 " </td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120707</td><td>Refered as laminar flow hood in protocol. Any laminar flow hood with similar dimensions works. Modifications might be needed in smaller flow hoods. </td></tr><tr><td>Play sand, Quikrete Premium. 50 lb</td><td>The Home Depot</td><td>1001709466</td><td>Refered as sand in protocol</td></tr><tr><td>304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)</td><td>Amazon</td><td>B09KRS5F7T</td><td>Refered as stainless steel wire mesh in article. Cut into 4.7" (11.9 cm) diameter circles. For high troughput or circle production, cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area woven mesh of the woven mesh and cut with scissors. </td></tr><tr><td>Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scented</td><td>Grainger</td><td>44Z111</td><td>Refered in protocol as clay. Consumable material.</td></tr><tr><td>Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)</td><td>WCG International</td><td>HST0430</td><td>Refered in protocol as glass cylinder</td></tr><tr><td>Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam  (1 per system)</td><td>ClearTec Packaging</td><td>PCC3.000</td><td>Refered in protocol as plastic cap</td></tr><tr><td>Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length  (1 per system)</td><td>ePlastics</td><td>PCTUB3.000X2.875</td><td>Refered in protocol as pot. Can request company to cut to other desired lengths.</td></tr><tr><td>Cleanroom sterlization wrap, 6" x 6" (1 per system)</td><td>Fisher scientific</td><td>17-101-102</td><td>Refered in protocol as sterilization wrap. Consumable material.</td></tr><tr><td>Dissecting forceps, Medium serrated tip 4 1/2" length</td><td>VWR</td><td>82027-398</td><td>Refered in protocol as tweezers.</td></tr><tr><td>Tea strainers</td><td>Amazon</td><td>B0FRMRZWZY</td><td>Three are needed for wheat seed sterilization</td></tr><tr><td>Clorox bleach with 5.7% available chlorine</td><td>The Home Depot</td><td>1005131

zgromadzenie i użycie gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin do badań nad interakcją roślina-mikrob w zbożach

Assembly and Use of a Plant Gnotobiotic Growth System for Plant&#8211;Microbe Interaction Studies in Cereals

Rozwój mikrobiologicznych modyfikacji rolniczych, które działają spójnie na polu, wymaga zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji roślina-mikrob. Badanie tych podstawowych mechanizmów interakcji wymaga możliwości uprawiania roślin w warunkach sterylnych i gnotobiotycznych (tj. wszystkie mikroorganizmy współpracujące z rośliną są znane, czy chodzi o wolne od zarodników, zdefiniowane społeczności mikrobiologiczne, czy naturalne społeczności). Obecnie dostępne systemy gnotobiotyczne dla roślin nie nadają się do badania dużych roślin o znaczeniu rolniczym, takich jak zboża. Co więcej, większość tych systemów nie posiada możliwości zarządzania nawadnianiem. Wprowadzamy tutaj GNOVA, nowy system gnotobiotyczny zaprojektowany do akomodacyjnego rosnącej zbóż z możliwością zarządzania nawadnianiem. Ten nowy system to dostępna platforma składająca się z 3D drukowanej podstawy i komercyjnie dostępnych materiałów. Ten protokół zapewnia krok po kroku przewodnik po montażu systemu i konfiguracji eksperymentu. Ponadto przedstawiamy porównanie wydajności GNOVA z systemem worków gnotobiotycznych. GNOVA wydłużył wzrost roślin z dwóch tygodni w systemie worków do 17 tygodni dla pszenicy i 4 tygodni dla kukurydzy. Współczynnik kiełkowania obu roślin również wzrósł w obrębie GNOVA z 66% do 100% dla pszenicy i z 75% do 100% dla kukurydzy. Pszenica rosnąca w obrębie GNOVA wykształciła kłosy, które były nieobecne u roślin tego samego wieku w systemie worków. Świeża waga kukurydzy rosnącej w GNOVA była o 594% wyższa niż w systemie worków. Ponadto wysokość pędów i długość korzeni kukurydzy były o 89% i 57% większe w systemie GNOVA niż w workach, odpowiednio. System GNOVA rozszerza zestaw narzędzi dostępnych dla naukowców do badania interakcji roślina-mikrobiota poza etapem siewek w zbożach poprzez zapewnienie większej przestrzeni do wzrostu i zarządzania nawadnianiem.

Opracowaliśmy GNOVA, nowy gnotobiotyczny system roślinny, który zapewnia sterylne i kontrolowane środowisko niezbędne do badania oddziaływań między roślinami a mikroorganizmami. Nowy system oferuje 24,4 cala (62 cm) pionowej przestrzeni dla pędów oraz doniczkę o pojemności 1,3 L, kompatybilną z wieloma podłożami glebowymi. W pełni zmontowany system ma około 3 stóp wysokości (92,4 cm) i 4,57 cala szerokości (11,6 cm) (Rycina 5A–C). W porównaniu z innymi systemami, posiada on największą pionową pojemność dla wzrostu pędów oraz drugą pod względem wielkości komorę korzeniową (Tabela uzupełniająca 1). GNOVA wymaga jedynie 0,0135 m2 powierzchni w komorze wzrostowej, dzięki czemu system ten jest kompaktowy i łatwy w obsłudze. System ten może być stosowany w komorach wzrostowych z prześwitem pionowym wynoszącym 1,22 m. Wszystkie komponenty tego systemu, z wyjątkiem wydrukowanej w technologii 3D podstawy, nadają się do autoklawowania i są kompatybilne z autoklawami o wymiarach 24 cali × 24 cale × 36 cali (szerokość × długość × wysokość; 61 cm × 61 cm × 91 cm). Upraszcza to konfigurację eksperymentalną poprzez wyeliminowanie konieczności ręcznej sterylizacji poszczególnych części. Ponadto większość komponentów tego systemu nadaje się do ponownego użycia, co sprawia, że koszt wykorzystania w jednym eksperymencie wynosi około 6 USD po początkowym koszcie konfiguracji wynoszącym 54 USD za jednostkę (Tabela uzupełniająca 2). Warunki środowiskowe wewnątrz GNOVA określono poprzez monitorowanie temperatury i wilgotności względnej systemu z tygodniową rośliną kukurydzy przez trzy dni. Temperatura wewnątrz GNOVA była średnio o +1,3 °C wyższa niż w komorze wzrostowej (Rycina uzupełniająca 1). Różnice w temperaturze wewnątrz systemu i komory były większe podczas cyklu świetlnego (średnio +2,5 °C) niż podczas cyklu ciemnego (średnio +0,4 °C). Wilgotność względna wewnątrz GNOVA wynosiła średnio 63%, w przeciwieństwie do 34% w komorze wzrostowej.
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig5.jpg" /> 
Rycina 5: Wizualizacje systemu GNOVA.&#160;(A) Model 3D końcowego projektu podstawy wsporczej (B) Przekrój poprzeczny modelu 3D podstawy wsporczej (C) Przekrój poprzeczny modelu 3D w pełni złożonego systemu GNOVA&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby zapewnić sterylność wewnątrz systemu, przeprowadziliśmy czwartotygodniową próbę systemów niepodlewanych i podlewanych bez roślin. Skażenie szklanego cylindra określono poprzez pobieranie próbek powyżej i poniżej pierścienia bawełnianego metodą wymazową na płytkach agarowych. Powyżej pierścienia bawełnianego nie zaobserwowano wykrywalnego wzrostu mikrobów przekraczającego trzy kolonie (tj. jedna kolonia na jedną trzecią pobranej powierzchni) zarówno w próbkach niepodlewanych (n=4), jak i podlewanych (n=6) (Supplemental Figure 2A). Poniżej pierścienia bawełnianego wzrost zaobserwowano w jednym powtórzeniu niepodlewanym, podczas gdy w systemach podlewanych nie wykryto wzrostu (Supplemental Figure 2B). Sugeruje to niski potencjał zanieczyszczenia szklanego cylindra, ponieważ wzrost mikrobów wystąpił jedynie w ograniczonej liczbie powtórzeń poniżej pierścienia bawełnianego, który nie ma kontaktu z rośliną. Skażenie gleby oceniono poprzez naniesienie rozcieńczeń seryjnych na płytki R2A (Supplemental Figure 2C). W obu warunkach nie stwierdzono istotnego wzrostu mikrobów, z wyjątkiem jednego powtórzenia podlewanego z nieocenialną liczbą jednostek tworzących kolonie z rozcieńczeń seryjnych (tj. &#60; 30 kolonii). Oprócz testów sterylności przeprowadziliśmy porównanie wydajności pszenicy i kukurydzy hodowanych w GNOVA z naszym standardowym gnotobiotycznym protokołem wzrostu trwającym dwa tygodnie w systemie workowym19. Aby zrozumieć wpływ niewielkiego rozmiaru i braku nawadniania na kondycję roślin, wydłużyliśmy okresy wzrostu w workach, aby odpowiadały okresom w GNOVA. Mimo że początkowa zawartość wody w glebie zastosowana podczas konfiguracji obu systemów była taka sama, system GNOVA otrzymywał cotygodniową fertygację, natomiast worki nie. We wszystkich porównaniach jako punkt odniesienia przyjęliśmy system workowy, ponieważ była to pierwotna konfiguracja gnotobiotyczna w naszym laboratorium. Zarówno pszenica, jak i kukurydza osiągnęły 100% kiełkowania w GNOVA, podczas gdy w systemie workowym pszenica osiągnęła tylko 67% (n = 3), a kukurydza 75% (n = 8) (Figure 6).
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig6.jpg" /> 
Rycina 6: Kiełkowanie pszenicy (n = 3) i kukurydzy (n = 8) w układzie GNOVA (fioletowy) oraz w układzie workowym (zielony).&#160;Wynik kiełkowania każdego powtórzenia jest przedstawiony jako punkty na osi y, oznaczone jako Brak kiełkowania lub Wykiełkowało dla każdego systemu gnotobiotycznego. Słupki reprezentują wskaźnik kiełkowania (%) każdego gatunku rośliny w różnych systemach.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig6large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Przeprowadzono również test wzrostu pszenicy i kukurydzy, aby określić maksymalny okres żywotnego wzrostu oraz kondycję roślin w systemie GNOVA. Mimo że nasz standardowy protokół dla worków przewiduje jedynie dwa tygodnie wzrostu, przedłużyliśmy okres wzrostu w workach powyżej dwóch tygodni, aby uzyskać lepsze porównanie obu systemów. Po dwóch tygodniach pszenica hodowana w GNOVA (n=3) osiągnęła już stadium wzrostu (GS) wg skali Zadoka 13 (Rysunek 7A), podczas gdy w worku pozostała na stadium GS11. W piątym tygodniu rośliny w systemach GNOVA osiągnęły stadium GS21, o czym świadczyło pojawienie się krzewień (Rysunek 7B). W przeciwieństwie do tego, w systemach workowych krzewienie nie wystąpiło, a rośliny pozostały w stadium GS13. Zahamowanie wzrostu oraz brak zmian fenologicznych w systemie workowym doprowadziły do zakończenia hodowli roślin w tym systemie w szóstym tygodniu. Rośliny pszenicy w GNOVA rosły przez kolejne pięć tygodni, podczas których zaobserwowano wzrost liczby liści i biomasy (Rysunek 7C). Choć po 12 tygodniach wzrostu w GNOVA biomasa pszenicy wizualnie wzrosła, u roślin zaczęły pojawiać się liście bardziej chlorotyczne, a objętość szklanego cylindra została całkowicie wypełniona przez biomasę roślinną (Rysunek 7D). Pszenicę hodowano przez kolejne dwa tygodnie (Rysunek 7E,F). Nie odnotowano jednak wizualnego przyrostu biomasy, w związku z czym test wzrostu zakończono po 17 tygodniach. Wzrost kukurydzy oceniano w systemie GNOVA przez cztery tygodnie i porównywano z kukurydzą hodowaną w workach (Rysunek 8A,B). W tym eksperymencie nasiona kukurydzy zostały wysterylizowane i wstępnie wykiełkowane przed wysianiem w systemie GNOVA lub w worku. Świeża masa pędów i korzeni kukurydzy różniła się istotnie między oboma systemami (test t dla dwóch prób, p-value &#60; 0.05, Tabela uzupełniająca 3). Kukurydza hodowana w GNOVA miała pędy i korzenie o średniej masie świeżej odpowiednio 11.2 g i 5.7 g (Rysunek 8C,D). Dla porównania, pędy i korzenie kukurydzy hodowanej w worku miały masy świeże odpowiednio 1.29 g i 1.15 g. Ogólnie rzecz biorąc, świeża biomasa kukurydzy hodowanej w GNOVA zwiększyła się o 593% w porównaniu z kukurydzą hodowaną w systemie workowym. Ponadto długość pędów i korzeni była istotnie większa w GNOVA niż w workach, odpowiednio o 89% i 57% (Rysunek 8E,F).
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig7.jpg" /> 
Rycina 7: Wzrost pszenicy w prototypie GNOVA.&#160;(A) Pszenica po dwóch tygodniach w stadium wzrostu (GS) wg skali Zadocka 13. (B) Porównanie pszenicy po pięciu tygodniach wzrostu w worku i w GNOVA. W GNOVA widoczne są pędy boczne (GS21), natomiast w worku ich brak (GS13). (C) Przyrost biomasy pszenicy w 10. tygodniu wzrostu. (D) Przyrost biomasy pszenicy w 13. tygodniu wzrostu z pojawieniem się liści chlorotycznych. (E) Dalszy przyrost biomasy pszenicy w 15. tygodniu wzrostu. F) Biomasa pszenicy zajmuje większość dostępnej objętości wzrostu w 17. tygodniu wzrostu.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig8.jpg" /> 
Rysunek 8: Wzrost kukurydzy w prototypie GNOVA (fioletowy) w porównaniu z systemem workowym (zielony).&#160;Słupki wskazują wartości średnie ± błąd standardowy (n=4) (A) Kukurydza hodowana przez cztery tygodnie w systemie GNOVA i systemie workowym. (B) Porównanie wielkości zebranych roślin hodowanych w systemie GNOVA i systemie workowym. (C) Świeża masa pędów (Średnia±SE). (D) Świeża masa korzeni (Średnia±SE). (E) Długość pędów (Średnia±SE). F) Długość korzeni (Średnia±SE).&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Dynamika czasowa wilgotności względnej i temperatury mierzonej wewnątrz GNOVA (kolor fioletowy) oraz komory wzrostowej (kolor pomarańczowy). Dane rejestrowano w odstępach pięciominutowych przez trzy dni. Dane wewnątrz GNOVA zapisywano przy użyciu siedmiotygodniowej rośliny kukurydzy. Obszary zacieniowane na jasnoniebiesko odpowiadają okresom nocnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Figure1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 2: Wzrost mikroorganizmów w wyniku testów sterylności GNOVA bez roślin bez nawadniania (Kontrola) oraz z nawadnianiem (Nawadniane). (A) Próbki z cylindra szklanego powyżej pierścienia bawełnianego. (B) Próbki z cylindra szklanego poniżej pierścienia bawełnianego. (C) Wysiewy seryjne rozcieńczeń próbek gleby na pojedynczych płytkach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Figure2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Porównanie cech systemu GNOVA z innymi istniejącymi systemami gnotobiotycznymi dla roślin (EcoFAB, pudła i worki magenta, FlowPot, GnotoPot oraz EcoFAB 3.0). Systemy porównano pod kątem kluczowych parametrów istotnych dla projektu doświadczalnego, takich jak maksymalna wysokość rośliny, pojemność objętości korzeni oraz kontrola nawadniania. Informacje zebrano z opublikowanej literatury oraz dostępnych opisów systemów; w przypadkach, gdy dane nie zostały wyraźnie podane, wskazano wartości szacunkowe. † Najlepsze przybliżenie, gdy nie określono w literaturze; ‡ System nie musi być rozbierany ani przenoszony do komory z laminarnym przepływem powietrza w celu wykonania czynności; * Możliwe po wprowadzeniu modyfikacji do systemu; Kategorie kosztów zdefiniowano jako: niskie (&lt; 30 USD na jednostkę), średnie (30-100 USD na jednostkę), wysokie (&gt; 100 USD na jednostkę)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Table1.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela dodatkowa 2: Wykaz materiałów (BOM) i szacunkowe koszty montażu oraz eksploatacji pojedynczej jednostki GNOVA. Materiały zostały podzielone na komponenty wielokrotnego i jednorazowego użytku, z odpowiadającymi im kosztami jednostkowymi, ilościami wymaganymi na system oraz całkowitym kosztem na system. Komponenty wielokrotnego użytku wpływają na początkowy koszt konfiguracji, a materiały jednorazowe stanowią koszt materiałów eksploatacyjnych na jeden eksperyment. * obliczone na podstawie wynegocjowanych cen hurtowych dla stawek najbardziej efektywnych kosztowo; ** ilość potrzebna zależy od długości eksperymentu, użytego podłoża glebowego i celu badawczego. Wartość dla eksperymentu trwającego cztery tygodnie z tygodniowym harmonogramem nawadniania przy użyciu mieszanki gliny i piasku; † Przybliżony koszt ilości materiału potrzebnej na system; ‡ Nie obejmuje ceny roztworu odżywczego ani podłoża glebowego, ponieważ będą one zależeć od celu eksperymentalnego<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Wynikowe wartości p z testu t dla dwóch prób dla zmiennych pomiaru wzrostu kukurydzy hodowanej w systemie GNOVA oraz w systemie workowym.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Table3.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje montaż i użycie nowego gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin zaprojektowanego do akomodacyjnia zbóż i zweryfikowanego na pszenicy i kukurydzy. Ten gnotobiotyczny system roślin umożliwia kontrolowane eksperymenty roślina-mikrob przez zapewnienie sterylnych warunków wzrostu, zarządzania nawadnianiem i zgodności z różnorodnymi podłożami glebowymi.

Zgromadzenie i użycie gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin do badań nad interakcją roślina-mikrob w zbożach

The development of microbial-based agricultural amendments that work consistently in the field requires an understanding of the molecular mechanisms of ...

Nasze badania analizują sposób, w jaki mikroorganizmy kolonizują korzenie roślin i wpływają na ich odporność na stres. Niniejszy protokół można zastosować do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami u szerokiego zakresu gatunków roślin, wykraczając poza tradycyjne małe rośliny modelowe.Na początek należy wziąć doniczki przygotowane do eksperymentu i zdjąć z nich plastikowe zakrętki. Do doniczki wlać 378 ml pożywki Murashige i Skoog o połowicznym stężeniu. W przypadku podłoży z gliny i piasku należy użyć odpowiednio 360 ml i 350 ml, aby uzyskać 70% wypełnienia przestrzeni porowej wodą. Za pomocą sterylnych pincet posadzić wysterylizowane nasiona na odpowiednią głębokość. Pszenicę siać na głębokość 0,5 cala, a kukurydzę na głębokość 1 cala. Nałożyć plastikową zakrętkę na wierzch doniczki, a następnie wyjąć doniczkę z komory z laminarnym przepływem powietrza. Alternatywnie można wysiać sterylne, wcześniej wykiełkowane siewki do GNOVA. Po przeniesieniu doniczki i cylindra szklanego do komory wzrostu, przytrzymać cylinder szklany dnem do dołu blisko doniczki. Przytrzymać folię sterylizacyjną oraz plastikową zakrętkę. Jednym szybkim ruchem zdjąć plastikową zakrętkę z doniczki oraz folię sterylizacyjną z cylindra szklanego. Obniżyć cylinder szklany i osadzić go na krawędzi wydrukowanej w 3D podstawy. Pszenicę hodować w temperaturze 22 °C w dzień i 16 °C w nocy, pod światłem fluorescencyjnym z 12-godzinnym fotoperiodem. W przypadku kukurydzy utrzymać 27 °C w dzień i 23 °C w nocy w tych samych warunkach.Do dozownika nakręcanego na butelkę przymocuj długi odcinek rurki silikonowej. Umieść płomień w pobliżu linii nawadniającej. Zdejmij cylinder strzykawki z linii nawadniającej oraz z uchwytu filtra. Wszystkie końce rurek powinny znajdować się w strefie płomienia. Przymocuj uchwyt filtra do linii nawadniającej. Połącz dwa cylindry strzykawek. Następnie podłącz długi odcinek rurki sprzężonej z dozownikiem nakręcanym na butelkę do dolnego portu uchwytu filtra. Odmierz 150 mililitrów pożywki Murashige and Skoog o połowie standardowego stężenia. Rozdziel dwa cylindry strzykawek. Odłącz rurkę silikonową od uchwytu filtra, a następnie odłącz uchwyt filtra od linii nawadniającej. Zastąp go jednym cylindrem strzykawki.W dużych eksperymentach z więcej niż 50 próbkami zastosuj strategię płukania 10% roztworem wybielacza, aby zwiększyć wydajność nawadniania. Odmierz 10% (obj. obj.) roztwór wybielacza do dwóch małych plastikowych zlewków. Umieść zlewki w pobliżu linii nawadniającej i wyjmij korpus strzykawki z linii nawadniającej. Zanurz końce rurek w 10% roztworze wybielacza do momentu ich użycia. Wyjmij korpus strzykawki z uchwytu filtra. Zanurz wszystkie końce rurek w 10% roztworze wybielacza do momentu ich użycia. Strząśnij nadmiar roztworu wybielacza. Przymocuj uchwyt filtra do linii nawadniającej doniczek. Podłącz długi odcinek rurki połączony z dozownikiem nakręcanym na butelkę do dolnego portu uchwytu filtra. Odlej 150 ml pożywki Murashige i Skoog o połowie stężenia. Odłącz długi odcinek rurki silikonowej z dolnego portu uchwytu filtra. Po usunięciu nadmiaru wybielacza zastąp filtr w linii nawadniającej korpusem strzykawki. Jeśli objętość nawadniania ulegnie zmianie, użyj około 20 ml pożywki do odpowietrzenia linii.Zmodyfikuj protokół zbioru, aby dostosować go do konkretnych celów badawczych oraz objętości przetwarzanych próbek. Wyjmij szklany cylinder z doniczki. Szybko umieść doniczkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza i zdejmij ją z wydrukowanej w technologii 3D podstawy. Trzymając roślinę u podstawy, wysyp podłoże glebowe do pojemnika. Delikatnie usuń duże grudki ziemi z korzeni. W razie potrzeby pobierz próbki gleby zgodnie ze specyficznymi celami badawczymi. Za pomocą sterylnych nożyczek oddziel pędy od korzeni. Zapisz masę świeżych pędów. Oczyść korzenie, delikatnie potrząsając nimi w zlewce z wodą dejonizowaną. Osusz korzenie za pomocą ręcznika papierowego. Zapisz masę świeżych korzeni i w razie potrzeby pobierz próbki korzeni zgodnie ze specyficznymi celami badawczymi.Pszenica i kukurydza osiągnęły 100% kiełkowania w systemie GNOVA, podczas gdy w systemie workowym pszenica osiągnęła 67% kiełkowania, a kukurydza 75% kiełkowania po dwóch tygodniach. Pszenica hodowana w GNOVA osiągnęła 13. stadium wzrostu według skali Zadoka, podczas gdy pszenica hodowana w systemie workowym pozostała w 11. stadium wzrostu według skali Zadoka. W 5. tygodniu pszenica w GNOVA osiągnęła 21. stadium wzrostu według skali Zadoka, co objawiło się pojawieniem pędów bocznych, podczas gdy w systemie workowym pędy boczne nie wystąpiły, a rośliny pozostały w 13. stadium wzrostu według skali Zadoka. Po 12 tygodniach wzrostu w GNOVA rośliny pszenicy wykazywały więcej chlorotycznych liści, a szklany cylinder został wypełniony biomasą roślinną. Gdy rośliny pszenicy były hodowane w GNOVA przez dodatkowe dwa tygodnie, nie odnotowano zauważalnego przyrostu biomasy. Wzrost kukurydzy oceniano w systemie GNOVA przez cztery tygodnie i porównywano z kukurydzą hodowaną w workach. Świeża biomasa kukurydzy uprawianej w GNOVA wzrosła o 593% w stosunku do kukurydzy hodowanej w systemie workowym. Kukurydza hodowana w GNOVA miała znacznie większą długość pędów i korzeni niż kukurydza hodowana w systemie workowym.Niniejszy protokół umożliwia badaczom analizę interakcji między roślinami a mikroorganizmami w kontrolowanych warunkach oraz ustalenie związku przyczynowo-skutkowego między efektorami mikrobiologicznymi a odpowiedziami roślin. Najtrudniejszym elementem tego protokołu jest ostrożna obsługa linii nawadniających w celu zachowania sterylności. Przyszłe badania mogą łączyć ten system z syntetycznymi społecznościami mikrobiologicznymi w celu zidentyfikowania efektorów promujących wzrost roślin oraz zbadania mechanizmów formowania się społeczności mikrobiologicznych.

assembly-use-plant-gnotobiotic-growth-system-for-plantmicrobe

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Endocytoza zależna od klatryny opiera się na białkach adaptorowych, które koordynują selekcję ładunku i montaż otoczki klatrynowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy procedury służące do badania fizycznych oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną oraz metody obrazowania żywych komórek, wykorzystując jako model drożdżowe białko adaptorowe endocytozy Sla1p.

Badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

Przedstawiono zautomatyzowaną metodę identyfikacji odpowiednich wypełnień do chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) do wykorzystania w procesie oczyszczania białek. Metoda ta wykorzystuje system średniociśnieniowej chromatografii cieczowej obejmujący zautomatyzowane mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki z pętli, sekwencyjny wybór kolumn, analizę wielodługościową oraz rozdzielcze zbieranie frakcji eluatu.

Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Prezentujemy metody oceny, jak ryzyko drapieżnictwa może zmienić jakość chemiczną ofiar roślinożerców, wywołując zmiany w diecie, aby sprostać wymaganiom zwiększonego stresu, oraz jak rozkład zwłok tych zestresowanych roślinożerców spowalnia późniejszy rozkład ściółki roślinnej przez mikroby glebowe.

Powiązanie ryzyka drapieżnictwa, stresu fizjologicznego roślinożerców i mikrobiologicznego rozkładu ściółki roślinnej

System Lateral Root Induible System (LRIS) pozwala na synchroniczną indukcję korzeni bocznych i jest prezentowany dla Arabidopsis thaliana i kukurydzy.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Ten protokół ilustruje metodę enkapsulacji komórek poprzez szybkie fizyczne żelowanie alginianu w celu unieruchomienia komórek. Uzyskane mikrogranulki umożliwiają kontrolowane i trwałe wydzielanie β amyloidu w czasie i mogą być wykorzystywane do badania skutków wydzielania β amyloidu w modelach in vitro i in vivo.

Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera

Ten protokół jest używany do tworzenia i utrzymywania gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana) poprzez powierzchniową sterylizację jaj (oothecae) przed wykluciem. Te gnomiotyczne owady zawierają pionowo przenoszone endosymbionty Blattabacterium, ale mają akseniczne jelita.

Założenie i utrzymanie gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana)

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Poznaj system gnotobiotyczny GNOVA do badań nad interakcjami roślina-mikrob w zbożach. Ta metoda umożliwia hodowlę pszenicy i kukurydzy z kontrolowanym nawadnianiem, zapewniając 100% kiełkowanie i lepszy wzrost.

Zgromadzenie i użycie gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin do badań nad interakcją roślina-mikrob w zbożach

Przeglądaj więcej filmów