Metoda adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy do heterotroficznego uprawy

Nasze badania koncentrują się na adaptacji nowych liści Euglena gracilis do odpadów z kasawi i badaniu wzrostu, redukcji cyjanku i produkcji biomasy bogatej w białko. Ten protokół może być stosowany w zrównoważonym przetwarzaniu kasawi, waloryzacji odpadów rolniczych, produkcji pasz i niskobudżetowych systemach biotechnologicznych. Na początek należy oznaczyć sterylne 500-mililitowe kolby z wentylowanymi nakrętkami rodzajem podłoża jako garri.

Zaznacz odpowiednią docelową koncentrację na kolbie. Oznać kolbę identyfikacją repliki i planowanym warunkiem sterylizacji jako sterylizowane w autoklawie lub niesterylizowane. Umieść łyżeczkę ciężarową na wadze analitycznej.

Po naciśnięciu tary, ważyć garri, aby dopasować ostateczną objętość roboczą. Aseptyknie dodać zważone garri do sterylnej 500-mililitrowej kolby zawierającej 300 mililitrów zdejonizowanej lub destylowanej wody. Ponownie założyć wentylowany nakrętkę na każdej kolbie.

Mieszać każdą zawiesinę przez trzy minuty, aż mieszanina będzie zhomogenizowana. Jeśli używane jest mieszanie magnetyczne, umieścić kolbę na płycie mieszającej i ustawić prędkość na 200G, aby utworzyć płytki wirnik bez rozbryzgiwania. Pozostawić zawiesinę na 10 minut w sposób niezakłócony w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Natychmiast przed fermentacją dokręcić wentylowany nakrętkę i delikatnie przekręcić kolbę pięciokrotnie, aby delikatnie zhomogenizować mieszaninę i ponownie zawiesić osadzone materiały. Aby przygotować dodatkowe podłoże z kasawi, oznaczyć kolby i zważyć podłoże, jak poprzednio pokazano, aby osiągnąć 30 gramów na litr na podstawie objętości roboczej. Aseptyknie dodać zważone podłoże do sterylnej kolby zawierającej 300 mililitrów zdejonizowanej lub destylowanej wody.

Ponownie założyć wentylowany nakrętkę na każdej kolbie. Hydratować i mieszać zawiesinę, jak poprzednio pokazano. Upewnić się, że kolby są wyposażone w sterylne wentylowane nakrętki gazoprzepuszczalne, aby umożliwić wymianę gazów, minimalizując zarażenie środowiskowe.

Umieścić kolby pionowo w temperaturze 25 stopni Celsjusza w wyznaczonym obszarze z dala od bezpośredniego światła słonecznego i intensywnego przepływu powietrza oraz inkubować kolby bez mieszania przez co najmniej 72 godziny. Zapisać datę i godzinę rozpoczęcia fermentacji dla każdej kolby i warunku. Upewnić się, że każda 500-mililitrowa kolba zawiera nie więcej niż 300 mililitrów płynu po fermentacji, aby zapobiec przelewaniu się podczas sterylizacji.

Gdy wentylowany nakrętka zostanie poluzowany do pozycji ciasno zamkniętej, nałożyć taśmę wskaźnika autoklawu na kolbę. Po załadowaniu kolb do bezpiecznego autoklawowego taczki, umieścić taczkę do autoklawu i wybrać cykl P13 dla płynu. Ustawić parametry sterylizacji na 121 stopni Celsjusza na 30 minut dla sterylizacji płynu.

Rozpocząć cykl autoklawowy. Po zakończeniu cyklu, pozwolić, aby ciśnienie w komorze autoklawu wróciło do ciśnienia atmosferycznego i powoli otworzyć drzwi autoklawu. Przy użyciu rękawic odpornych na wysoką temperaturę, usunąć kolby i pozwolić im ostygnąć do temperatury pokojowej.

Przechowywać ostygłe kolby przez noc w temperaturze pokojowej przed inokulacją. Użyć sfermentowanego podłoża z kasawi bezpośrednio bez sterylizacji w autoklawie, aby zachować rodzime społeczności mikrobiologiczne. Inokułować podłoże niesterylizowane natychmiast po 72-godzinnym okresie fermentacji, aby zminimalizować niezamierzone zarażenie środowiskowe.

Przez wszystkie warunki podłoża utrzymywać spójne postępowanie przez repliki, używając tego samego typu 500-mililitrowych kolb z wentylowanymi nakrętkami, tej samej objętości roboczej i tego samego czasu fermentacji. Inokułować Euglena gracilis do świeżego heterotroficznego podłoża odżywczego. Inkubowac kultury w całkowitej ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza z ciągłym mieszaniem orbitalnym na 120G, aż kultury osiągną średni wzrost logistyczny.

Używając mikroskopu złożonego w trybie światła przedniego, badać kultury pod powiększeniem 100x do 400x i potwierdzić aktywną ruchomość, wydłużoną morfologię komórek i niskie poziomy utrzymania. Wykluczyć kultury wykazujące nadmierne zanieczyszczenia komórkowe, nienormalną morfologię lub podwyższone utrzymanie przed eksperymentami adaptacyjnymi. Po delikatnym zhomogenizowaniu kultur początkowych przez dokręcenie wentylowanego nakrętki, przekręcić kolby ręcznie przez 15 sekund, aby zapewnić jednolite rozmieszczenie komórek bez wywoływania naprężeń szybkościowych.

Używając licznika Neubauera, wyznaczyć gęstość komórek. Gdy kultura jest mieszana przez przekręcenie kolby przez 15 sekund, pipetą przenieść jeden mililitr kultury do sterylnej 1,5-mililitrowej mikrocentryfugującej kulki. Wyczyścić licznik i szklany pokrywka 70% alkoholem i pozostawić licznik i pokrywkę do osuszenia na powietrzu.

Pipetą przenieść 10 mikrolitrów kultury na dwie siatki licznika i nałożyć pokrywkę na mokrą próbkę.