Name: Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-07T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj urządzenie mikrofluidyczne MCCD do ciągłej hodowli bakterii w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych. Metoda umożliwia badanie fizjologii Escherichia coli w środowiskach przypominających naturalne siedliska mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wyrazami wdzięczności przyjmujemy wsparcie finansowe z grantu Gordon and Betty Moore Foundation Symbiosis in Aquatic Systems Initiative Investigator Award (GBMF9197; https://doi.org/10.37807/GBMF9197), Fundacji Simons poprzez współpracę Principles of Microbial Ecosystems (PriME) (grant 542395FY22), oraz szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki grant 205321_207488 dla R.S. K.S.L. z wdzięcznością przyjmuje wsparcie od Korea Basic Science Institute (National Research Facilities and Equipment Center; Grant No. RS2025-00554860) oraz Narodowej Fundacji Badań Naukowych Korei (NRF; Grant No. RS2025-23523643), oba fundowane przez Rząd Korei (MSIT), oraz z Funduszu Badań 2025 (1.260002.01) UNIST.

1. Wzrost bakterii w stałych warunkach żywieniowych
UWAGA: Ten protokół opisuje procedurę wykonywania krzywej wzrostu E. coli NCM3722 w bardzo rozcieńczonym środowisku Rich-Defined Medium ("niska RDM") warunków. Ta krzywa wzrostu trwa 12 h, z jedną próbką pobieraną co 2 h (łącznie 6 punktów czasowych). Kluczowym założeniem tego protokołu jest to, że każdy punkt czasowy odpowiada jednemu filtrowi Sterivex (zwanym dalej filtrem PVDF 0,45 μm). Aby pobrać próbkę, kulturę wewnątrz filtra pobiera się poprzez wirowanie go do góry nogami, liczba komórek jest ilościowo określana, a filtr jest wyrzucana. Każdy filtr PVDF 0,45 μm daje tylko jedną próbkę. Przygotowanie eksperymentu wymaga określenia trzech kluczowych parametrów eksperymentalnych: przepływu pompy perystaltycznej, czasu trwania eksperymentu i pożądanej liczby próbek (czyli liczby filtrów PVDF 0,45 μm). Ustaw początkową szybkość przepływu na 2 mL/min. Dostosuj ten parametr według potrzeb (np. zwiększ szybkość przepływu, aby utrzymać dostarczanie bardzo rozcieńczonego składnika odżywczego).
<ol>
	<li>Przygotowanie medium i materiałów 
	UWAGA: Ponieważ każdy filtr odpowiada jednej próbce w danym punkcie czasowym, czas trwania eksperymentu dla każdego filtra PVDF 0,45 μm różni się w zależności od czasu pobrania (np. 2 h dla pierwszego punktu czasowego, 4 h dla drugiego punktu czasowego i tak dalej).
	<ol>
		<li>Szacuj wymaganą objętość środowiska hodowlanego za pomocą wzoru 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/70652/70652eq1.jpg" style="margin: auto;" />, 
		gdzie n to liczba próbek (filtry PVDF 0,45 μm), Q to szybkość przepływu (w mL/min), a ti to czas trwania eksperymentu (w minutach) dla każdej próbki.</li>
		<li>Pomnóż przez 1,2, aby uwzględnić dodatkową objętość 20% w celu uwzględnienia wahań szybkości przepływu. Dla tego przykładu oblicz 
		<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/70652/70652eq2.jpg" style="margin: auto;" /></li>
		<li>Zaokrąglij obliczoną objętość w górę (np. przygotuj 6200 mL w tym przykładzie).</li>
		<li>Przygotuj materiał do sterylizacji (patrz Tabela 1). 
		UWAGA: Przygotuj i sterylizuj materiały dzień przed eksperymentem, aby zapewnić gotowość i zminimalizować opóźnienia. Zakaż tymi materiałami, z wyjątkiem jednokierunkowych zaworów Luer; zawory należy sterylizować za pomocą 70% alkoholu etylowego.
		<ol>
			<li>Podłącz oba końce sześciu silikonowych rurek perystaltycznych do złączy z "Męskim Luer do Barb" plastikowych, wstawiając koniec Barb złącza do przewodu. Pokryj męskie końce Luer folią aluminiową, aby zapobiec zanieczyszczeniu. 
			UWAGA: Przygotowano sześć rurek perystaltycznych, ponieważ eksperyment korzysta z sześciu filtrów PVDF 0,45 μm. Wszystkie rury zostaną później zamontowane na tej samej głowicy pompy perystaltycznej, aby wszystkie filtry otrzymywały identyczny przepływ.</li>
			<li>Umieść przewody wewnątrz zamkniętej, możliwej do sterylizacji pojemnika.</li>
			<li>Umieść filtry wentylacyjne wewnątrz zamkniętej, możliwej do sterylizacji pojemnika.</li>
			<li>Umieść nakrętki z silikonowymi przewodami przechodzącymi przez nakrętki wewnątrz zamkniętej, możliwej do sterylizacji pojemnika. 
			UWAGA: Używane w tym protokole nakrętki z przewodami są wyposażone w trzy rury, które przechodzą przez nakrętki: dwie rury o równej średnicy do dostarczania medium do filtrów PVDF 0,45 μm oraz trzecią rury o większej średnicy. Te rury są mocno przymocowane do nakrętek i nie mogą być usunięte.</li>
			<li>Zanurz 12 jednokierunkowych zaworów Luer w roztworze 70% alkoholu etylowego i pozostaw na noc, aby sterylizować. 
			UWAGA: (PUNKT PAUZY) Wysterylizowano materiały można przechowywać zanurzone i uszczelnione w temperaturze pokojowej do 24 h przed eksperymentem. Przed użyciem usuń zawory z alkoholu i spłucz sterylną wodą ultraczystą, aby usunąć resztki alkoholu. Alternatywnie, zawory mogą być drukowane 3D za pomocą materiałów nadających się do sterylizacji przez zakłócenie zamiast leczenia alkoholem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zasterylizuj przewody perystaltyczne, filtry wentylacyjne, nakrętki, miareczki i butelki za pomocą standardowych ustawień sprzętu laboratoryjnego.</li>
		<li>Przygotuj 6200 mL niskiego środowiska zdefiniowanego bogactwa (RDM; patrz Tabela Materiałów), mieszając reagenty wymienione w Tabeli 2. 
		UWAGA: Przygotuj środowisko w dniu eksperymentu, w czasie około 5-godzinnego czasu oczekiwania po rozpoczęciu hodowli wstępnej (patrz krok 1.2.1). To zachowuje świeżość środowiska i minimalizuje ryzyko skażenia.</li>

<ol><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+microbes+see+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine microbes see a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li>
<li>Vorholt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+life+in+the+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial life in the phyllosphere.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).</li>
<li>Or, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+constraints+affecting+bacterial+habitats+and+activity+in+unsaturated+porous+media%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Water+Resour%22%5BJournal%5D)">Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review.</a> Adv Water Resour. 30 (6–7), 1505-1527 (2007).</li>
<li>Nguyen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+fluctuations+and+their+effects+on+microbial+communities%2C+populations+and+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Environmental fluctuations and their effects on microbial communities, populations and individuals.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), (2021).</li>
<li>Moore, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processes+and+patterns+of+oceanic+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Geosci%22%5BJournal%5D)">Processes and patterns of oceanic nutrient limitation.</a> Nat Geosci. 6 (9), 701-710 (2013).</li>
<li>Doranga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+of+Escherichia+coli+within+the+intestinal+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Nutrition of Escherichia coli within the intestinal microbiome.</a> EcoSal Plus. 12 (1), eesp-0006(2024).</li>
<li>Rodríguez-Verdugo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+environmental+fluctuations+shapes+ecological+dynamics+in+a+two-species+microbial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Lett%22%5BJournal%5D)">The rate of environmental fluctuations shapes ecological dynamics in a two-species microbial system.</a> Ecol Lett. 22 (5), 838-846 (2019).</li>
<li>Thaiss, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+control+of+microbiota+diurnal+oscillations+promotes+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis.</a> Cell. 159 (3), 514-529 (2014).</li>
<li>Kearney, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+dietary+niche+enables+reversible+engraftment+of+a+gut+bacterial+commensal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Orthogonal dietary niche enables reversible engraftment of a gut bacterial commensal.</a> Cell Rep. 24 (7), 1842-1851 (2018).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4 (6), 457-469 (2003).</li>
<li>Beaumont, H. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+bet+hedging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of bet hedging.</a> Nature. 462 (7269), 90-93 (2009).</li>
<li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+growth+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced growth of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li>
<li>Ballesta, J. P. G., Schaechter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+shift-down+and+growth+inhibition+on+phospholipid+metabolism+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of shift-down and growth inhibition on phospholipid metabolism of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 107 (1), 251-258 (1971).</li>
<li>Nguyen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+growth+physiology+enhances+bacterial+growth+under+rapid+nutrient+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A distinct growth physiology enhances bacterial growth under rapid nutrient fluctuations.</a> Nat Commun. 12 (1), (2021).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science. 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Egli, T., Lendenmann, U., Snozzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+microbial+growth+with+mixtures+of+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Kinetics of microbial growth with mixtures of carbon sources.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 289-298 (1993).</li>
<li>Lendenmann, U., Snozzi, M., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+simultaneous+utilization+of+sugar+mixtures+by+Escherichia+coli+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the simultaneous utilization of sugar mixtures by Escherichia coli in continuous culture.</a> Appl Environ Microbiol. 62 (5), 1493-1499 (1996).</li>
<li>Tappe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+nitrifying+bacteria+in+the+retentostat%2C+a+simple+fermenter+with+internal+biomass+retention%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of nitrifying bacteria in the retentostat, a simple fermenter with internal biomass retention.</a> FEMS Microbiol Ecol. 19 (1), 47-52 (1996).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Controlling a solenoid valve with Arduino. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bc-robotics.com/tutorials/controlling-a-solenoid-valve-with-arduino/">https://bc-robotics.com/tutorials/controlling-a-solenoid-valve-with-arduino/</a> (2015).</li>
<li>Egli, T. The Ecological and Physiological Significance of the Growth of Heterotrophic Microorganisms with Mixtures of Substrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEgli%2C+T+%22Advances+in+Microbial+Ecology%22">Advances in Microbial Ecology</a>. , Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligotrophs+versus+copiotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Oligotrophs versus copiotrophs.</a> BioEssays. 23 (7), 657-661 (2001).</li>
<li>Muenster, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+and+fluxes+of+organic+carbon+substrates+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Concentrations and fluxes of organic carbon substrates in the aquatic environment.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 243-274 (1993).</li>
<li>Murugan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+on+biology+in+time+varying+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Roadmap on biology in time varying environments.</a> Phys Biol. 18 (4), (2021).</li>
<li>Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+mechanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial mechanosensors.</a> Annu Rev Physiol. 80 (1), 71-93 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Metody hodowli bakteryjnej, które odzwierciedlają złożoność składników odżywczych w środowiskach naturalnych, są niezbędne do poszerzenia badań nad fizjologią mikroorganizmów poza uproszczonymi warunkami laboratoryjnymi. Naturalne ekosystemy zawierają mieszanki składników odżywczych o szerokim zakresie stężeń, które często nie wspierają maksymalnych wskaźników wzrostu1,3,4,21,<sup cl...

Bakteria w naturalnych siedliskach napotykają środowisko odżywcze, które często różni się zarówno pod względem składu, jak i stężenia i może zmieniać się w szerokim zakresie czasowym1,2,3,4. W środowiskach takich jak ocean5, gleba3 i jelito6, wzrost mikroorganizmów jest często ograniczony przez jeden lub więcej podstawowych składników odżywczych, a dostępność składników odżywczych może zmieniać się z powodu procesów fizycznych, chemicznych i biologicznych4. Te mieszanki składników odżywczych i ich fluktuacje napędzają strategię przetrwania i wzrostu mikroorganizmów, kształtując reakcje na różnych poziomach organizacji biologicznej4.
Adaptacje mikroorganizmów do dynamiki składników odżywczych występują na poziomie społeczności, populacji i pojedynczej komórki. Na poziomie społeczności, fluktuacje mogą promować współwystępowanie gatunków7, koordynować skład społeczności i aktywność metaboliczną z zmiennością czasową8 oraz stwarzać możliwości kolonizacji nowych gatunków9. Na poziomie populacji, zmieniające się warunki odżywcze mogą przyspieszyć ewolucję poprzez selekcję zmian genetycznych10 lub indukować zmienność fenotypów, w tym strategie typu bet-hedging11, które poprawiają przetrwanie w nieprzewidywalnych warunkach. Na poziomie pojedynczej komórki bakterie dostosują swoją fizjologię w odpowiedzi na środowisko odżywcze12,13. Jednym z niedawno zgłoszonych przykładów jest specyficzna fizjologia, która zapewnia bakteriom przewagę wzrostową w warunkach zmiennych14. Ponieważ bakterie często napotykają ograniczenie odżywcze, badanie ich reakcji na niskie i zmienne warunki odżywcze - zarówno jako pojedyncze komórki, jak i w populacjach lub społecznościach - jest niezbędne do zrozumienia ich zachowania w naturalnym środowisku.
Chemostaty są dobrze przystosowane do badania wzrostu pod warunkami ograniczenia przez pojedynczy składnik odżywczy, ale są trudne do zastosowania, gdy celem jest kontrola stężeń wielu składników odżywczych w mieszankach o niskich stężeniach. Chemostaty były cennym narzędziem do badania adaptacji bakterii do ograniczenia składników odżywczych, zapewniając dobrze kontrolowane, stałe środowisko. Jednak ich działanie z zasady ogranicza je do warunków, w których wzrost jest ograniczony przez pojedynczy podstawowy składnik odżywczy. W chemostatach szybkość rozcieńczenia jest dostosowywana tak, aby wzrost komórkowy równoważył dopływ jednego limitującego składnika odżywczego, tym samym ustalając szybkość wzrostu, a nie stężenia poszczególnych składników odżywczych15. Ten rama nie daje się łatwo uogólnić na środowiska zawierające mieszanki podstawialnych składników odżywczych - takich jak wiele źródeł węgla - ponieważ szybkość rozcieńczenia kontroluje tylko ogólną szybkość wzrostu, a nie stężenia każdego składnika w medium16,17. W rezultacie stężenia poszczególnych składników odżywczych i ich współużytkowanie wynikają z wykorzystywania mikroorganizmów, a nie są zewnętrznie określone16,17.
Ponadto, choć fluktuacje składników odżywczych można wywołać w chemostatach, szybkie fluktuacje lub pojedyncze zmiany w skali minut są trudne do osiągnięcia ze względu na zwykle duże objętości kultur. Urządzenia mikrofluidalne stały się potężnymi narzędziami do tworzenia precyzyjnych, niskokoncentracyjnych i fluktuujących środowisk odżywczych14. W połączeniu z mikroskopią wideo umożliwiają pomiar wzrostu pojedynczych komórek. Chociaż systemy mikrofluidalne pozwalają na ilościową ocenę ekspresji wybranych białek za pomocą fluorescencyjnych reporterów, w przeciwieństwie do chemostatów, typowe urządzenia mikrofluidalne są zbyt małe, aby wyprodukować biomasę potrzebną do analiz omic, na przykład do badania proteomu populacji bakterii. Aby wypełnić tę lukę, opracowałeś urządzenie do ciągłej kultury w skali milifluidalnej (MCCD).
MCCD umożliwia wzrost bakterii w kontrolowanych warunkach odżywczych, w tym stałych warunkach niskoodżywczych z minimalnym lub żadnym wyczerpaniem, a także warunkach fluktuujących składników odżywczych, dzięki ciągłemu systemowi kultury, który jest w stanie wytworzyć wystarczającą biomasę do dalszych analiz. MCCD używa filtra PVDF o przepływie 0,45 μm jako naczynia do hodowli, w którym medium jest ciągle uzupełniane przez pompę perystaltyczną dostarczającą świeże medium z zbiornika (Rysunek 1A). Porowata membrana filtra zatrzymuje bakterie, jednocześnie pozwalając na przepływ składników odżywczych według zalecenia, co zapobiega

<table><tbody><tr><td>1K Ohm Resistor</td><td>BC Robotics</td><td>ELC-021</td><td>Power Rating: 1/6 W</td></tr><tr><td>1N4001 Diode</td><td>BC Robotics</td><td>ELC-001</td><td>DC Reverse Voltage: 50 V; Average Rectified Current: 1 A</td></tr><tr><td>3-stop platinum-cured silicone peristaltic tubing</td><td>Innofluid</td><td>SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8</td><td>Inner diameter 0.8 mm; outer diameter 2.4 mm; compatible with peristaltic pump used</td></tr><tr><td>3-way Solenoid valves</td><td>Emerson Electric Co. </td><td>0055A301L0T00F3</td><td>12 V DC, 1 W</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td>Suitable for autoclaving</td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev4</td><td>Arduino</td><td>SKU ABX00173</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec</td><td>D-200</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Cap closure with three ports – for 1 and 2 L bottles</td><td>Nalgene</td><td>2162-0531</td><td>Or different company (make sure they fit the selected bottles)</td></tr><tr><td>Cap closure with three ports – for 4 L bottle</td><td>Nalgene</td><td>2162-0830</td><td>Or different company (make sure they fit the selected bottles)</td></tr><tr><td>Cell density meter CO8000</td><td>WPA biowave</td><td></td><td>OD meter</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Centrifuge that fits 50 mL Falcon tubes</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Centrifuge that fits 1.5 and 2 mL eppendorf tubes</td></tr><tr><td>Conical centrifuge tube - 50 mL</td><td>Fischer Scientific</td><td>10788561</td><td>Falcon tube</td></tr><tr><td>Culture tubes (14 mL, sterile)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td>Culture tubes</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>493511</td><td>Dilute to 70%</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman</td><td>C09756</td><td>CYTOFlex</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Graduated cylinder - 500 mL</td><td>Nalgene</td><td>3662-0500 </td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Incubator box</td><td></td><td></td><td>Custom-built incubator box – contact corresponding authors for construction details</td></tr><tr><td>LabV1 Intelligent Low Flow Rate Peristaltic Pump</td><td>Innofluid</td><td>SE-LABV1-AMC12(10)</td><td>Available at Darwin Microfluidics</td></tr><tr><td>Male Luer-to-barb fitting</td><td>Aldrich</td><td>Z277142</td><td>Male Luer-to-barb adapter compatible with 0.8 mm ID tubing (see Figure 1C)</td></tr><tr><td>Male Luer-to-threaded fitting</td><td>Aldrich</td><td>Z277142</td><td>Used to connect the solenoid valve to the "inlet tubing" (see Figure 1D)</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2022b or later</td><td>Software to run the custom-made software for the solenoid valves</td></tr><tr><td>MOPS EZ Rich Defined Medium Kit</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>MOPS medium for Enterobacteria</td></tr><tr><td>One-way Luer check valve</td><td>Masterflex</td><td>30505-92</td><td>Prevents backflow into medium reservoirs</td></tr><tr><td>Pipe cutter - 0-37 mm</td><td>KS Tools</td><td>2222051</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Pipette set</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/16 in</td><td>Nalgene</td><td>8060-0020</td><td>Inner diameter 1/16 in (1.6 mm); used for fluctuating-nutrient experiments</td></tr><tr><td>Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/8 in</td><td>Nalgene</td><td>8060-0030</td><td>Inner diameter 1/8 in (3.2 mm); used for fluctuating-nutrient experiments</td></tr><tr><td>Polypropylene copolymer bottle - 1 L </td><td>Nalgene</td><td>2126-1000</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Polypropylene copolymer bottle - 2 L</td><td>Nalgene</td><td>2126-2000</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Polypropylene copolymer bottle - 4 L</td><td>Nalgene</td><td>2126-4000</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Serological pipette - 5 mL</td><td>Corning</td><td>CLS4487</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Solderless Breadboard</td><td>BC Robotics</td><td>PROTO-001</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-HV filter - 0.45 µm PVDF</td><td>Millipore</td><td>SVHV01015</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td>Nucleic acid stain for cell counting in flow cytometer</td></tr><tr><td>TIP120 Darlington Transistor</td><td>BC Robotics</td><td>TRN-005</td><td></td></tr><tr><td>Tubes - 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>Tubes for centrifuging cell cultures and storing pellets</td></tr><tr><td>Vent filter</td><td>Millex</td><td>SLFG05000</td><td>0.2 µm hydrophobic vent filter</td></tr><tr><td>Waste receptacle</td><td></td><td></td><td>Volume capacity should be at least the total media volume to be used in the experiment</td></tr></tbody></table>

urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

A Continuous Culture Millifluidic Device for the Study of Escherichia coli under Low and Fluctuating Nutrient Conditions

Środowiska mikrobów w naturze często charakteryzują się niskimi stężeniami mieszanych składników odżywczych, przestrzenną niejednorodnością i czasowymi wahaniami. Jednak tradycyjne metody hodowli laboratoryjnej nie radzą sobie z odtworzeniem tych warunków. Kultury wsadu nie mogą utrzymać wzrostu w środowiskach o niskiej zawartości składników odżywczych, podczas gdy chemostaty utrzymują wzrost w stanie stacjonarnym z pojedynczym ograniczającym składnikiem odżywczym, ale są trudne do zaimplementowania, gdy celem jest utrzymanie określonych niskich stężeń mieszanek składników odżywczych lub wprowadzenie szybkiej fluktuacji. Systemy mikrofluidyczne generują dynamiczne środowiska, ale dają niewystarczającą biomasę do analiz omicznych na poziomie populacji. Aby zapobiec tym ograniczeniom, wprowadzamy urządzenie do ciągłej kultury mikrofluidycznej (MCCD), wszechstronną platformę do badania reakcji mikroorganizmów na stabilne i zmieniające się warunki odżywcze. MCCD mieści populacje bakterii wewnątrz filtra Sterivex (0,45 µm poli(chlorowcodan winylu) [PVDF] porowata membrana filtrująca), gdzie ciągły przepływ medium utrzymuje stabilne warunki kultury, zapobiegając jednocześnie wyczerpaniu składników odżywczych. Trójdzielny system zaworów elektromagnetycznych, sterowany za pomocą niestandardowego oprogramowania Matlab, umożliwia precyzyjne, minutowe wahaniu składników odżywczych. Ten protokół zapewnia krokową instrukcję obsługi MCCD w dwóch trybach: (1) stałe warunki niskiego stężenia składników odżywczych i (2) warunki wahadłowego stężenia składników odżywczych. Korzystając z tego systemu, Escherichia coli rosła eksponentowalnie w mieszaninie aminokwasów i nukleobaz obecnych w stężeniach od dziesiątek do setek nanomolarów, osiągając stężenia komórek na rzędzie 109 komórek/mL. Poprzez odtworzenie kluczowych cech naturalnych środowisk mikrobiologicznych, MCCD umożliwia badanie wzrostu i fizjologii bakterii w kontrolowanych, ale ekologicznie istotnych warunkach w E. coli i innych gatunkach mikroorganizmów.

W tym badaniu zastosowano MCCD do ilościowego określenia szybkości wzrostu E. coli NCM3722 w stałych warunkach niskich stężeń składników odżywczych przy trzech stężeniach RDM. Stężenia te zostały wyprowadzone z formuły bogato zdefiniowanego podłoża (RDM) opisanej przez Neidhardt19, przy czym suplementy aminokwasowe i nukleobazowe zostały rozcieńczone do 0,5%, 0,25% i 0,01% oryginalnej receptury, odpowiednio.
Aby określić szybkość wzrostu, wykonano replikowane e...

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Microbial habitats in nature are often characterized by low concentrations of mixed nutrients, spatial heterogeneity, and temporal fluctuations. However, ...

Moje badania koncentrują się na badaniu, jak bakterie przystosowują się fizjologicznie do niskich i wahających się warunków odżywczych, typowym dla naturalnych środowisk. Konwencjonalne systemy uprawy słabo replikują niskie dynamiczne warunki odżywcze, podczas gdy nasz system umożliwia uprawę w tych istotnych środowiskowo warunkach. Przygotuj kulturę na noc przed eksperymentem.Przygotuj pre-kulturę, dodając sześć mikrolitrów kultury nocnej do probówki zawierającej sześć mililitrów pełnego bogatym zdefiniowanym podłożem, lub RDM. Podziel mieszaninę równo na dwie 15-mililitrowe probówki kulturowe i oznaczyć je jako A i B. Inkubaować obie probówki w 37 stopniach Celsjusza, z mieszaniem przy 200 RPM. Monitorować gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą probówki B i nie kontynuować, aż gęstość optyczna osiągnie około 0,5.Podczas inkubacji, przygotować podłoże Low RDM i przydzielić całkowitą objętość na butelki dla różnych punktów czasowych. Następnie uszczelnić każdą butelkę za pomocą nakrętek wyposażonych w trzy rurki. Podłączyć trzecią najszerszą silikonową rurkę do 0,2-mikrometrowego filtra wentylacyjnego do sterylnej wymiany powietrza.Przymocować jeden koniec każdej rurki perystaltycznej wyposażonej w złącza Luer lock męskie do silikonowych rurek o mniejszej średnicy. Pozostawić folię aluminiową na wolnym złączu Luer lock męskim na drugim końcu rurek perystaltycznych do momentu rozpoczęcia eksperymentu, aby zapobiec skażeniu. Umieścić butelki i pompę perystaltyczną w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza.Zabezpieczyć wszystkie rury perystaltyczne w kanałach tej samej głowicy pompy, zapewniając identyczne prędkości przepływu na wszystkich filtrach. Rozcieńczyć pre-kulturę w proporcji 1 do 10, dodając 600 mikrolitrów kultury do probówki zawierającej 5,4 mililitra Low RDM. Za pomocą pipety jednomilitrowej wprowadzić jeden mililitr rozcieńczonej kultury do każdego z sześciu filtrów poli(winylidenu fluorku), lub PVDF, o przeciwieństwie 0,45 mikrometru.Po przepłukaniu jednokierunkowych zaworów zwrotnych autoklawowanym ultraczystym wodą, przymocować je do każdego końca filtrów. Zdjąć pokrowce aluminiowe z złączek rurowych. Podłączyć każdy filtr do złączek rurowych perystaltycznych.Ustawić prędkość przepływu na dwa mililitry na minutę na pompie perystaltycznej. Umieścić pojemnik na odpady pod filtrami, aby zebrać wypływ, i uruchomić przepływ. Po dwóch godzinach odkręcić jeden z filtrów podłączonych do butelki jednolitrowej, odkręcić zawory jednokierunkowe i umieścić filtr do 50-mililitrowej probówki wirówkowej z wejściem skierowanym w dół.Wirować przez dwie minuty z przyspieszeniem 2000 G. Za pomocą sterylizowanego ścinająca zastosować łagodne ciśnienie na końcu wypływu obudowy z tworzywa sztucznego, aby otworzyć filtr. Zwolnić wewnętrzny cylinder i wyrzucić sekcję zawierającą membranę.Spłukać wewnętrzne ściany obudowy filtra zebranym podłożem kulturowym. Zmierzyć całkowitą zebraną objętość za pomocą 5-mililitrowej pipety serologicznej. Zabrać trzy 100-mikrolityczne alikwoty z próbki i fiksować je za pomocą glutaraldehydu do końcowej koncentracji 1,5% Odkręcić odpowiednie filtry w kolejnych punktach czasowych i powtórzyć procedurę pobierania.Oznaczyć zebrane próbki zgodnie z ich odpowiednim punktem czasowym. Oznaczyć próbki fluorescencyjną farbą DNA i zliczyć komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Z czasem, logarytmiczne 10 przekształcone liczby komórek przebiegały liniowo, wskazując na wzrost wykładniczy we wszystkich warunkach.Szybkości wzrostu wynosiły około 0,88 na godzinę dla warunku 0,5%RDM, 0,64 na godzinę dla warunku 0,25% i 0,18 na godzinę dla warunku 0,01%. Liczby komórek osiągnęły do jednego miliarda komórek na próbkę, co pokazuje, że urządzenie do ciągłej uprawy mikrofluidalnej, lub MCCD, wspiera zarówno wzrost wykładniczy, jak i wysoki wzrost biomasy w stężeniach odżywczych nanomolarowych do mikromolarowych. Komórki rosnące w 0,5%RDM miały większą średnią długość komórek niż komórki rosnące w 0,01%RDM.Głównym wyzwaniem podczas uprawy o niskich stężeniach odżywczych jest utrzymanie odpowiednich gęstości komórek, aby zapobiec zatkaniu, naciskowi i wyczerpaniu składników odżywczych. Postępując zgodnie z tą procedurą, komórki mogą być zebrane do dalszej analizy, w tym proteomiki, metabolomiki i innych podejść omics. Przyszłe badania mogą zbadać adaptację mikroorganizmów do ograniczeń odżywczych i wahań, integrując ten protokół z ilościową analizą omics.

a-continuous-culture-millifluidic-device-for-study-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Źródło: Pioli, R., et al., Modeling of microorganisms and microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje metodę wychwytywania pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie komórek Escherichia coli (E. coli) w pułapkach mikroprzepływowych przy użyciu bezwęglowej zawiesiny i kontrolowanego przepływu, a następnie dodawania składników odżywczych w celu wyzwalania wzrostu i obrazowania fluorescencyjnego mikrokolonii.

Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Źródło: Jian, X. i wsp., Zautomatyzowana uprawa drobnoustrojów i ewolucja adaptacyjna przy użyciu systemu hodowli mikrodrobnoustrojów (MMC). J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje wykorzystanie platformy mikroprzepływowej opartej na kropelkach do monitorowania wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym. Generując jednorodne kropelki zawierające zawiesiny bakteryjne i prowadząc je przez ścieżkę detekcji, system umożliwia ciągły optyczny pomiar gęstości komórek w celu skonstruowania krzywej wzrostu.

Monitorowanie wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym za pomocą mikroprzepływowego systemu hodowli mikrokropelek

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni...

Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.

Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej

Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego i analizy wzrostu drobnoustrojów pod wpływem gwałtownych oscylacji tlenu. Wydajność urządzenia została potwierdzona za pomocą wykrywania tlenu w kanałach płynów i hodowli mikroorganizmów.

Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj urządzenie mikrofluidyczne MCCD do ciągłej hodowli bakterii w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych. Metoda umożliwia badanie fizjologii Escherichia coli w środowiskach przypominających naturalne siedliska mikroorganizmów.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych (Wideo) | JoVE Journal

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Przeglądaj więcej filmów