Name: Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Przewodnik krok po kroku po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj protokół syntezy i oceny nowych związków przeciwgruźliczych z wykorzystaniem Mycobacterium tuberculosis oraz linii komórkowych ssaków. Metoda integruje oznaczanie MIC i testy cytotoksyczności dla wczesnej identyfikacji kandydatów na leki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana przez Narodowy Instytut Nauki i Technologii w dziedzinie Gruźlicy (MCTI/CNPq/SECTICS/MS/CAPES/FAPERGS, nr grantu 404838/2024-0), CNPq/MCTI nr 44/2024 – Universal (nr grantu 420934/2025-1) oraz FAPERGS 06/2025 – PqG (nr grantu 25/2551-00002734-9). C.V.B (CNPq, nr grantu 311949/2019-3), L.A.B. (CNPq, nr grantu 303499/2021-4) oraz P.M. (CNPq, nr grantu 310888/2022-0) są laureatami Nagrody dla Kariery Badawczej CNPq. Niniejsze badania były w części sfinansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES), kod finansowania 001.

<ol><li>Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis.</a> Nat Rev Dis Primers. 2, 16076(2016).</li>
<li>Salgame, P., Geadas, C., Collins, L., Jones-López, E., Ellner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+tuberculosis+infection+%E2%80%93+Revisiting+and+revising+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Latent tuberculosis infection – Revisiting and revising concepts.</a> Tuberculosis. 95 (4), 373-384 (2015).</li>
<li>Lyon, S. M., Rossman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Pulmonary tuberculosis.</a> Microbiol Spectr. 5 (1), (2017).</li>
<li>Houben, R. M., Dodd, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+latent+tuberculosis+infection%3A+a+re-estimation+using+mathematical+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The global burden of latent tuberculosis infection: a re-estimation using mathematical modelling.</a> PLoS Med. 13 (10), e1002152(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report+2025%22">Global tuberculosis report 2025</a>. , World Health Organization. (2025).</li>
<li>Larkins-Ford, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+measurement+of+combination-drug+landscapes+to+predict%C2%A0in+vivo%C2%A0treatment+outcomes+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Systematic measurement of combination-drug landscapes to predict in vivo treatment outcomes for tuberculosis.</a> Cell Syst. 12 (11), 1046-1063.e7 (2021).</li>
<li>Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistant+Tuberculosis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Drug resistant Tuberculosis: A review.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 24 (6), 101574(2021).</li>
<li>Alsayed, S. S. R., Gunosewoyo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+Pathogenesis%2C+Current+Treatment+Regimens+and+New+Drug+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: Pathogenesis, Current Treatment Regimens and New Drug Targets.</a> Int J Mol Sci. 24 (6), 5202(2023).</li>
<li>Pauli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+new+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+InhA+enzyme+using+virtual+screening+and+a+3D-pharmacophore-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovery of new inhibitors of Mycobacterium tuberculosis InhA enzyme using virtual screening and a 3D-pharmacophore-based approach.</a> J Chem Inf Model. 53 (9), 2390-2401 (2013).</li>
<li>Paz, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+4-aminoquinolines%3A+Synthesis%2C+inhibition+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+enoyl-acyl+carrier+protein+reductase%2C+antitubercular+activity%2C+SAR%2C+and+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel 4-aminoquinolines: Synthesis, inhibition of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-acyl carrier protein reductase, antitubercular activity, SAR, and preclinical evaluation.</a> J Med Chem. 245 (Pt 1), 114908(2023).</li>
<li>Quemard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+characterization+of+the+target+for+isoniazid+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic characterization of the target for isoniazid in tuberculosis.</a> Biochemistry. 34, 8235-8241 (1995).</li>
<li>Parish,, Tanya,, Roberts,, David, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParish%2C++%22Mycobacteria+Protocols%22">Mycobacteria Protocols</a>. , Third edition, Humana Press. New York. (2015).</li>
<li>Franzblau, S. G., DeGroote, M. A., Cho, S. H., Andries, K., Nuermberger, E., Orme, I. M., Mdluli, K., Angulo-Barturen, I., Dick, T., Dartois, V., Lenaerts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinburgh%2C+Scotland%29%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinburgh, Scotland). 92 (6), 453-488 (2012).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A., Camacho, M., Guerra, H., Swings, J., Portaels, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resazurin+microtiter+assay+plate%3A+simple+and+inexpensive+method+for+detection+of+drug+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).</li>
<li>Riss, T. L. Cell Viability Assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2016).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+red+uptake+assay+for+the+estimation+of+cell+viability%2Fcytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1125-1131 (2008).</li>
</ol>

Autor(zy) nie zgłosili żadnych potencjalnych konfliktów interesów.

Podejście do badania fenotypowskiego, które opiera się na aktywności całej komórki, a nie izolowanych enzymów, jest skuteczną strategią identyfikacji aktywnych związków przeciwko M. tuberculosis. Tutaj opisano wstępne kroki tego podejścia, obejmujące syntezę chemiczną związku kandydackiego, ocenę jego aktywności hamującej poprzez oznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) oraz ocenę jego cytotoksyczności w komórkach ssaczy (Vero i HepG2) za pomocą testów MTT i NRU.
Ścieżka syntezy składała się z trzech głównych kroków (Rysunek 1), która zapewnia docelowy związek o wysokiej czystości przy użyciu operacyjnie prostych transformacji. Kilka kluczowych kroków zostało zidentyfikowanych jako determinant wpływających na reprodukcyjność i efektywność. Wstępna kondensacja wymaga precyzyjnej kontroli stechiometrycznej i utrzymanego refluksu, aby zapewnić pełne utworzenie pośrednich produktów. Niekompletne usunięcie rozpuszczalnika przed termiczną cyklizacją może negatywnie wpłynąć na efektywność zamknięcia pierścienia. Sam krok cyklizacji wymaga ścisłej kontroli temperatury, ponieważ niewystarczające ogrzewanie prowadzi do niekompletnej aromatyzacji, podczas gdy nadmierne lub przedłużone ogrzewanie może prowadzić do tworzenia produktów ubocznych. Podczas chlorowania zaleca się ostrożną kontrolę temperatury reakcji i stopniowe dodawanie chlorku fosforyla, aby zminimalizować reakcje uboczne i zapewnić selektywną aktywację w pozycji 4. Podczas optymalizacji metody, drobne korekty proceduralne poprawiły trwałość. W przypadkach niekompletnej precipitacji po cyklizacji, stopniowe chłodzenie zamiast szybkiego gaszenia poprawiło odzyskiwanie substancji stałych. Jeśli zaobserwowano obniżone plony w etapie substytucji nukleofilowej, przedłużenie czasu reakcji lub weryfikacja czystości aminy okazały się korzystne.
Główne ograniczenia metody to potrzeba cyklizacji w wysokiej temperaturze i skorodowanych środków chlorujących, takich jak chlorek fosforyla, wymagających specyficznej infrastruktury laboratorium i bezpieczeństwa. Efekty elektronowe substytuentów mogą wymagać ponownej optymalizacji dla różnych anilin lub amin, ograniczając szerokie zróżnicowanie szkieletu bez adaptacji. Jednak podejście Conrad-Limpach jest operacyjnie prostsze niż syntezy typu Skraup (surowe utleniacze) lub protokoły katalizowane metalami przejściowymi (specjalistyczne katalizatory/inertne atmosfery). Ta bezprzetworowa strategia wydajnie daje funkcjonalizowane pośrednie chinoliny dla chemii medycznej.
Protokół użyty do określenia MIC to test kolorymetryczny, który opiera się na wizualnej inspekcji. Potencjalnym wyzwaniem związanym z tą metodą jest niekompletna zmiana koloru, co skutkuje fioletowym puchem zamiast wyraźnego błękitu (hamowanie) lub różu (wzrost). Jeśli tak się stanie, należy to interpretować jako niepowodzenie w hamowaniu wzrostu prątków. Ponadto, ponieważ związek jest oceniany poprzez seryjne rozcieńczenia, maksymalne testowalne stężenie jest dyktowanie przez rozpuszczalność związku. W rezultacie, w niektórych przypadkach, wynik może być niejasny, jeśli nie zaobserwuje się żadnego hamowania w maksymalnym rozpuszczalnym stężeniu. Co więcej, ważne jest, aby uznać, że inne laboratoria mogą dostosowywać niektóre kroki protokołu do swoich szczególnych warunków, co może prowadzić do różnic w uzyskanych wynikach. Aby zwiększyć wydajność, ten protokół można przystosować do automatyzacji. Zastosowanie systemów do obsługi płynów do przygotowania płytek 96-dołkowych zmniejszyłoby błędy pipetowania, poprawiając dokładność i reprodukcyjność.
Protokół oceny cytotoksyczności wykorzystuje dwie różne linie komórek ssaczy (Vero i HepG2) oraz dwa uzupełniające się testy wydolności (MTT i NRU). Kilka kroków w obrębie tego protokołu jest kluczowych dla zapewnienia reprodukcyjności i dokładności danych, a każde laboratorium powinno przeprowadzić własną weryfikację. Na przykład, początkowa gęstość siewu komórek musi być starannie zoptymalizowana, ponieważ przepełnienie może prowadzić do hamowania kontaktowego i zmienionych stanów metabolicznych, co może zmieszać wyniki, podczas gdy niedostateczne zasiewanie może sprawić, że komórki będą bardziej podatne na drobne obrażenia, potencjalnie nadszacowując toksyczność15. Ponadto, najwyższe testowane stężenie jest często ograniczone przez rozpuszczalność związku, a precipitacja może prowadzić do niedokładnych wyników. Również, sugerowana układ płytki (Rysunek 3A) jest zaprojektowana do pierwotnego przesiewania, maksymalizując liczbę testowanych związków, rezygnując z powtórzeń technicznych i ignorując efekty krawędzi na rzecz weryfikacji poprzez niezależne powtórzenia biologiczne.
Kluczową zaletą tego protokołu jest równoległe zastosowanie zarówno testów MTT, jak i NRU. Podczas gdy oba są dobrze ugruntowane, mierzą one różne parametry komórkowe. Test MTT ocenia aktywność metaboliczną dehydrogenaz mitochondrialnych, która ogólnie koreluje z wydolnością komórek16. Jednakże, ten test jest podatny na interferencje ze strony związków o właściwościach redukujących lub utleniających lub tych, które zakłócają oddychanie mitochondrialne, prowadząc do potencjalnych fałszywych wyników<sup class

Spowodowane przede wszystkim przez pałeczki Mycobacterium tuberculosis (Mtb), gruźlica (TB) jest zakaźną chorobą układu oddechowego u ludzi, która głównie atakuje płuca, choć mogą też wystąpić odmiany pozapłucne. TB rozprzestrzenia się przez powietrze za pomocą wydzielanych przez zakażone osoby prętów Mtb1. W zależności od postępu choroby, osoba zakażona gruźlicą może natychmiast nabawić czynnej gruźlicy. Zazwyczaj jednak, nowo zakażona osoba rozwija gruźlicę ukrytą, gdzie komórki Mtb o niskiej aktywności metabolicznej przeżywają wewnątrz ziarniniak1,2. Osoba z ukrytą gruźlicą może ostatecznie rozwinąć czynną formę choroby, manifestując objawy kliniczne3. Obecnie szacuje się, że jedna czwarta populacji świata ma ukrytą infekcję gruźliczą4.
Mimo wielu postępów, gruźlica nadal jest poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie. Dane z najnowszego Globalnego Raportu o Gruźlicy pokazują, że w 2024 roku chorobę rozwinęło 10,7 miliona ludzi. W tym samym roku, na całym świecie zarejestrowaną liczbę 1,23 miliona zgonów z powodu TB, co czyni gruźlicę główną przyczyną śmierci spowodowane przez pojedynczy czynnik zakaźny5. Oprócz patologii i złożonej biologii Mtb, aspekty socjоеkonomiczne takie jak bieda i niedożywienie, wraz z czynnikami zdrowotnymi takimi jak palenie, cukrzyca i współzakażenie HIV, sprawiają, że kontrola choroby jest jeszcze bardziej trudne5. To przyczynia się do długotrwałej trwałości gruźlicy jako globalnego problemu zdrowotnego.
Poza tym, obecne leczenie gruźlicy ma ograniczenia, które komplikują walkę z chorobą. W przypadku wrażliwych szczepów Mtb, standardowe leczenie składa się z kombinowanej terapii 4 lekami: izoniazyd (INH), ryfampicyna (RIF), etambutol (EMB) i pyrazynamid (PZA). Te antybiotyki są podawane przez minimum 6 miesięcy, wymagając ścisłego przestrzegania w trakcie leczenia. Ten schemat terapeutyczny, mimo że jest skuteczny w większości przypadków i ma wskaźnik sukcesu około 85%, nadal napotyka wiele wyzwań5,6. Wśród największych problemów są działania niepożądane i przedłużona czas stosowania, które często prowadzą do przedwczesnego przerwania kuracji przez pacjenta. To przerwanie, wraz z niewłaściwym podawanie antybiotyków, sprzyja selekcji odpornych szczepów Mtb, które wymagają bardziej toksycznych, drogich i rozległych schematów terapeutycznych7,8.
Mając na uwadze ten scenariusz, rozwój nowych, potężnych leków przeciwgruźliczych jest pilny. Ten protokół opisuje wczesne etapy badań nad nowymi kandydatami do leków za pomocą fenotypowego przesiewania. Aby zilustrować zastosowanie tego protokołu, wybraliśmy pochodną 4-aminochinoliny LABIO-17 do oceny. LABIO-17 zostało wcześniej zidentyfikowane przez naszą grupę badawczą jako inhibitor enoyl-ACP-reduktazy (InhA) enzymu w Mtb, który jest tym samym molekularnym celem jak izoniazyd (INH)9,10. InhA jest zaangażowany w biosyntezę kwasów mykolowych w M. tuberculosis i jest niezbędny dla przetrwania pałeczki, co podkreśla jego znaczenie jako obiecującego molekularnego celu11

<table><tbody><tr><td>LiniA KOMóREK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepG2 (ludzki rak wątrobowokomórkowy)</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Linia komórek ludzkiego raka wątroby</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td><td>ATCC</td><td>25177</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv</td><td>ATCC</td><td>27294</td><td></td></tr><tr><td>Vero (nerkowa małpy zielonej afrykańskiej)</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Pierwotna linia komórek nabłonkowych nerki</td></tr><tr><td>CHEMIA &ndash; SYNTEZA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(Piperydyn-1-yl)anilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TCI: P0887</td><td>Prekursor aminy dla związku 5/6</td></tr><tr><td>4-Bromoanilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-67-8</td><td>Materiał wyjściowy do syntezy chinoliny</td></tr><tr><td>Kwas octowy (lodowato-krzemienny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>Reagent w syntezie i przygotowaniu fazy ruchomej</td></tr><tr><td>Acetonitryl (stopień HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967</td><td>Składnik fazy ruchomej HPLC i rozpuszczalnik NMR</td></tr><tr><td>Clorofform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Rozpuszczalnik do ekstrakcji produktu</td></tr><tr><td>DMSO-d6 (zdeuterowany)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175641</td><td>Rozpuszczalnik NMR</td></tr><tr><td>Dowtherm A (ciecz przenosząca ciepło)</td><td>Sigma-Aldrich / Solutia</td><td>TBD</td><td>Wysokowrzący rozpuszczalnik do cyklizacji termicznej (230&ndash;250 &deg;C); wcześniej wymieniany jako Dowtherm&reg; A</td></tr><tr><td>Etanol (absolutny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>Rozpuszczalnik reakcji dla kroku Conrad&ndash;Limpach</td></tr><tr><td>Octan etylu (stopień HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270989</td><td>Składnik eluentu kolumny</td></tr><tr><td>Acetooctan etylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E12806</td><td>β-ketoestrynowy reagent dla formowania pierścienia chinoliny</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (stopień HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td>0.1% dodatek w fazie ruchomej dla HPLC i HRMS</td></tr><tr><td>Szklane kulki (1 mm, sterylne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Do homogenizacji kultury M. tuberculosis</td></tr><tr><td>HCl (kwas solny, 37%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Kwasowy katalizator w substytucji nukleofilowej</td></tr><tr><td>Heksan (stopień HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34859</td><td>Niepolarny eluent do chromatografii kolumnowej</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td>Rozpuszczalnik reakcji do syntezy związku 6</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4, bezwodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Środek suszący i katalizator reakcji</td></tr><tr><td>Metanol (stopień HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Faza ruchoma HPLC i składnik rozpuszczalnika NMR</td></tr><tr><td>Trójchlorek fosforu (POCl3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td>Reagent chlorujący dla pośredniego związku 4</td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Bazowy katalizator w substytucji nukleofilowej</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy (35&ndash;70 siatki) do chromatografii błyskawicznej</td><td>Macherey-Nagel</td><td>815349</td><td>Faza stacjonarną do etapów chromatografii błyskawicznej</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy 60 &Aring; (70&ndash;230 siatki) do chromatografii kolumnowej</td><td>Macherey-Nagel</td><td>815381</td><td>Faza stacjonarną do chromatografii kolumnowej</td></tr><tr><td>Siarczan sodu (Na2SO4, bezwodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>Środek suszący do fazy organicznej</td></tr><tr><td>Płytki TLC z żelem krzemionkowym 60 F254</td><td>Merck</td><td>1.05554</td><td>Monitorowanie chromatografii warstwowej</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>Rozpuszczalnik do etapie chlorowania</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda</td><td>Millipore / odpowiednik</td><td>N/A</td><td>Używane w przygotowaniu fazy ruchomej; wcześniej odnoszono się do niej jako woda Milli-Q w tekście</td></tr><tr><td>SPRZĘT &amp; INSTRUMENTY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawki 0.22 μm</td><td>Millipore / każdy</td><td>SLGP033RS</td><td>Sterylizacja roztworu reazuryny (2.1.4); filtracja roztworu roboczego MTT (3.3); filtracja roztworu roboczego Czerwieni Neutralnej (3.4)</td></tr><tr><td>Filtr strzykawki 0.45 μm</td><td>Millipore / każdy</td><td>SLHA033SS</td><td>Filtracja roztworów fazy ruchomej</td></tr><tr><td>15 mL stożkowa tuba (sterylna)</td><td>Falcon / każdy</td><td>352097 lub odpowiednik</td><td>Zbieranie i wirowanie zawiesiny komórek po trypsynizacji</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa (płaska dno, traktowana tkankowo)</td><td>Corning / każdy</td><td>3596</td><td>Do testów cytotoksyczności i MIC</td></tr><tr><td>Okładzina aluminiowa</td><td>Każdy</td><td>&mdash;</td><td>Ochrona przed światłem płytek podczas inkubacji MTT i NRU oraz etapów wibracji</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Każdy</td><td>&mdash;</td><td>Sterylizacja medium (121 &deg;C, 98.07 kPa, 10 min)</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego (Klasa II, certyfikowana)</td><td>Każdy (Certyfikowany BSL-3)</td><td>&mdash;</td><td>Wymagany dla manipulacji M. tuberculosis (BSL-3)</td></tr><tr><td>Licznik komórek (zautomatyzowany) lub hemocytometr</td><td>np. Bio-Rad TC20 / Neubauer</td><td>TBD</td><td>Do wyznaczania stężenia komórek i wiabiliności</td></tr><tr><td>Wirówka (zdolna do 200 &times; g)</td><td>Każdy</td><td>&mdash;</td><td>Etap pelletingu komórek</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 (37 &deg;C, 5% CO2

identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu mic i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Identification of Potential Anti-TB Candidates: A Step-by-Step Guide to Synthesis, MIC Determination, and Cytotoxicity Assessment in Mammalian Cells

Tuberkuloza (TB) pozostaje jedną z głównych przyczyn śmierci z powodu pojedynczego czynnika zakaźnego na całym świecie, a rosnące wskaźniki oporności na leki sprawiają, że opracowanie nowych leków terapeutycznych jest priorytetem zdrowia publicznego. Ten protokół opisuje podejście do fenotypowego przesiewania w celu zidentyfikowania potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych w trzech zintegrowanych etapach. Po pierwsze, związek z klasy 4-aminochinoliny jest syntetyzowany drogą trójstopniową i w pełni scharakteryzowany za pomocą chromatografii cieczowej wysokiej rozdzielczości (HPLC), spektroskopii rezonansu magnetycznego jąder (NMR) oraz spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS). Po drugie, aktywność przeciwdrobnoustrojowa związku jest oceniana wobec Mycobacterium tuberculosis za pomocą kolorymetrycznego testu redukcji resazuryny w płytkach mikrotytrajowych (REMA), który określa minimalne stężenie hamujące (MIC) poprzez prosty wizualny odczyt zmiany koloru. Po trzecie, cytotoksyczność związku jest oceniane w dwóch liniach komórek ssaczy, Vero (afrykański zielony nerkowco gryzoni) i HepG2 (ludzki rak wątrobowokomórkowy), za pomocą testu MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) oraz testu neutralnego czerwienia (NRU). Te dwa uzupełniające się testy mierzą odrębne parametry komórkowe, umożliwiając krzyżową walidację wyników cytotoksyczności. Razem, dane MIC i cytotoksyczności pozwalają na obliczenie indeksu selektywności (SI) w celu oceny potencjału terapeutycznego każdego związku. Ten protokół zapewnia powtarzalny, krokowy szkielet dla wczesnego wykrywania przeciwgruźliczych hitów i oceny przedklinicznej.

Synteza pozwoliła na otrzymanie docelowego związku 6 w formie jasnozielonego ciała stałego (0,53 g, wydajność 67%). Związek wykazuje temperaturę topnienia 227–229 °C oraz czystość w UHPLC na poziomie 99% (tR = 14,11 min) (Rysunek 4). Strukturę chemiczną potwierdzono za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości (HRMS). Widmo 1H NMR (Rysunek 5) wykazało sygnały odpowiadające fragmentowi piperydynowemu w zakresie od 1,50 do 3,13 ppm. Grupa metylowa w pozycji 2 pojawiła się jako typowy singlet przy 2,38 ppm. Wodór w pozycji 3 pojawił się jako singlet przy 6,56 ppm. Pierścień fenylowy wykazał dwa dublety przy 6,97 i 7,17 ppm, ze stałą sprzężenia 8,9 Hz. Wodory w pozycjach 7 i 8 utworzyły multiplet przy 7,63–7,75 ppm, natomiast wodór w pozycji 5 rdzenia chinolinowego dał dublet przy 8,59 ppm (J = 2,0 Hz). Wodór grupy aminowej zaobserwowano jako singlet przy 8,66 ppm. Widmo 13C NMR (Rysunek 6) wykazało sygnał przy 23,81 ppm przypisany grupie metylowej w pozycji 2, natomiast sygnały między 24,85 a 49,70 ppm odpowiadały fragmentowi piperydynowemu. Węgiel w pozycji 3 pojawił się przy 100,52 ppm. Pozostałe sygnały przesunięte w pole słabsze przypisano węglom rdzenia chinolinowego i pierścienia fenylowego. HRMS potwierdziło wzór cząsteczkowy związku 6, wykazując jon [M+H]+ przy m/z 396,1063 (obliczone dla C21H23BrN3: 396,1070).
<img alt="Wynik wysokosprawnej chromatografii cieczowej; widmo absorpcyjne UV-VIS; dane analizy piku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig4.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Chromatogram HPLC i widma UV związku 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres spektroskopii NMR przedstawiający wartości przesunięcia chemicznego i przypisania sygnałów dla analizy molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig5.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Widma 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) związku 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres dyfraktogramu rentgenowskiego; analiza struktury krystalicznej; dane o intensywności piku; inżynieria materiałowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig6.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Widma 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) związku 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aktywność hamującą związku przeciwko M. tuberculosis oceniano poprzez wyznaczenie MIC, zdefiniowanej jako najniższe stężenie związku, które całkowicie zapobiega widocznemu wzrostowi bakterii. W teście REMA brak zmiany barwy (pozostanie koloru niebieskiego) wskazuje na zahamowanie wzrostu, natomiast zmiana na kolor różowy oznacza wzrost bakterii. W charakterze kontroli leków zastosowano izoniazyd (INH) i rifampicynę (RIF). Wyniki przedstawiono na Ryc. 7. Na każdej płytce znajdowała się kontrola wzrostu (kolumna 11, bez leków) oraz kontrola sterylności (kolumna 12, bez prątków). Związki rozcieczano seryjnie od kolumny 10 (najwyższe stężenie) do kolumny 1 (najniższe stężenie). Jak pokazano na Ryc. 7>, wartość MIC dla związku w rzędzie A (izoniazyd) zaobserwowano w kolumnie 4, natomiast wartości MIC dla związków w rzędach B (rifampicyna) i C (związek syntetyzowany) zaobserwowano w kolumnie 5. W naszych badaniach wartości MIC dla INH wyniosły 0,31 µg/mL dla szczepu H37Rv i 0,16 µg/mL dla H37Ra, natomiast dla RIF otrzymano 0,08 µg/mL dla H37Rv i 0,01 µg/mL dla szczepu H37Ra.
<img alt="Wyniki kolorymetrycznego testu na mikro-płytce; rzędy A-C, kolumny 1-12; analiza gradientu stężeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig7.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Oznaczanie minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla Mycobacterium tuberculosis przy użyciu testu z rezazuryną na mikro-płytce (REMA). Rzędy A–C, kolumny 1–10: dwukrotne rozcieńczenia seryjne izoniazydy (rzęd A), ryfampicyny (rzęd B) oraz zsyntezowanego związku (rzęd C). Kolumna 11: kontrola żywotności (podłoże zawierające 2.5% DMSO + bakterie). Kolumna 12: kontrola sterylności (podłoże + związek). Kolor niebieski wskazuje na zahamowanie wzrostu bakterii, natomiast kolor różowy wskazuje na żywotność bakterii wynikającą z redukcji rezazuryny do rezorufiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Reprezentatywna płytka 96-dołkowa dla obu testów, NRU (Vero, góra) i MTT (Vero, dół), przedstawiona jest na Rysunku 3B. Na płytce MTT widoczny jest wyraźny gradient barwy, zmieniający się od przezroczystego (brak żywych komórek) przy wysokich stężeniach związku do głębokiego fioletu (wysoka żywotność komórek) przy niskich stężeniach. Podobnie, płytka NRU wykazuje gradient od przezroczystego do głębokiego różu, co wskazuje na pobieranie barwnika neutral red do lizosomów żywych komórek.
Mikroskopia zapewnia wizualne potwierdzenie stanu testu po 48 h czasie inkubacji (Rycina 8). Rycina 8A porównuje zdrowe, niepoddane działaniu czynnika komórki kontrolne (Vero i HepG2) z komórkami traktowanymi cytotoksycznym stężeniem związku. Komórki traktowane wydają się zaokrąglone, oddzielone od podłoża i niezdolne do przeżycia. Rycina 8B stanowi kluczowy punkt kontroli wizualnej przed końcowym etapem solubilizacji. Przedstawia ona oczekiwane tworzenie się ciemnofioletowych kryształów formazanu wewnątrz żywych komórek (test MTT) oraz gromadzenie się czerwonego barwnika w lizosomach (test NRU) w obu typach komórek.
Surowe dane absorbancji znormalizowano względem kontroli nośnika i przeanalizowano za pomocą regresji nieliniowej w celu wygenerowania krzywych zależności dawka-odpowiedź, zgodnie ze szczegółami opisanymi w kroku 3.5 protokołu. Dla związku docelowego 6 (pochodnego LABIO-17) analiza ta wykazała wartość CC50 wynoszącą 12,2 µM (Vero) i 18,3 µM (HepG2) w teście NRU oraz CC50 &gt;20 µM dla obu linii komórkowych w teście MTT. Przełożyło się to na indeks selektywności (SI) w zakresie od 30,5 do &gt;50, co zostało zgłoszone we wcześniejszych doniesieniach10.
<img alt="Wyniki testu żywotności komórek; komórki Vero, HepG2, związek toksyczny; metody MTT, NRU, wykres porównawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig8.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe z testów cytotoksyczności w komórkach Vero i HepG2. Wszystkie zdjęcia wykonano przy powiększeniu 100x. (A) Porównanie morfologii komórek po 48 h traktowania. Niepoddane działaniu kontrolne studzienki dla komórek Vero (góra) i HepG2 (dół) wykazują zdrową, konfluencyjną monowarstwę. W przeciwieństwie do nich, komórki traktowane cytotoksycznym stężeniem związku wydają się zaokrąglone, skurczone i oderwane od powierzchni płytki. (B) Krytyczne punkty kontrolne wizualne po dodaniu odczynników i przed solubilizacją. W teście MTT (lewe panele dla każdej linii komórkowej) żywe komórki zawierają widoczne ciemnofioletowe kryształy formazanu. W teście NRU (prawe panele dla każdej linii komórkowej) żywe komórki wykazują akumulację czerwonego barwnika w nienaruszonych lizosomach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig8large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Tuberculosis (TB) remains one of the leading causes of death from a single infectious agent worldwide, with rising rates of drug resistance making the ...

Kierunek naszych badań to opracowanie i walidacja nowych kandydatów do leków przeciw gruźlicy, które mają na celu rozwijanie strategii terapeutycznych. Zapobiegawcza linia przesiewowa fenotypową można wykorzystać w poszukiwaniu nowych leków przeciwko szczepom mycobacterium tuberculosis. Na początek, należy zebrać wymagane odczynniki i przystąpić do przygotowania mieszaniny reakcyjnej przy użyciu przedstawionych proporcji.Mieszaninę reakcyjną mieszaj przez 16 godzin w 85 stopniach Celsjusza. Użyj oparówka rotacyjnego aby usunąć rozpuszczalnik. Dodaj około 20 mililitrów nasyconej soli sodowej bikarbonatowej do pozostałości.Przefiltruj tę zawiesinę za pomocą 11 mikrometrowego papieru filtrującego z celulozy aby zebrać pozostałe stałe. Pozostałe stałe rozpuść w 50 mililitra chloroformu. Użyj lejka oddzielającego aby spłukać roztwór chloroformu 15 mililitrów wody trzykrotnie.Każdorazowo usuwaj warstwę wodną. Dodaj bezwodny siarczan sodu do fazy organicznej aby usunąć pozostałą wodę i wysuszyć. Po odparowaniu rozpuszczalnika, przemyj wynikający zielony osad czterokrotnie 10 mililitra gorącego heksanu w około 50 stopniach Celsjusza.Do jednego miligrama Związku 6 dodaj jeden mililitr jednej do jednego mieszaniny acetonitrylu i metanolu aby przygotować roztwór stockowy. Rozcieńcz roztwór stockowy do 0,5 miligrama na mililitr i przefiltruj go przed analizą. Wprowadź próbkę do systemu HPLC.Użyj oprogramowania do pozyskiwania i przetwarzania danych chromatograficznych. Ustaw metodę chromatograficzną tak, aby używać kolumny fazy odwrotnej C18 o wymiarach 250 na 4,6 milimetrów o wielkości cząstek pięciu mikrometrów. Ustaw prędkość przepływu na 1,5 mililitra na minutę, i ustaw detekcję UV na 254 nanometrach.Ustaw gradient jak przedstawiono z zaprogramowanymi zmianami składu fazy ruchomej. Przenieś około 15 do 20 miligramów Związku 6 do rury NMR lub NMR. Rozpuść go w odpowiedniej objętości DMSOD6.Gdy parametry pozyskiwania są ustawione jak przedstawiono, pozyskaj spektrum NMR protonów używając standardowej sekwencji impulsowej. Dostosuj parametry pozyskiwania. Uruchom spektrum NMR protonów i węgla 13 i podaj przesunięcia chemiczne w ułamkach procentowych.Zwizualizuj i przetwórz dane NMR z plikiem rozpadu swobodnej indukcji uzyskanym z eksperymentu. Dla chromatograficznej czyszczenia Związku 6, napełnij kolumnę żelem krzemionkowym. Wprowadź surowy Związek 6 do kolumny.Elutuj związek i zbieraj frakcje. Monitoruj frakcje za pomocą chromatografii warstwowej i łącz frakcje zawierające czysty produkt. Dodaj 100 mikrolilitrów bulionu 7H9 uzupełnionego o 10%albuminę dekstrozę katalazę lub ADC do kolumny 12 płytki 96-dołkowej.Następnie przenieś 100 mikrolilitrów bulionu 7H9 zawierającego 10%ADC i 5%DMSO do kolumny 11. A następnie sekwencyjnie od kolumny dziewięciu do jednej. Dodaj 200 mikrolilitrów roztworu związku do kolumny 10, przypisując jedną rząd na związek.Za pomocą pipety przenieś 100 mikrolilitrów roztworu związku w dwukrotnie wyższym maksymalnym stężeniu testowym do kolumny 12 płytki 96-dołkowej. Przenieś 100 mikrolilitrów z kolumny 10 do kolumny dziewięciu i dobrze wymieszaj za pomocą pipety aby rozpocząć dwukrotne rozcieńczanie szeregowego. Kontynuuj szeregowego rozcieńczania sekwencyjnie aż do kolumny jednej.Dodaj 100 mikrolilitrów zawiesiny bakteryjnej mycobacterium tuberculosis sekwencyjnie od kolumny 11 do kolumny jednej i przykryj płytkę. Uszczelnij płytkę parafilmem i inkubuj w 37 stopniach Celsjusza przez siedem dni. Następnie dodaj 60 mikrolilitrów 0,01% roztworu resazuryny do każdego dołka płytki i przykryj.Uszczelnij płytkę parafilmem i inkubuj w 37 stopniach Celsjusza przez 48 godzin. Następnie sprawdź zmianę koloru z niebieskiego na różowy. Przygotuj roztwór roboczy 0,5 miligrama na mililitr MTT w bezsurowicowym DMEM.Uzyskaj komórki Vero i HEPG2 traktowane Związkiem 6 przez 48 godzin i zbadaj je aby ocenić efekty leczenia. Aspiruję medium z płytek i dodaj 50 mikrolilitrów roztworu roboczego MTT do każdego dołka w warunkach niskiej światłości otoczenia. Po trzech godzinach inkubacji, dodaj 100 mikrolilitrów DMSO do każdego dołka aby rozpuścić kryształki Formazanu w warunkach niskiej światłości otoczenia.Umieść płytkę na orbicie shakerze z prędkością 100 RPM przez 15 minut, zachowując ją przed światłem. Zbadaj dołki kontrolne aby potwierdzić całkowite rozpuszczenie kryształów. Umieść płytkę w czytniku płytek.Ustaw długość fali referencyjnej od 630 do 690 nanometrów i sprawdź absorpcję na 570 nanometrach. Przygotuj roztwór roboczy czerwieni neutralnej 40 mikrogramów na mililitr w bezsurowicowym DMEM. Następnie przygotuj roztwór desorpcji czerwieni neutralnej zawierający 1% kwasu lodowcowatego, 49%etanol, i 50%ultraczystej wody objętościowo.Gdy efekt Związku 6 zostanie oceniony na komórkach Vero i

identification-potential-anti-tb-candidates-step-step-guide-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Protokół do określania względnej aktywności antyapoptotycznej mAb anty-TNFα przy użyciu mechanizmu neutralizacji z komórkami WEHI 164 jest przedstawiony tutaj. Protokół ten jest przydatny do porównywania siły neutralizacji różnych cząsteczek o tej samej funkcjonalności biologicznej.

Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Ten protokół opisuje porównanie in vitro dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Metody te wykorzystano do bezpośredniego porównania referencyjnego rytuksymabu z rytuksymabem biopodobnym. Testy te mogą być stosowane podczas opracowywania leków biopodobnych lub jako kontrola jakości w ich produkcji.

In vitro Metody porównywania wiązania celu i indukcji CDC między przeciwciałami terapeutycznymi: zastosowania w analizie biopodobieństwa

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Opisujemy test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy przeprowadzony po inaktywacji termicznej plwociny. Inaktywacja termiczna sprawia, że próbki plwociny stają się niezakaźne i eliminuje potrzebę stosowania laboratoriów o poziomie 3 hermetyczności do testów molekularnych na gruźlicę.

Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Poznaj protokół syntezy i oceny nowych związków przeciwgruźliczych z wykorzystaniem Mycobacterium tuberculosis oraz linii komórkowych ssaków. Metoda integruje oznaczanie MIC i testy cytotoksyczności dla wczesnej identyfikacji kandydatów na leki.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Przewodnik krok po kroku po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Przeglądaj więcej filmów