Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy
22 maja 2026
Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.
Kierunek naszych badań to opracowanie i walidacja nowych kandydatów do leków przeciw gruźlicy, które mają na celu rozwijanie strategii terapeutycznych. Zapobiegawcza linia przesiewowa fenotypową można wykorzystać w poszukiwaniu nowych leków przeciwko szczepom mycobacterium tuberculosis. Na początek, należy zebrać wymagane odczynniki i przystąpić do przygotowania mieszaniny reakcyjnej przy użyciu przedstawionych proporcji.
Mieszaninę reakcyjną mieszaj przez 16 godzin w 85 stopniach Celsjusza. Użyj oparówka rotacyjnego aby usunąć rozpuszczalnik. Dodaj około 20 mililitrów nasyconej soli sodowej bikarbonatowej do pozostałości.
Przefiltruj tę zawiesinę za pomocą 11 mikrometrowego papieru filtrującego z celulozy aby zebrać pozostałe stałe. Pozostałe stałe rozpuść w 50 mililitra chloroformu. Użyj lejka oddzielającego aby spłukać roztwór chloroformu 15 mililitrów wody trzykrotnie.
Każdorazowo usuwaj warstwę wodną. Dodaj bezwodny siarczan sodu do fazy organicznej aby usunąć pozostałą wodę i wysuszyć. Po odparowaniu rozpuszczalnika, przemyj wynikający zielony osad czterokrotnie 10 mililitra gorącego heksanu w około 50 stopniach Celsjusza.
Do jednego miligrama Związku 6 dodaj jeden mililitr jednej do jednego mieszaniny acetonitrylu i metanolu aby przygotować roztwór stockowy. Rozcieńcz roztwór stockowy do 0,5 miligrama na mililitr i przefiltruj go przed analizą. Wprowadź próbkę do systemu HPLC.
Użyj oprogramowania do pozyskiwania i przetwarzania danych chromatograficznych. Ustaw metodę chromatograficzną tak, aby używać kolumny fazy odwrotnej C18 o wymiarach 250 na 4,6 milimetrów o wielkości cząstek pięciu mikrometrów. Ustaw prędkość przepływu na 1,5 mililitra na minutę, i ustaw detekcję UV na 254 nanometrach.
Ustaw gradient jak przedstawiono z zaprogramowanymi zmianami składu fazy ruchomej. Przenieś około 15 do 20 miligramów Związku 6 do rury NMR lub NMR. Rozpuść go w odpowiedniej objętości DMSOD6.
Gdy parametry pozyskiwania są ustawione jak przedstawiono, pozyskaj spektrum NMR protonów używając standardowej sekwencji impulsowej. Dostosuj parametry pozyskiwania. Uruchom spektrum NMR protonów i węgla 13 i podaj przesunięcia chemiczne w ułamkach procentowych.
Zwizualizuj i przetwórz dane NMR z plikiem rozpadu swobodnej indukcji uzyskanym z eksperymentu. Dla chromatograficznej czyszczenia Związku 6, napełnij kolumnę żelem krzemionkowym. Wprowadź surowy Związek 6 do kolumny.
Elutuj związek i zbieraj frakcje. Monitoruj frakcje za pomocą chromatografii warstwowej i łącz frakcje zawierające czysty produkt. Dodaj 100 mikrolilitrów bulionu 7H9 uzupełnionego o 10%albuminę dekstrozę katalazę lub ADC do kolumny 12 płytki 96-dołkowej.
Następnie przenieś 100 mikrolilitrów bulionu 7H9 zawierającego 10%ADC i 5%DMSO do kolumny 11. A następnie sekwencyjnie od kolumny dziewięciu do jednej. Dodaj 200 mikrolilitrów roztworu związku do kolumny 10, przypisując jedną rząd na związek.
Za pomocą pipety przenieś 100 mikrolilitrów roztworu związku w dwukrotnie wyższym maksymalnym stężeniu testowym do kolumny 12 płytki 96-dołkowej. Przenieś 100 mikrolilitrów z kolumny 10 do kolumny dziewięciu i dobrze wymieszaj za pomocą pipety aby rozpocząć dwukrotne rozcieńczanie szeregowego. Kontynuuj szeregowego rozcieńczania sekwencyjnie aż do kolumny jednej.
Dodaj 100 mikrolilitrów zawiesiny bakteryjnej mycobacterium tuberculosis sekwencyjnie od kolumny 11 do kolumny jednej i przykryj płytkę. Uszczelnij płytkę parafilmem i inkubuj w 37 stopniach Celsjusza przez siedem dni. Następnie dodaj 60 mikrolilitrów 0,01% roztworu resazuryny do każdego dołka płytki i przykryj.
Uszczelnij płytkę parafilmem i inkubuj w 37 stopniach Celsjusza przez 48 godzin. Następnie sprawdź zmianę koloru z niebieskiego na różowy. Przygotuj roztwór roboczy 0,5 miligrama na mililitr MTT w bezsurowicowym DMEM.
Uzyskaj komórki Vero i HEPG2 traktowane Związkiem 6 przez 48 godzin i zbadaj je aby ocenić efekty leczenia. Aspiruję medium z płytek i dodaj 50 mikrolilitrów roztworu roboczego MTT do każdego dołka w warunkach niskiej światłości otoczenia. Po trzech godzinach inkubacji, dodaj 100 mikrolilitrów DMSO do każdego dołka aby rozpuścić kryształki Formazanu w warunkach niskiej światłości otoczenia.
Umieść płytkę na orbicie shakerze z prędkością 100 RPM przez 15 minut, zachowując ją przed światłem. Zbadaj dołki kontrolne aby potwierdzić całkowite rozpuszczenie kryształów. Umieść płytkę w czytniku płytek.
Ustaw długość fali referencyjnej od 630 do 690 nanometrów i sprawdź absorpcję na 570 nanometrach. Przygotuj roztwór roboczy czerwieni neutralnej 40 mikrogramów na mililitr w bezsurowicowym DMEM. Następnie przygotuj roztwór desorpcji czerwieni neutralnej zawierający 1% kwasu lodowcowatego, 49%etanol, i 50%ultraczystej wody objętościowo.
Gdy efekt Związku 6 zostanie oceniony na komórkach Vero i
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia podejście do przesiewania fenotypowego w celu identyfikacji i wczesnej oceny nowych kandydatów na leki przeciwprątkowe (przeciwgruźlicze). Metoda ta integruje syntezę związków, ocenę aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz testy cytotoksyczności, aby ułatwić odkrycie selektywnych i skutecznych środków przeciwgruźliczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chemia medyczna
- Mikrobiologia
- Farmakologia
- Odkrywanie leków
Wstęp
- Gruźlica pozostaje jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu chorób zakaźnych na świecie.
- Wzrasta liczba szczepów gruźlicy lekoopornych, co wymusza poszukiwanie nowych środków terapeutycznych.
- Przesiewy fenotypowe stanowią cenną strategię identyfikacji związków o aktywności przeciwgruźliczej.
- Wczesna ocena zarówno skuteczności przeciwdrobnoustrojowej, jak i cytotoksyczności jest kluczowa dla rozwoju leków.
Cel badania
- Dostarczenie powtarzalnego protokołu syntezy i oceny potencjalnych związków przeciwprątkowych.
- Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności związków kandydackich.
- Obliczenie indeksu selektywności (SI) w celu priorytetyzacji związków o potencjale terapeutycznym.
Zastosowane metody
- Synteza związku 4-aminochinolinowego za pomocą trzystopniowej ścieżki chemicznej.
- Charakterystyka związku z wykorzystaniem HPLC, spektroskopii NMR oraz HRMS.
- Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec Mycobacterium tuberculosis z zastosowaniem mikropłytkowego testu redukcji rezazuryny (REMA) w celu oznaczenia minimalnego stężenia hamującego (MIC).
- Ocena cytotoksyczności w liniach komórkowych Vero i HepG2 przy użyciu testów MTT oraz wychwytu czerwieni neutralnej (NRU).
Główne wyniki
- Protokół umożliwia oznaczenie wartości MIC dla związków kandydackich przeciwko M. tuberculosis.
- Profile cytotoksyczności są ustalane w dwóch liniach komórek ssaków przy użyciu komplementarnych testów.
- Obliczenie indeksu selektywności (SI) integruje dane dotyczące skuteczności i bezpieczeństwa dla każdego związku.
- Podejście to wspiera wczesną identyfikację obiecujących kandydatów na leki przeciwprątkowe.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje ramy postępowania krok po kroku w celu identyfikacji hitów przeciwgruźliczych oraz ich oceny przedklinicznej.
- Połączenie testów przeciwdrobnoustrojowych i cytotoksyczności zwiększa wiarygodność wyboru kandydatów.
- Metoda ta jest odpowiednia do powtarzalnych i skalowalnych działań w zakresie odkrywania leków celujących w gruźlicę.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wczesne etapy odkrywania leków przeciwprątkowych napotykają znaczne trudności w identyfikacji związków wykazujących zarówno silną aktywność przeciwdrobnoustrojową, jak i akceptowalny profil bezpieczeństwa. Niniejszy protokół integruje screening fenotypowy, ilościowe oznaczenie MIC oraz ocenę cytotoksyczności w dwóch testach, aby zapewnić pewność predykcyjną przy wyborze hitów. Podejście to wspiera optymalizację portfela projektów poprzez dostarczenie powtarzalnych ram oceny potencjału terapeutycznego w fazie przedklinicznej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację aktywności przeciwprątkowej poprzez bezpośredni screening fenotypowy przeciwko Mycobacterium tuberculosis.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez integrację danych dotyczących skuteczności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności wobec komórek ssaków.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie oddziaływania na cel oraz priorytetyzacji związków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane, ilościowe testy REMA oraz cytotoksyczności w celu wiarygodnej oceny związków.
- Zapewnia powtarzalność i standaryzację testów w obrębie bibliotek związków.
- Generuje ilościowe wyniki MIC oraz indeksów selektywności dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki wczesnych etapów odkrywania z wymogami bezpieczeństwa przedklinicznego poprzez integrację danych o cytotoksyczności z dwóch linii komórkowych ssaków.
- Wspiera ciągłość translacyjną, dostarczając wskaźników selektywności, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez walidację krzyżową cytotoksyczności z wykorzystaniem komplementarnych testów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sytuuje badania przesiewowe fenotypowe oraz ocenę cytotoksyczności na styku wczesnej fazy odkrywania i oceny przedklinicznej, wspierając identyfikację i priorytetyzację związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Integruje testowanie hipotez dotyczących aktywności przeciwprątkowej z niezależnymi od szlaków sygnałowych odczytami fenotypowymi.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne dane dotyczące MIC i cytotoksyczności w celu selekcji związków.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe (MIC, SI), umożliwiając porównania między różnymi warunkami i związkami.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną fazę odkrywania z przedklinicznym badaniem bezpieczeństwa poprzez uwzględnienie progów cytotoksyczności dla komórek ssaków.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje skalowalny, powtarzalny schemat postępowania, który można dostosować do szerszych wysiłków w zakresie odkrywania leków przeciwinfekcyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze hitów przeciwgruźliczych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę związków i wspiera powtarzalność wyników pomiędzy zespołami badawczymi.
- Wartość strategiczna: Umożliwia świadome podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój wczesnych kandydatów na leki przeciwgruźlicze.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu chemii medycznej, mikrobiologii oraz opracowywania testów komórkowych.
- Wymagany jest dostęp do HPLC, NMR, HRMS oraz zwalidowanych platform testowych REMA i testów cytotoksyczności.
- Niezbędna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów testowych i analizy danych.
- Metoda jest adaptowalna do innych modeli chorób zakaźnych przy zastosowaniu odpowiednich modyfikacji testów.
- Otrzymanie powtarzalnych wyników zależy od wiarygodnej syntezy i charakterystyki związków.
Często zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:22
Synthesis of 6-Bromo-2-methyl-N-(4-(piperidin-1-yl)phenyl)quinolin-4-amine
1:37
Characterization of Compound 6 Using HPLC
2:36
Nuclear Magnetic Resonance (1H, 13C) Analysis of Compound 6
3:22
Purification of Compound 6 by Column Chromatography
3:49
Minimal Inhibitory Concentration Determination Using Resazurin Assay
5:37
Cytotoxicity Assessment by MTT Assay
6:49
Neutral Red Uptake Assay for Cytotoxicity Assessment
8:09
Results
9:52
Conclusion
