Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Moje badania koncentrują się na badaniu, jak bakterie przystosowują się fizjologicznie do niskich i wahających się warunków odżywczych, typowym dla naturalnych środowisk. Konwencjonalne systemy uprawy słabo replikują niskie dynamiczne warunki odżywcze, podczas gdy nasz system umożliwia uprawę w tych istotnych środowiskowo warunkach. Przygotuj kulturę na noc przed eksperymentem.

Przygotuj pre-kulturę, dodając sześć mikrolitrów kultury nocnej do probówki zawierającej sześć mililitrów pełnego bogatym zdefiniowanym podłożem, lub RDM. Podziel mieszaninę równo na dwie 15-mililitrowe probówki kulturowe i oznaczyć je jako A i B. Inkubaować obie probówki w 37 stopniach Celsjusza, z mieszaniem przy 200 RPM. Monitorować gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą probówki B i nie kontynuować, aż gęstość optyczna osiągnie około 0,5.

Podczas inkubacji, przygotować podłoże Low RDM i przydzielić całkowitą objętość na butelki dla różnych punktów czasowych. Następnie uszczelnić każdą butelkę za pomocą nakrętek wyposażonych w trzy rurki. Podłączyć trzecią najszerszą silikonową rurkę do 0,2-mikrometrowego filtra wentylacyjnego do sterylnej wymiany powietrza.

Przymocować jeden koniec każdej rurki perystaltycznej wyposażonej w złącza Luer lock męskie do silikonowych rurek o mniejszej średnicy. Pozostawić folię aluminiową na wolnym złączu Luer lock męskim na drugim końcu rurek perystaltycznych do momentu rozpoczęcia eksperymentu, aby zapobiec skażeniu. Umieścić butelki i pompę perystaltyczną w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza.

Zabezpieczyć wszystkie rury perystaltyczne w kanałach tej samej głowicy pompy, zapewniając identyczne prędkości przepływu na wszystkich filtrach. Rozcieńczyć pre-kulturę w proporcji 1 do 10, dodając 600 mikrolitrów kultury do probówki zawierającej 5,4 mililitra Low RDM. Za pomocą pipety jednomilitrowej wprowadzić jeden mililitr rozcieńczonej kultury do każdego z sześciu filtrów poli(winylidenu fluorku), lub PVDF, o przeciwieństwie 0,45 mikrometru.

Po przepłukaniu jednokierunkowych zaworów zwrotnych autoklawowanym ultraczystym wodą, przymocować je do każdego końca filtrów. Zdjąć pokrowce aluminiowe z złączek rurowych. Podłączyć każdy filtr do złączek rurowych perystaltycznych.

Ustawić prędkość przepływu na dwa mililitry na minutę na pompie perystaltycznej. Umieścić pojemnik na odpady pod filtrami, aby zebrać wypływ, i uruchomić przepływ. Po dwóch godzinach odkręcić jeden z filtrów podłączonych do butelki jednolitrowej, odkręcić zawory jednokierunkowe i umieścić filtr do 50-mililitrowej probówki wirówkowej z wejściem skierowanym w dół.

Wirować przez dwie minuty z przyspieszeniem 2000 G. Za pomocą sterylizowanego ścinająca zastosować łagodne ciśnienie na końcu wypływu obudowy z tworzywa sztucznego, aby otworzyć filtr. Zwolnić wewnętrzny cylinder i wyrzucić sekcję zawierającą membranę.

Spłukać wewnętrzne ściany obudowy filtra zebranym podłożem kulturowym. Zmierzyć całkowitą zebraną objętość za pomocą 5-mililitrowej pipety serologicznej. Zabrać trzy 100-mikrolityczne alikwoty z próbki i fiksować je za pomocą glutaraldehydu do końcowej koncentracji 1,5% Odkręcić odpowiednie filtry w kolejnych punktach czasowych i powtórzyć procedurę pobierania.

Oznaczyć zebrane próbki zgodnie z ich odpowiednim punktem czasowym. Oznaczyć próbki fluorescencyjną farbą DNA i zliczyć komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Z czasem, logarytmiczne 10 przekształcone liczby komórek przebiegały liniowo, wskazując na wzrost wykładniczy we wszystkich warunkach.

Szybkości wzrostu wynosiły około 0,88 na godzinę dla warunku 0,5%RDM, 0,64 na godzinę dla warunku 0,25% i 0,18 na godzinę dla warunku 0,01%. Liczby komórek osiągnęły do jednego miliarda komórek na próbkę, co pokazuje, że urządzenie do ciągłej uprawy mikrofluidalnej, lub MCCD, wspiera zarówno wzrost wykładniczy, jak i wysoki wzrost biomasy w stężeniach odżywczych nanomolarowych do mikromolarowych. Komórki rosnące w 0,5%RDM miały większą średnią długość komórek niż komórki rosnące w 0,01%RDM.

Głównym wyzwaniem podczas uprawy o niskich stężeniach odżywczych jest utrzymanie odpowiednich gęstości komórek, aby zapobiec zatkaniu, naciskowi i wyczerpaniu składników odżywczych. Postępując zgodnie z tą procedurą, komórki mogą być zebrane do dalszej analizy, w tym proteomiki, metabolomiki i innych podejść omics. Przyszłe badania mogą zbadać adaptację mikroorganizmów do ograniczeń odżywczych i wahań, integrując ten protokół z ilościową analizą omics.