ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło zostało wsparte funduszami z CIHR Research Excellence, Diversity, and Independence Early Career Transition Award 202305ED8-509143-244657 (dla F.B.K.) oraz Narodowego Instytutu Zdrowia Cancer Institute R35 CA242447-01A1 dla V.M.W. K.J. jest stypendystą Lois A. Cinelli Fundacji Damon Runyon Cancer Research (DRG-2547-25).

1. Generowanie żeli ECM opartych na PA
<ol>
	<li>Funkcjonalizacja powierzchni szklanych do przymocowania żelu PA 
	UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej na shakerze orbitalnym. Dokładnie spłukuj wodą wysokiej jakości między krokami.
	<ol>
		<li>Oczyść powierzchnie szklane 10% wybielaczem na 3 h w chemicznej odpornej misce (np. polistyren). Użyj wystarczającej objętości, aby całkowicie pokryć szkło i upewnij się, że nie ma uwięzionych bąbelek ani suchych obszarów. 
		UWAGA: Wybielacz jest wysoce żrący i reaktywny. Przestrzegaj instrukcji bezpieczeństwa producenta.</li>
		<li>Inkubację szkiełek w 0,2 M kwasie solnym (HCl) przez 16 h z łagodnym wzburzeniem na shakerze. 
		UWAGA: HCl jest żrący i może powodować oparzenia skóry. Noś odpowiednie PPE.</li>
		<li>Dodaj 0,1 M NaOH i inkubację przez 1 h. 
		UWAGA: Roztwory NaOH są żrącowe i mogą powodować oparzenia skóry. Noś odpowiednie PPE.</li>
		<li>Inkubację szkieł w 0,5% APTES w wodzie wysokiej jakości przez 30 min. 
		UWAGA: APTES jest toksyczny. Pracuj z APTES w wyciągu laboratoryjnym z odpowiednim PPE.</li>
		<li>Spłucz szkła dużą objętością wody, aby usunąć wszelkie resztki APTES. 
		UWAGA: Niekompletne mycie spowoduje reakcję między APTES i glutaraldehydem w następnym kroku i doprowadzi do białych osadów, które zakłócą aktywację powierzchni szkła.</li>
		<li>Inkubację szkieł w 0,5% glutaraldehydzie w PBS przez 1 h. 
		UWAGA: Glutaraldehyd jest toksyczny. Pracuj z glutaraldehydem w wyciągu laboratoryjnym z odpowiednim PPE.</li>
		<li>Suszenie szkieł na materiałach absorpcyjnych (np. ręcznikach papierowych) przez noc. Przechowuj szkła w czystym, szczelnym pojemniku do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu żelu PA i odlewu żelu 
	UWAGA: Formuły potrzebne do uzyskania żeli o określonym modulom sprężystości są podane w Tabeli 1. Zalecane objętości żelu i wymiary szkła dla różnych zastosowań eksperymentalnych są przedstawione w Tabeli 3.
	<ol>
		<li>Wymieszaj komponenty żelu PA w 1,7 mL mikroprobówce, wyłączając persiarczany amonu (APS) i tetrametyloetylenodiaminę (TEMED). 
		UWAGA: Nie przygotowywaj dużych objętości, ponieważ żele o wyższej sztywności polimeryzują szybko i mogą stwardnieć przed zakończeniem odlewu.</li>
		<li>Degazuj mieszankę żelu PA, APS i TEMED w komorze próżniowej przy 25 mmHg przez 30 min.</li>
		<li>Przygotuj hydrofobowe górne szkła pokrywające, nakładając hydrofobową powłokę na czyste szkła za pomocą wacika. Upewnij się, że szkła są wolne od plam, aby utrzymać spójną polimeryzację żelu.</li>
		<li>Dodaj APS i TEMED do odgazowanego roztworu, a następnie delikatnie pipetą mieszaninę na aktywowanych szklnach.</li>
		<li>Umieść hydrofobowe szkła na wierzchu roztworu, aby utworzyć jednolitą cienką warstwę żelu. Pozostaw żele do polimeryzacji przez 35 min w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że między szklami nie są uwięzione bąbelki i że roztwór nie wylewa się za krawędzie. 
		UWAGA: Przestrzegaj zalecanych objętości do odlewu żelu, aby zapewnić odpowiednią grubość; zbyt cienkie żele pozwalają komórkom wyczuwać podstawowe szkło15. Przed rozłożeniem składu żelowego sprawdź pozostałą mieszaninę w mikroprobówce, aby potwierdzić polimeryzację.</li>
		<li>Zanurz skład żelowy w PBS, aby oddzielić warstwy. Upewnij się, że żel pozostaje przymocowany do aktywowanego dolnego szkła, a hydrofobowe górne szkło odczepia się łatwo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Funkcjonalizacja żeli z ligandami ECM 
	UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w środowisku bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Sterilizuj żele, zanurzając je w 70% alkoholu etylowym, a następnie przenieś je do naczyń kulturalnych z tkankową kulturą za pomocą sterylnego PBS. 
		UWAGA: Nie zostawiaj żeli w alkoholu na dłuższy czas, ponieważ spowoduje to odwodnienie żeli i osłabi koniugację ECM.</li>
		<li>Przygotuj główny roztwór funkcjonalizacyjny złożony z wody, alkoholu, HEPES i bisakrylamidu (Tabela 4). 
		UWAGA: Bisakrylamidem jest toksyczny przy inhalacji lub połknięciu.</li>
		<li>Przygotuj rozcieńczone roztwory fotoinicjonatora UV i tetraakrylatu. Oba reagenty są rozpuszczone w alkoholu (Tabela 4). 
		UWAGA: Wykonuj szeregowe rozcieńczenia tetraakrylatu za każdym razem, ponieważ nadmierny montaż może prowadzić do nadmiernej polimeryzacji i widocznych czarnych osadów na powierzchni (patrz Rysunek 3A).</li>
		<li>Waż wymaganą ilość NHS-akrylatu za pomocą wagi analitycznej. Natychmiast przed użyciem zawieś NHS-akryl w 50% alkoholu/50% wodzie. 
		UWAGA: Nadmierna ilość NHS-akrylatu skutkuje powstawaniem

<ol>
	<li>Guimar&#227;es CF, Gasperini L, Marques AP, Reis RL. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nat Rev Mater. 2020;5(5):351-70.</li>
	<li>Butcher DT, Alliston T, Weaver VM. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 2009;9(2):108-22.</li>
	<li>Barnes JM, Przybyla L, Weaver VM. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. J Cell Sci. 2017;130(1):71-82.</li>
	<li>Kai FB, Laklai H, Weaver VM. Force matters: biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 2016;26(7):486-97.</li>
	<li>Discher DE, Janmey P, Wang YL. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 2005;310(5751):1139-43.</li>
	<li>Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 2006;126(4):677-89.</li>
	<li>Miroshnikova YA, et al. Tissue mechanics promote IDH1-dependent HIF1&#945;-tenascin C feedback to regulate glioblastoma aggression. Nat Cell Biol. 2016;18(12):1336-45.</li>
	<li>Mekhdjian AH, et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Mol Biol Cell. 2017;28(11):1467-88.</li>
	<li>Northey JJ, et al. Mechanosensitive hormone signaling promotes mammary progenitor expansion and breast cancer risk. Cell Stem Cell. 2024;31(1):106-26.e13.</li>
	<li>Kai FB, et al. ECM dimensionality tunes actin tension to modulate endoplasmic reticulum function and spheroid phenotypes of mammary epithelial cells. EMBO J. 2022;41(17):e109205.</li>
	<li>Kai FB, Leidal AM, Weaver VM. Tension-induced organelle stress: an emerging target in fibrosis. Trends Pharmacol Sci. 2025;46(2):117-31.</li>
	<li>Mei Y, et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 2010;9(9):768-78.</li>
	<li>Lakins JN, Chin AR, Weaver VM. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Methods Mol Biol. 2012;916:317-50.</li>
	<li>Ou G, et al. Visualizing mechanical modulation of nanoscale organization of cell-matrix adhesions. Integr Biol (Camb). 2016;8(7):795-804.</li>
	<li>Buxboim A, Rajagopal K, Brown AE, Discher DE. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 2010;22(19):194116.</li>
	<li>Liu F, et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. J Cell Biol. 2010;190(4):693-706.</li>
	<li>Paszek MJ, et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 2005;8(3):241-54.</li>
	<li>Cosgrove BD, et al. Mechanosensitive genomic enhancers potentiate the cellular response to matrix stiffness. Science. 2025;390(6778):eadl1988.</li>
	<li>Qin Z, et al. Matrix stiffness of GelMA hydrogels regulates lymphatic endothelial cells toward enhanced lymphangiogenesis. ACS Appl Mater Interfaces. 2024;16(41):55130-41.</li>
	<li>Greaney AJ, et al. A comprehensive protocol for PDMS fabrication for use in cell culture. PLoS One. 2025;20(5):e0323283.</li>
	<li>Muncie JM, et al. Patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics. J Vis Exp. 2019;(151):e60334.</li>
	<li>Kai FB, Drain AP, Weaver VM. The extracellular matrix modulates the metastatic journey. Dev Cell. 2019;49(3):332-46.</li>
	<li>Bonneh-Barkay D, Wiley CA. Brain extracellular matrix in neurodegeneration. Brain Pathol. 2009;19(4):573-85.</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów o interesy do ujawnięcia.

Przedstawiony protokół wytwarzania ECM zapewnia powtarzalny, skalowalny i opłacalny proces i może być łatwo wdrożony w większości laboratoriów. Chociaż tradycyjne szklane i plastikowe naczynia do hodowli są wygodne i umożliwiają szybkie zbieranie danych, syntetyczne podłoża nie radzą sobie z odtworzeniem fizjologicznie odpowiedniej sztywności tkanki. Alternatywne mechanicznie modulujące podłoża, takie jak polidimetyloksylan (PDMS) lub żelatyna metyloakryloilowana (GelMA), są łatwiejsze do wytworzenia, ale ogólnie nie osi...

Macierz pozakomórkowa (ECM) jest fundamentalną strukturalną i biochemiczną podstawą, która definiuje właściwości mechaniczne tkanek i wspiera ich funkcje biologiczne. Na przykład tkanki elastyczne, takie jak płuca i tętnice, są wzbogacone w ECM oparty na kolagenie i elastynie, który zapewnia wymaganą odporność mechaniczną podczas powtarzających się cykli rozciągania i kurczenia podczas oddychania. W przeciwieństwie do tego, układ nerwowy centralny zawiera ECM bogaty w glikozaminoglikany, który tworzy wysoce elastyczne środowisko zoptymalizowane pod kątem różnicowania i przekazywania sygnałów neuronów1. W różnych tkankach w organizmie, sztywność tkanki obejmuje kilka rzędów wielkości, od setek paskali w miękkich tkankach, takich jak mózg i płuca, do poziomów sztywności w megapascalach i gigapascalach w ścięgnach i kościach, odpowiednio2,3. Te różnice mechaniczne nie są tylko strukturalne, ale odgrywają również krytyczną rolę w regulacji zachowania komórek4,5. Na przykład komórki mezenchymalne przechodzą specyfikację linii komórkowych zależną od sztywności, przyjmując los neuronów na miękkich podłożach, los miogeniczny na podłożach pośrednich i los osteogeniczny na sztywnych podłożach6. Patologiczne zmiany w sztywności ECM mogą również powodować nieprawidłowe reakcje komórkowe i przyczyniać się do inicjacji i postępu choroby7,8,9. Podobnie zmiany właściwości ECM wokół komórek zmieniają również funkcję organelli i różne zachowania komórek10,11. Mimo uznanej wagi ECM w sterowaniu przekaźnictwem sygnałowym, funkcją organelli i patogenezą chorób, mechanizmy, którymi komórki wyczuwają i przekazują wskazówki ECM w biochemiczne sygnały, pozostają niedostatecznie zrozumiałe.
Postęp w rozumieniu przekaźnictwa komórka-ECM był częściowo utrudniony przez ograniczoną dostępność platform eksperymentalnych, które oferują precyzyjną kontrolę nad właściwościami ECM, zachowując pełną kompatybilność ze standardowymi testami biochemicznymi i przepływami prac roboczych z obrazowaniem. Ponadto badanie interakcji komórka-ECM jest często postrzegane jako technicznie trudne, ponieważ wymaga wielodyscyplinarnej ekspertyzy obejmującej nauki materiałowe, biologię komórki i inżynierię biomedyczną. Ten metod ma na celu zaawansowanie tych wyzwań, zapewniając szczegółowe protokoły do generowania podłoży ECM opartych na PA i silikonie o zdefiniowanych właściwościach mechanicznych, które można łatwo przygotować w większości ustawień laboratorium mokrego.
Hydrożele PA o regulowanej sztywności są podstawą mechanobiologii; jednak ich przydatność jest często ograniczona przez wysoki koszt reagentów do koniugacji ECM, niekonsekwentną funkcjonalizację powierzchni i słabą kompatybilność z dużoskalowym przepływem prac biochemicznych. Ponadto praktyczne i standaryzowane podejścia do pobierania próbek i obrazowania w przypadku podłoży o zmiennej sztywności nie są dobrze ustalone. Te wąskie gardła można rozwiązać za pomocą naszego opisanego platformu PA gel, który charakteryzuje się czterema kluczowymi innowacjami: (i) znaczna redukcja kosztów, (ii) reproduktywalna chemia funkcjonalizacji, (iii) skalowalna produkcja poprzez wielokrotnego użytku sprzęt i (iv) bezproblemowa integracja z wieloma konwencjonalnymi testami biologii komórki i biochemicznymi. To podejście wykorzystuje różne proporcje akrylamidu i bisakrylamidu, aby wygenerować hydrożele o różnych właściwościach mechanicznych (Tabela 1). Żel PA jest obojętny i nie może się bezpośrednio koniugować z białkami ECM. Dlatego do koniugacji cienkiej, skonkretyzowanej sieci tetraakrylanu di(trimetylopropanu), kwasu akrylowego N-hydroksuksinimidowego estru (NHS-akrylan) i bisakrylamidu na powierzchni żelu PA (Rysunek 1) stosuje się reakcję polimeryzacji wolnorodnikowej inicjowaną UV. Ta sieć tworzy dwukierunkowy adhezywny podkład dla białek ECM: NHS-akrylan zapewnia stabilne kowalentne zakotwiczenie dla białek ECM, podczas gdy tetraakrylan umożliwia jednolite adsorpcję białek ECM12. Ponadto dostarczamy metody pokazujące, jak zbierać białka i kwasy nukleinowe, takie jak RNA z tych podłoży w sposób zgodny z dalszymi analizami biologii komórki, takimi jak western blotting i odwrotna transkrypcja-ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-qPCR). Ponadto powstające elastyczne podłoża PA wspierają również formowanie sferoidów i pozycjonowanie sferoidów w jednolitej płaszczyźnie ogniskowej, umożliwiając systematyczną analizę 3D zachowań komórek13.
Natomiast ograniczenia optyczne hydrożeli PA ograniczają ich zastosowanie w zaawansowanych modalnościach obrazowania, szczególnie mikroskopi fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIRF)14. Aby rozwiązać to ograniczenie, opracowaliśmy mechanicznie regulacyjne podłoża ECM oparte na silikonie, zoptymalizowane pod kątem obrazowania TIRF. Te materiały wykazują indeks załamania bliski szkła, zachowując regulowaną sztywność w

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)</td><td>919-30-2</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td><td>-</td><td>LMCT1.7B</td><td>FroggaBio</td></tr><tr><td>12-well tissue culture-treated plates</td><td>-</td><td>83.3921</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes (for orange chamber)</td><td>-</td><td>CLS430790</td><td>Corning</td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4&prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure)</td><td>106797-53-9</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>2% Bisacrylamide solution</td><td>110-26-9</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)</td><td>25952-53-8</td><td>-</td><td>Chem Impex International</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>28718-90-3</td><td>-</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>-</td><td>D1306</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>40% Acrylamide solution</td><td>01/06/1979</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyde</td><td>111-30-8</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>6 cm tissue culture-treated dishes</td><td>-</td><td>83.3901</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>A549 cells</td><td>-</td><td>CCL-185</td><td>ATCC</td></tr><tr><td>Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester</td><td>38862-24-7</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit antibody</td><td>-</td><td>A11008</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(triethylammonium salt))</td><td>-</td><td>A37572</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>7727-54-0</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>Clear impact-resistant polycarbonate film (0.005 in.; spacer)</td><td>-</td><td>85585K72</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>CY 52-276 silicone gel, Components A and B</td><td>2624028</td><td>-</td><td>Dow</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>-</td><td>11995-065</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous</td><td>64-17-5</td><td>-</td><td>Greenfield Canada</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>-</td><td>4385612</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>-</td><td>A52567-01</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>-</td><td>356008</td><td>Corning</td></tr><tr><td>Formaldehyde (16%)</td><td>-</td><td>28908</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>7365-45-9</td><td>-</td><td>BioShop</td></tr><tr><td>High-temperature silicone rubber sheet (0.020 in.; gasket)</td><td>-</td><td>86435K452</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>7647-01-0</td><td>-</td><td>BioShop</td></tr><tr><td>Large hollow hole punch tool set</td><td>-</td><td>66000</td><td>Mayhew Pro</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>-</td><td>356234</td><td>Corning</td></tr><tr><td>Media storage borosilicate glass bottle, 250 mL</td><td>-</td><td>CLS1395250</td><td>Corning</td></tr><tr><td>Media storage borosilicate glass bottle, 500 mL</td><td>-</td><td>CLS1395500</td><td>Corning</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate</td><td>-</td><td>4346906</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Microscope slide coverslips, 18 mm diameter</td><td>-</td><td>72222-01</td><td>Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Microscope slide coverslips, 50 mm diameter</td><td>-</td><td>1.84E+16</td><td>eBay</td></tr><tr><td>PBS (1&times;)</td><td>-</td><td>14190144</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PBS (10&times;)</td><td>-</td><td>70011044</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>17466-45-4</td><td>-</td><td>Biotium</td></tr><tr><td>Phospho-FAK (Tyr397) antibody</td><td>-</td><td>85567</td><td>Cell Signaling Technology</td></tr><tr><td>Phospho-MLC (Ser19) antibody</td><td>-</td><td>3671</td><td>Cell Signaling Technology</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>-</td><td>PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td></tr><tr><td>qPCR primers (forward and reverse)</td><td>-</td><td>N/A</td><td>Integrated DNA Technologies</td></tr><tr><td>qScript cDNA Synthesis Kit</td><td>-</td><td>95047</td><td>QuantaBio</td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>-</td><td>-</td><td>Rain-X</td></tr><tr><td>Screw-cap tubes, conical base, 15 mL</td><td>-</td><td>62.554.101</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>Screw-cap tubes, conical base, 50 mL</td><td>-</td><td>62.547.205</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>Serological pipette, 10 mL</td><td>-</td><td>170356N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Serological pipette, 25 mL</td><td>-</td><td>170357N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Serological pipette, 5 mL</td><td>-</td><td>170355N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Serological pipette, 50 mL</td><td>-</td><td>170358N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>1310-73-2</td><td>-</td><td>BioShop</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby protein gel stain</td><td>-</td><td>S12000</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>110-18-9</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>TRIzol reagent</td><td>-</td><td>15596026</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>UV chamber</td><td>-</td><td>165-5031</td><td>Bio-Rad</td></tr></tbody></table>

generowanie substratów ekstrakomórkowych z poliakryloamidu i silikonu o określonej sztywności dla zastosowań w biologii komórki

Generation of Polyacrylamide and Silicone Extracellular Matrix Substrates with Defined Stiffness for Cell Biology Applications

Macierz pozakomórkowa (ECM) jest krytycznym regulatorem zachowania komórek, przy czym sztywność ECM pełni rolę kluczowego wskaźnika mechanicznego, który rządzi sygnalizacją komórkową, morfologią i losem komórek. Jednakże, eksperymentalne badanie reakcji komórkowych zależnych od sztywności jest często ograniczone dostępnością reproduktyjnych, ekonomicznych i dostępnych platform hodowlanych o precyzyjnie modulowanych właściwościach mechanicznych. Ten protokół opisuje metody oparte na poliakryloamidzie (PA) i silikonie do produkcji podłoży ECM o regulowanej sztywności. Procedury obejmują przygotowanie podłoża, funkcjonalizację powierzchni oraz sprzęganie białek ECM w celu zapewnienia jednolitej adhezji komórek w zakresie fizjologicznie istotnej sztywności. Podłoża na bazie PA są kompatybilne z późniejszymi badaniami biochemicznymi, w tym ekstrakcją białek i RNA, jak również wysokorozdzielczym obrazowaniem fluorescencyjnym. Podłoża na bazie silikonu są zoptymalizowane pod kątem mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), umożliwiającej wizualizację interakcji komórka-ECM na poziomie błony podstawnej. Dodatkowo, miękkie podłoża mogą być dostosowane do obsługi hodowli sferoidów umieszczonych w jednolitej płaszczyźnie obrazu, ułatwiając jednolite pozyskiwanie obrazów. Te metody dostarczają niezawodnych, ekonomicznych i reproduktyjnych platform do systematycznego badania, jak sztywność ECM reguluje procesy komórkowe, poszerzając mechanizmyczne zrozumienie interakcji komórka-ECM zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i chorobowym.

Sztywność żeli PA uzyskana przy użyciu formulacji przedstawionych w tabeli 1 została przetestowana doświadczalnie za pomocą reometru. Wybrano żele o nominalnych wartościach sztywności 0.4 kPa, 6 kPa i 60 kPa, obejmujące trzy rzędy wielkości. Zmierzone wartości sztywności wyniosły 363 ± 76 Pa dla żeli 400 Pa, 6.41 ± 0.50 kPa dla żeli 6 kPa oraz 36 ± 8 kPa dla żeli 60 kPa (rycina 4A). Aby ocenić jednorodność przyłączenia ECM do żeli PA, do powierzchni żelu sprzężono znakowaną fluorescencyj...

Mimo że sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest kluczowym regulatorem zachowania komórkowego, podstawowe mechanizmy wyczuwania i przekazywania sygnałów pozostają niejasne. Aby temu zaradzić, udostępniamy protokoły tworzenia podłoży na bazie poliakryloamidu i silikonu o regulowanej sztywności, aby poszerzyć naszą wiedzę o komunikacji między komórkami a ECM.

Generowanie substratów ekstrakomórkowych z poliakryloamidu i silikonu o określonej sztywności dla zastosowań w biologii komórki

The extracellular matrix (ECM) is a critical regulator of cell behavior, with ECM stiffness serving as a key mechanical cue that governs cellular ...

generation-polyacrylamide-silicone-extracellular-matrix-substrates

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Nasze laboratorium opracowało usieciowane DNA hydrożele poliakrylamidowe, dynamiczny system hydrożelowy, aby lepiej zrozumieć wpływ modulacji sztywności tkanek na funkcjonowanie komórek. Tutaj podajemy schematy, opisy i protokoły przygotowania tych hydrożeli.

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Przedstawiono protokół przygotowania hydrożeli z polialkoholu winylowego i kwasu ko-itakonowego o różnej sztywności, które zostały zaszczepione z oligopeptydami i bez nich, w celu zbadania wpływu sztywności biomateriałów na różnicowanie i proliferację komórek macierzystych. Sztywność hydrożeli była kontrolowana przez czas sieciowania.

Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Przedstawiono protokół procesu produkcji polimerowych cienkowarstwowych struktur kompozytowych o różnych modułach lub grubościach Younga. Folie są produkowane do zaawansowanych badań nad kulturami komórkowymi lub jako kleje do skóry.

Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka

Substraty o sztywności w zakresie kilopaskali są przydatne do badania reakcji komórek na fizjologicznie istotną sztywność mikrośrodowiska. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia można określić moduł Younga miękkich żeli silikonowych za pomocą wgłębienia z odpowiednią kulą.

Pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Zdolność do hodowli komórek zrewolucjonizowała weryfikację hipotez w podstawowych badaniach z zakresu biologii komórkowej i molekularnej. Stała się ona standardową metodologią w ...

BioMEMS i biologia komórkowa: perspektywy i zastosowania

University of Calgary.  Although extracellular matrix (ECM) stiffness is a key regulator of cellular behavior, the underlying sensing and transduction mechanisms remain unclear. To address this, we provide protocols for creating polyacrylamide- and silicone-based substrates with tunable stiffness to advance our understanding of cell-ECM crosstalk.

Generowanie substratów ekstrakomórkowych z poliakryloamidu i silikonu o określonej sztywności dla zastosowań w biologii komórki

Przeglądaj więcej filmów