Name: Metoda adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy do heterotroficznego uprawy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj metodę adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy w celu heterotroficznej uprawy mikroalg. Protokół umożliwia wykorzystanie odpadów przetwórstwa kaszawy do produkcji białkowej biomasy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Psaltry International Company Ltd. za dostarczenie materiałów pochodzących z kasawi i za wkład w określenie zastosowanych celów badań odpowiednich do przemysłowego przetwarzania kasawi. 
Autorzy dziękują Resourced Global Inc. (Lider programu NFAL wspieranym przez Fundację Rockefellera). 
Autorzy dziękują Société Générale de Surveillance (SGS) za przeprowadzenie zewnętrznych analiz surowej zawartości białka za pomocą metody spalania (Dumas). Dodatkowe wsparcie laboratoryjne i opinie metodologiczne zostały zapewnione przez członków społeczności badawczej Trent University. 
To dzieło było wspierane w części przez inicjatywy badań stosowanych wspieranych przez partnerów.

Ten protokół wykorzystuje niepatogenne protisty i podłoża roślinne pochodzące z kasawi. Przeprowadź wszystkie procedury zgodnie z instytucjonalnymi wymaganiami bezpieczeństwa biologicznego i chemicznego dotyczącymi materiałów roślinnych zawierających cyjanoglifyozydy.
1. Przygotowanie i fermentacja podłoży na bazie kasawi
UWAGA: Materiały pochodzące z kasawi mogą zawierać cyjanoglifyozydy i mogą uwalniać cyjanowodór w pewnych warunkach. Przeprowadzaj wszystkie ważenia, hydratację, mieszanie i pobieranie próbek w wyciągu chemicznym. Noś fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i okulary ochronne. Dezynfekuj powierzchnie robocze po potraktowaniu podłożami kasawi i usuń odpady stałe i ciekłe jako odpady chemiczne według wytycznych instytucjonalnych.
<ol>
	<li>Przygotuj zawiesiny garri 
	Uwaga: Dziki typ Euglena gracilis był hodowana w warunkach ciągłego ciemna przy 28°C z mieszaniem orbitalnym przy 120 x g. Kompozycja heterotroficznego podłoża odżywczego została przygotowana jako zdefiniowana formuła składająca się z 1,5% glukozy, 0,5% wyciągu z drożdży, 0,1% KH2PO4, 0,1% MgSO4, 0,2% (NH4)2SO4, 0,01% CaCL2.2H2O plus 0,4 mL/L roztworu stockowego witamin (witamina B1: 2,50g/L; witamina B12: 12,5 mg/L; witamina B6: 0,5mg/L; witamina B7: 0,025 mg/L) i 2,0 mL/L roztworu stockowego metali śladowych (Na2EDTA.2H2O: 25,00 g/L; FeCl3.6H2O: 21,00 g/L; ZnSO4.7H2O: 11,0 g/L; MnCl2.4H2O: 4,0 g/L; CuSO4.5H2O: 0,39 g/L; H3BO3: 0,285 g/L; Na2MoO4.2H2O: 0,9 g/L).
	<ol>
		<li>Etykietuj każdą sterylną butelkę o pojemności 500 mL z wieczkowym kapslem z otworem wentylacyjnym z typem podłoża (garri), docelową koncentracją (10, 20, 30, 40 lub 50 g L-1), identyfikatorem repliki i planowanym warunkiem sterylizacji (autoklawowana lub nieautoklawowana).</li>
		<li>Umieść łódź ważeniową na wadze analitycznej i naciśnij TARE/Zero, aby ustawić wyświetlacz na 0,000 g.</li>
		<li>Waż garri tak, aby pasowało do końcowej objętości roboczej (np. dla 300 mL, waż 3,0 g dla 10 g L-1, 6,0 g dla 20 g L-1, 9,0 g dla 30 g L-1, 12,0 g dla 40 g L-1 lub 15,0 g dla 50 g L-1). 
		UWAGA: Wybrany zakres koncentracji (10–50 g L-1) został zaprojektowany, aby obejmować warunki od wzrostu bazowego do wysokiego obciążenia podłożem, umożliwiając ocenę adaptacji na rosnącej złożoności fizykochemicznej.</li>
		<li>Aseptycznie dodaj ważony garri do każdej sterylnej butelki o pojemności 500 mL zawierającej 300 mL dejonizowanej lub destylowanej wody i ponownie zamocuj wieczkowy kapsel.</li>
		<li>Mieszaj każdą zawiesinę przez 3 min, aż mieszanka będzie homogenizowana za pomocą jednego z następujących podejść. 
		UWAGA: E. gracilis jest wrażliwa na mechaniczne ścinanie; dlatego warunki mieszania zostały dobrane, aby zminimalizować stres indukowany przez mieszanie, zachowując jednocześnie odpowiedni kontakt między komórkami a podłożem.
		<ol>
			<li>Do manualnego mieszania dokręć wieczkowy kapsel i kręć butelką ręcznie w kierunku kołowym przez 3 min, aż skondensowane cząstki będą równomiernie rozproszone.</li>
			<li>Do mieszania magnetycznego aseptycznie dodaj sterylną łopatkę mieszającą do butelki, umieść butelkę na płycie mieszającej i ustaw prędkość na 200 x g, aby utworzyć płytki wirnik bez rozbryzgiwaniu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozwól zawiesinie na hydratację bez zakłóceń przez 10 min w temperaturze pokojowej (25 °C).</li>
		<li>Najpierw przed fermentacją delikatnie homogenizuj mieszaninę, ściągając wieczkowy kapsel i kręcąc butelkami ręcznie 5 razy, aby resuspendować osadzone materiały. 
		UWAGA: Garri użyte w tym badaniu było dostępnym komercyjnie produktem pochodzącym z kasawi. Na podstawie informacji o wartości odżywczej dostarczonych przez producenta składało się głównie z węglowodanów, z niewielkimi ilościami białka i nieznaczną zawartością tłuszczu. Ta kompozycja odzwierciedla typowe przetworzone podłoża kasawiowe stosowane w kontekście spożywczym i przemysłowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj dodatkowe podłoże na bazie kasawi
	<ol>
		<li>Etykietuj każdą sterylną butelkę o pojemności 500 mL z wieczkowym kapslem z otworem wentylacyjnym z typem podłoża (suszone miazga, pelety, skórki lub pasza dla zwierząt), koncentracją (30 g L-1), identyfikatorem repliki i warunkiem sterylizacji (autoklawowana lub nieautoklawowana).</li>
		<li>Umieść łódź ważeniową na

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub konfliktów interesów.

Kluczowym czynnikiem sukcesu w tym protokole jest równowaga między stężeniem substratu z kasawi a stabilnością fizjologiczną podczas heterotroficznej kultywacji E. gracilis. Materiały pochodzące z kasawi wprowadzają fizyczną heterogeniczność, pozostałe cząstki i zmienne kinetyki uwalniania składników odżywczych, które bezpośrednio wpływają na zachowanie wzrostu i stabilność kultury2,3. Wśród kroków protokołu, preparacja substratu i wybór stężenia przedstawiają najbardziej wrażliwe punkty kontrolne. Jak pokazują Przedstawione Wyniki, pośrednie stężenia substratu niezawodnie wspierają utrzymane wzrost z ograniczoną różnicą replikacji, podczas gdy niższe stężenia ograniczają akumulację biomasy, a wyższe stężenia zwiększają zmienność czasową i przejściowe reakcje na stres. Te wyniki podkreślają, że maksymalne ładowanie substratu niekoniecznie przynosi optymalne lub stabilne wyniki kultywacji, gdy pracuje się z heterogenicznymi materiałami agro-przemysłowymi. Wybrane kroki przetwarzania wstępnego i zakresy stężeń substratu zostały zaprojektowane tak, aby stopniowo wyzywać E. gracilis pod coraz większą złożonością chemiczną i mikrobiologiczną. Zaobserwowane różnice w stabilności wzrostu i żywotności w tych warunkach potwierdzają ważność tego etapowego podejścia i potwierdzają, że pośrednie stężenia substratu zapewniają równowagę między dostępnością składników odżywczych a stresem fizjologicznym.
Obsługa kultury podczas heterotroficznego wzrostu dalsze wpływa na wyniki adaptacji. Konsekwentne, ale delikatne mieszanie w całkowicie ciemnych warunkach było kluczowe dla utrzymania kontaktu między E. gracilis komórkami a zawieszonym materiałem substratu, unikając jednocześnie nadmiernego stresu ścinającego. Niewystarczające mieszanie sprzyjało sedymentacji i lokalnym gradientom składników odżywczych, co komplikowało zarówno pomiary wzrostu, jak i żywotności, szczególnie w nieautoklawowanych mediach12. Te obserwacje zgadzają się z poprzednimi raportami pokazującymi, że przestrzenna heterogeniczność i nierównomierne narażenie na substrat mogą zacierać odpowiedzi fizjologiczne w systemach kultywacji mikroorganizmów. Protokół zatem podkreśla rutynowe odwracanie zamiast ciągłego mieszania jako praktyczny kompromis między jednorodnością a integralnością kultury. 
Aby sprostać zmienności nieodłącznej substratom na bazie kasawi, protokół zawiera wiele punktów narady nad rozwiązywaniem problemów i elastyczności. Autoklawacja fermentowanego media z kasawi poprawiła krótkoterminową spójność poprzez zmniejszenie ładunku mikrobiologicznego i zmianę struktury substratu, szczególnie podczas wczesnych etapów adaptacji. W przeciwieństwie do tego, media nieautoklawowane może być skutecznie używane po udanej adaptacji, pod warunkiem, że gęstość inokulum i mieszanie były wystarczające, aby utrzymać stabilny wzrost. Ten etapowy podejście jest zgodny z wcześniejszymi badaniami pokazującymi że stopniowe selektywne ciśnienie umożliwia populacjom mikroorganizmów tolerowanie rosnącej złożoności środowiskowej z czasem13,14. Długotrwała monitoryzacja była niezbędna w tym kontekście, ponieważ przejściowe spadki wzrostu lub żywotności często odzyskiwano podczas następnych przebiegów bez kompromitacji ogólnego sukcesu adaptacji. 
Testy żywotności i monitorowanie morfologiczne służyły jako szybkie narzędzia diagnostyczne w całym procesie adaptacji. Wykluczenie Trypan Blue dostarczyło ilościowego wskaźnika fizjologicznej odporności, podczas gdy ocena oparta na mikroskopii ruchliwości i encystacji oferowała wczesne ostrzeżenie o nieoptymalnych warunkach, takich jak nadmierne ładowanie substratu lub opóźniona aklimatyzacja15. Co ważne, protokół podkreśla trendy na przestrzeni czasu, a nie pojedyncze pomiary, ponieważ krótkotrwałe wahania żywotności lub morfologii nie zawsze przewidywały długoterminowej niepowodzenie kultury. To długotrwałe perspektywa okazała się kluczowa dla rozróżnienia przejściowych reakcji na stres od trwałego fizjologicznego spadku. Spadek wykrywalnych poziomów cyjanku obserwowanych podczas kultywacji sugeruje częściową detoksykację substratów pochodzących z kasawi w opisywanych warunkach. Te spadki mogą wynikać z kombinacji degradacji związanej z fermentacją, wolatylizacji i aktywności mikrobiologicznej. Chociaż specyficzne mechanizmy biochemiczne i kinetyki usuwania cyjanku nie były bezpośrednio badane w tym badaniu, te obserwacje wspierają włączenie monitorowania cyjanku jako praktycznego wskaźnika transformacji substratu i wykonalności kultury podczas adaptacji.
Kilka ogranicz

Mańdziołka (Manihot esculenta) jest główną rośliną żywnościową i przemysłową w zachodniej Afryce, wytwarzającą przetworzone produkty uboczne, takie jak garri, suszona masa, skórki i pelety1.
Podłoża pochodzące z mańdziołki składają się głównie z fermentowalnych węglowodanów i resztkowych składników odżywczych, a także niewielkiego stężenia białka i błonnika, choć skład może się różnić w zależności od warunków przetwarzania i surowca źródłowego2,3. Pozostają one niedostatecznie wykorzystywane ze względu na ich niejednorodny skład, obecność cyjanogennych glikozydów oraz zróżnicowane społeczności mikrobiologiczne, które powstają podczas tradycyjnego przetwarzania i fermentacji4. Te cechy stanowią wyzwania dla bezpośredniego uprawiania mikroorganizmów i ograniczają integrację produktów ubocznych z mańdziołki z standaryzowanymi procesami bioprocesowymi. Mimo obfitości produktów ubocznych pochodzących z mańdziołki, obecnie brakuje metod powtarzalnych i przyjaznych dla środowiska do uprawiania systemów mikrobiologicznych na tych chemicznie złożonych i aktywnych mikrobiologicznie podłożach. System uprawy zdolny do wzbogacania lub odtruwania tak popularnego źródła pożywienia, działającego niezawodnie w takich warunkach, wsparłby bardziej zrównoważone procesy przetwarzania mańdziołki i cyrkularne wykorzystanie zasobów.
Euglena gracilis to jednokomórkowy biczykowiec z grupy Euglenozoa5, znany ze swojej elastycznej ściany komórkowej, dynamicznej morfologii i możliwości otoczenia się osłoną w odpowiedzi na znaczne wahania dostępności składników odżywczych, ciśnienia osmotycznego i składu chemicznego6. Jego metaboliczna adaptacyjność pozwala mu również na syntezę paramylonu, polisacharydu magazynującego6, oraz regulację pH komórkowego poprzez metabolizm kwasów organicznych. Te cechy metaboliczne, szczególnie akumulacja paramylonu, mogą zwiększać magazynowanie energii i tolerancję na stres, wspierając przetrwanie i adaptację w zmiennych warunkach żywieniowych i chemicznych charakterystycznych dla podłoży pochodzących z mańdziołki. Te cechy pozwalają E. gracilis przetrwać w chemicznie różnorodnych warunkach słodkowodnych, co sprawia, że jest on obiecującym kandydatem do uprawy na niejednorodnych, nierafinowanych podłożach7.
Gdy są narażone na chemicznie złożone lub mikrobiologicznie aktywne podłoża, nieprzystosowane kultury E. gracilis często wykazują reakcje stresowe, takie jak zwiększona otoczka osłonowa i zmniejszona ruchliwość, podczas gdy przystosowane populacje mogą utrzymywać bardziej stabilną morfologię i aktywność metaboliczną8. Interakcje z powiązanymi społecznościami mikrobiologicznymi mogą dodatkowo wpływać na działanie fizjologiczne podczas długotrwałego narażenia na złożone podłoża. Te cechy podkreślają znaczenie podejść opartych na adaptacji podczas uprawiania E. gracilis na materiałach pochodzących z mańdziołki9.
Aby sprostać tym wyzwaniom, ta metoda stosuje etapową strategię adaptacji zaprojektowaną do stopniowego przyzwyczajania E. gracilis do podłoży pochodzących z mańdziołki. Podejście to obejmuje kontrolowane narażenie na rosnące złożoność podłoża i aktywność mikrobiologiczną, co pozwala na wybór populacji zdolnych do utrzymania żywotności i wzrostu w zróżnicowanych warunkach uprawy. To zaprojektowanie pozwala E. gracilis na interakcję i potencjalne czerpanie korzyści z powiązanej mikroflory oraz adaptację do rosnących stężeń w podłożu.
Po adaptacji, protokół prowadzi porównawczą ocenę przystosowanych i nieprzystosowanych linii E. gracilis na różnych produktach pochodzących z mańdziołki. Ta porównawcza ramka umożliwia ocenę spójności wzrostu, stabilności morfologicznej i reakcji fizjologicznych w warunkach podłoży odpowiednich dla terenu, gdyż proces adaptacji stopniowo przygotowuje E. gracilis do radzenia sobie ze zmiennością składników odżywczych, czynnikami stresującymi chemicznymi i aktywnością mikrobiologiczną charakterystycznymi dla produktów ubocznych z mańdziołki.
Metoda ta obejmuje standaryzowane monitorowanie pH i poziomów cyjanku10 podczas uprawy, a także przygotowanie zebranej biomasy do dalszej analizy białka poprzez kwantyfikację całkowitego azotu11, co umożliwia porównanie potencjału żywieniowego różnych podłoży i szczepów. Razem, te pomiary wspierają ocenę stabilności metabolicznej, interakcji podłoża oraz cech biomasy podczas uprawy na bazie mańdziołki i adaptacji, aby wykazać, że przystosowana linia E. gracilis może rosnąć mocno i spójnie na wielu produktach ubocznych z mańdziołki.
Ta metoda jest najbardziej odpowiednia do laboratoriów lub zastosowań badań stosowanych z dostępem do podstawowej infrastruktury mikrobiologicznej i lokalnie do

<table><tbody><tr><td>Autoclave - 533LS Steam Sterilizer</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>Sterylizacja parowa mediów z kasawią. Sterylizuj medium za pomocą cyklu płynnego.</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; Hemacytometer replacement cover slip</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>Specjalistyczne grube pokrywy przeznaczone do użytku w hemocytometrze.</td></tr><tr><td>Cassava dried pulp</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Dostarczony podłoże z kasawią</td></tr><tr><td>Cassava pellets</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Dostarczony podłoże z kasawią</td></tr><tr><td>Cassava peels</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Dostarczony podłoże z kasawią</td></tr><tr><td>Cassava substrate (garri)</td><td>Local supplier</td><td>N/A</td><td>Pochodzące z kasawi garri podłoże używane jako źródło węgla przygotowane z odjonizowanej wody.</td></tr><tr><td>Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuge</td><td>75004241</td><td>Zdolny do &ge;3 500 &times; g, używany do zbioru biomasy.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes E.g. Axygen (A Corning Brand)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>Sterylne, minimalna objętość 1,5 mL</td></tr><tr><td>Clean water E.g. UltraPure&trade; DNase/RNase- Free Distilled Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>Odjonizowana lub destylowana. Używana do przygotowania mediów</td></tr><tr><td>Compound light microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Standardowy mikroskop złożony odpowiedni do rutynowej obserwacji i liczenia komórek.</td></tr><tr><td>Cyanide Test Strips, colorimetric. CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>Półilościowa detekcja cyjanowodoru. Usuwaj jako odpady niebezpieczne</td></tr><tr><td>Sterile Standard Weighing Boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>Używany do ważenia podłoży z kasawią i suchej biomasy.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (adapted lineage)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dostosowany do kasawi szczep Euglena wygenerowany w niniejszym badaniu</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (Wild-type)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Niedostosowany szczep odniesienia. Utrzymuj te same warunki standardowe.</td></tr><tr><td>Euglena growth medium components</td><td>Various</td><td>N/A</td><td>Podstawowe medium Euglena przygotowane zgodnie ze standardowymi recepturami laboratoryjnymi.</td></tr><tr><td>FreeZone 6 Liter Console Freeze Dryer</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>Używany do odwadniania biomasy</td></tr><tr><td>Hemocytometer with Standard Lines</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>Używany do ręcznego liczenia komórek.</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer with hot plate</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>Opcjonalnie; poprawia spójność podczas przygotowania mediów i zawiesiny podłoża.</td></tr><tr><td>Micropipettes (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pipety o regulowanej objętości używane do aseptycznych przelewów płynów.</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Opcjonalnie; ułatwia szybkie osiadanie podczas zbioru biomasy.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Używany do tymczasowego uszczelniania kolb lub płytek, gdy niedostępne są nakrętki wentylacyjne.</td></tr><tr><td>pH indicator strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Alternatywna metoda pomiaru pH do szybkiej jakościowej oceny mediów kulturalnych.</td></tr><tr><td>pH meter with probe Thermo Scientific Orion Star A211 Benchtop pH Meter</td><td>Thermo Scientific Orion Star A211 Benchtop pH Meter</td><td>13-645-519</td><td>Kalibrowany przed użyciem. Do pomiaru pH nadstanu kultury</td></tr><tr><td>Refrigerated storage (4&deg;C)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>Krótkotrwała przechowywanie mediów</td></tr><tr><td>Shaking incubator (dark)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>Orbitalny inkubator z mieszaniem o mocy 100–150 RPM, zakres temperatur 24–28 &deg;C; używany w warunkach ciemności do wspierania heterotroficznego wzrostu Euglena.</td></tr><tr><td>Spray bottle (32oz)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>Używany do sterylizacji na blacie i rutynowej aseptycznej obsługi (70% roztwór etanolu)</td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>Zbieranie, organizacja i analiza danych</td></tr><tr><td>Sterile pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Sterylne, jednorazowe końcówki kompatybilne z pipetami P20, P200 i P1000.</td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>Indywidualnie zapakowane sterylne pipety używane do transferu kultur i pobierania próbek.</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Barwnik vitalny używany do oceny żywotności komórek za pomocą testu wykluczającego Trypan Blue.</td></tr><tr><td>Tubes for sample collection (50 mL)</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Do pobierania próbek pH i cyjanku</td></tr><tr><td>Vent-cap Erlenmeyer flasks (250&ndash;500 mL)</td><td>Corning

metoda adaptacji euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy do heterotroficznego uprawy

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

Przetwórstwo kasawi generuje uboczne produkty bogate w składniki odżywcze, które pozostają niedoceniane ze względu na zmienny skład chemiczny, związki cyjanogenne i aktywne społeczności mikrobiologiczne. Ten protokół przedstawia wieloetapowy plan adaptacji do ustanowienia kasawiotolerancyjnej linii Euglena gracilis nadającej się do heterotroficznej kultywacji na podłożach pochodzących z kasawi. Metoda rozpoczyna się od jednoczesnego narażenia kultur Euglena na autoklawowany i nieautoklawowany medium kasawiowe oraz na gradient stężenia garri od 10 do 30 g/L, aby ocenić tolerancję na złożoność mikrobiologiczną i obciążenie podłoża. Następnie kultury są poddawane wyższemu gradientowi stężenia od 30 do 50 g/L, aby ocenić wydajność przy użyciu gęstszych podłoży. Wynikowa linia jest porównywana z nieprzystosowanym szczepem typu dzikiego wśród pięciu produktów kasawowych; garri, suszona masa, pelety, skórki i pasza dla zwierząt, aby ocenić spójność wzrostu w materiałach odpowiednich dla pola. Protokół obejmuje pomiar zmian pH, poziomów cyjanku za pomocą kolorymetrycznych pasków oraz przygotowanie wysuszonej biomasy do analizy białka na podstawie całkowitej ilości azotu. Wszystkie te procedury zapewniają reprodukowalny rama dla adaptacji Euglena gracilis do podłoży pochodzących z kasawi oraz dla oceny wydajności szczepów w różnorodnych produktach kasawi. Ta metoda umożliwia rozwój wytrzymałych linii alg do zastosowania w przetwarzaniu bioprocesowym i aplikacjach wartościowania odpadów skupionych na kasawie.

Poniższe wyniki reprezentatywne ilustrują oczekiwane rezultaty, gdy opisany protokół jest stosowany pomyślnie, a także zakres wyników obserwowanych w warunkach suboptymalnych. Reprezentatywne dane odpowiadające tym wynikom są przedstawione na Rysunku 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7. Wszystkie te wyniki dostarczają praktycznych wskazówek dotyczących interpretacji dynamiki wzrostu, żywotności, morfologii i wyników białkowych podczas adaptacji E. gracilis do substratów na bazie kassawi pod warunkami heterotroficznego, całkowicie ciemnego uprawiania. Ponadto te wyniki potwierdzają kluczowe biologiczne wyniki protokołu, w tym pomyślną adaptację, utrzymany wzrost, wysoką żywotność, stabilną morfologię, spójną wydajność na różnych substratach i wykrywalną produkcję białek.
Przez cały czas trwania eksperymentów wykorzystano trzy replikaty na każde z traktowań (wszystkie typy mediów z kassawą). Przyjmujemy, że liczba replikat zależy od uznania i ograniczeń logistycznych każdej grupy stosująej się do powyższych protokołów. Pomyślne zastosowanie tego protokołu powoduje utrzymany heterotroficzny wzrost E. gracilis w mediach opartych na garri w warunkach całkowicie ciemnych. Pozytywne wyniki charakteryzują się gładkimi, sygmaloidalnymi trajektoriami wzrostu, ograniczonym rozbieżnością między replikatami i stabilnymi gęstościami komórek w późnej fazie. Cecha morfologiczna, która oznaczała pozytywne wyniki i była konsekwentnie obserwowana w zaadaptowanych populacjach, to zaokrąglenie komórek i grube błony komórkowe. Natomiast niezdrowe zapadające się komórki zazwyczaj wyglądają nieregularnie, fragmentalnie lub są strukturalnie osłabione i są związane z obniżoną żywotnością, co odróżnia je od całych zaokrąglonych lub półotoczkowanych form obserwowanych w zaadaptowanych hodowlach. Dla odniesienia, reprezentatywne obrazy dzikiego typu E. gracilis wykazującego charakterystyczną wydłużoną morfologię są dołączone (Rysunek 8), aby odróżnić podstawową strukturę komórkową od zaadaptowanych lub zmienionych form. Kultury wyhodowane w 30 g L-1 garri wykazywały wyższy zintegrowany wzrost, mierzony jako pole pod krzywą wzrostu (AUC), w porównaniu z niższymi stężeniami, co sugeruje bardziej wydajne wykorzystanie substratu z kassawi i pomyślną adaptację fizjologiczną (Rysunek 1).
Suboptymalne wyniki są często obserwowane przy niższych stężeniach garri (10–20 g L-1), gdzie wzrost jest wykrywalny, ale zmniejszony w wielkości i bardziej zmienny między replikatami. Przy wyższych stężeniach (40–50 g L-1) kultury mogą osiągać podwyższone maksymalne gęstości komórek; jednak te warunki często wykazują opóźnioną stabilizację lub zwiększoną zmienność czasową (Rysunek 2).
W pomyślnych eksperymentach żywotność komórek pozostaje wysoka przez cały okres hodowli, z niewielkimi wahaniami w połowie eksperymentu. Testy wykluczania Trypan Blue wskazują, że kultury utrzymane w 30 g L-1 garri zachowują wysoką proporcję żywych (niezbarwionych) komórek względem nieżywych (zbarwionych na niebiesko) komórek w pobranej próbce w różnych punktach czasowych (Rysunek 3). Odchylenia od tego wzorca, w tym zwiększona proporcja zbarwionych komórek, zmniejszona ruchliwość lub przesunięcia w kierunku zaokrąglonych lub zapadających się morfologii, mogą wskazywać na warunki suboptymalne i służyć jako wczesne sygnały do rozwiązywania problemów. Oceny żywotności i morfologii opierały się na spójnych kryteriach obserwacyjnych, w tym na integralności komórek, ruchliwości kierunkowej i względnej częstości występowania form wydłużonych w porównaniu z zaokrąglonymi lub zapadającymi się formami.
Suboptymalne wyniki charakteryzują się przejściowymi spadkami żywotności, najczęściej obserwowanymi przy wyższych stężeniach garri. Możliwe jest częściowe odzyskanie w późniejszych punktach czasowych; jednak te warunki wykazują zwiększoną zmienność żywotności w okresie hodowli (Rysunek 4). Te wzorce wzrostu pokazują, że średnie stężenia substratu (np. 30 g L-1) zapewniają równowagę między dostępnością składników odżywczych a stresem, co prowadzi do bardziej stabilnego wzrostu. Te trendy odzwierciedlają wpływ warunków przetwarzania i stopniowej adaptacji na wydajność hodowli, ponieważ stopniowe narażenie na rosnącą złożoność substratu wspiera lepszą stabilność fizjologiczną i powtarzalne zachowanie wzrostu. Niższe stężenia ograniczają produkcję biomasy, podczas gdy wyższe stężenia prowadzą do większej zmienności i opóźnionej stabilizacji.
Oceny morfologicz

Ten protokół opisuje metodę krok po kroku adaptacji Euglena gracilis do substratów na bazie kasawi i następującą ocenę wzrostu, żywotności i produkcji biomasy w wielu produktach z kasawi w warunkach upraw heterotroficznych.

Metoda adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy do heterotroficznego uprawy

Cassava processing generates nutrient-rich by-products that remain underutilized due to variable composition, cyanogenic compounds, and active microbial ...

Nasze badania koncentrują się na adaptacji nowych liści Euglena gracilis do odpadów z kasawi i badaniu wzrostu, redukcji cyjanku i produkcji biomasy bogatej w białko. Ten protokół może być stosowany w zrównoważonym przetwarzaniu kasawi, waloryzacji odpadów rolniczych, produkcji pasz i niskobudżetowych systemach biotechnologicznych. Na początek należy oznaczyć sterylne 500-mililitowe kolby z wentylowanymi nakrętkami rodzajem podłoża jako garri.Zaznacz odpowiednią docelową koncentrację na kolbie. Oznać kolbę identyfikacją repliki i planowanym warunkiem sterylizacji jako sterylizowane w autoklawie lub niesterylizowane. Umieść łyżeczkę ciężarową na wadze analitycznej.Po naciśnięciu tary, ważyć garri, aby dopasować ostateczną objętość roboczą. Aseptyknie dodać zważone garri do sterylnej 500-mililitrowej kolby zawierającej 300 mililitrów zdejonizowanej lub destylowanej wody. Ponownie założyć wentylowany nakrętkę na każdej kolbie.Mieszać każdą zawiesinę przez trzy minuty, aż mieszanina będzie zhomogenizowana. Jeśli używane jest mieszanie magnetyczne, umieścić kolbę na płycie mieszającej i ustawić prędkość na 200G, aby utworzyć płytki wirnik bez rozbryzgiwania. Pozostawić zawiesinę na 10 minut w sposób niezakłócony w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Natychmiast przed fermentacją dokręcić wentylowany nakrętkę i delikatnie przekręcić kolbę pięciokrotnie, aby delikatnie zhomogenizować mieszaninę i ponownie zawiesić osadzone materiały. Aby przygotować dodatkowe podłoże z kasawi, oznaczyć kolby i zważyć podłoże, jak poprzednio pokazano, aby osiągnąć 30 gramów na litr na podstawie objętości roboczej. Aseptyknie dodać zważone podłoże do sterylnej kolby zawierającej 300 mililitrów zdejonizowanej lub destylowanej wody.Ponownie założyć wentylowany nakrętkę na każdej kolbie. Hydratować i mieszać zawiesinę, jak poprzednio pokazano. Upewnić się, że kolby są wyposażone w sterylne wentylowane nakrętki gazoprzepuszczalne, aby umożliwić wymianę gazów, minimalizując zarażenie środowiskowe.Umieścić kolby pionowo w temperaturze 25 stopni Celsjusza w wyznaczonym obszarze z dala od bezpośredniego światła słonecznego i intensywnego przepływu powietrza oraz inkubować kolby bez mieszania przez co najmniej 72 godziny. Zapisać datę i godzinę rozpoczęcia fermentacji dla każdej kolby i warunku. Upewnić się, że każda 500-mililitrowa kolba zawiera nie więcej niż 300 mililitrów płynu po fermentacji, aby zapobiec przelewaniu się podczas sterylizacji.Gdy wentylowany nakrętka zostanie poluzowany do pozycji ciasno zamkniętej, nałożyć taśmę wskaźnika autoklawu na kolbę. Po załadowaniu kolb do bezpiecznego autoklawowego taczki, umieścić taczkę do autoklawu i wybrać cykl P13 dla płynu. Ustawić parametry sterylizacji na 121 stopni Celsjusza na 30 minut dla sterylizacji płynu.Rozpocząć cykl autoklawowy. Po zakończeniu cyklu, pozwolić, aby ciśnienie w komorze autoklawu wróciło do ciśnienia atmosferycznego i powoli otworzyć drzwi autoklawu. Przy użyciu rękawic odpornych na wysoką temperaturę, usunąć kolby i pozwolić im ostygnąć do temperatury pokojowej.Przechowywać ostygłe kolby przez noc w temperaturze pokojowej przed inokulacją. Użyć sfermentowanego podłoża z kasawi bezpośrednio bez sterylizacji w autoklawie, aby zachować rodzime społeczności mikrobiologiczne. Inokułować podłoże niesterylizowane natychmiast po 72-godzinnym okresie fermentacji, aby zminimalizować niezamierzone zarażenie środowiskowe.Przez wszystkie warunki podłoża utrzymywać spójne postępowanie przez repliki, używając tego samego typu 500-mililitrowych kolb z wentylowanymi nakrętkami, tej samej objętości roboczej i tego samego czasu fermentacji. Inokułować Euglena gracilis do świeżego heterotroficznego podłoża odżywczego. Inkubowac kultury w całkowitej ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza z ciągłym mieszaniem orbitalnym na 120G, aż kultury osiągną średni wzrost logistyczny.Używając mikroskopu złożonego w trybie światła przedniego, badać kultury pod powiększeniem 100x do 400x i potwierdzić aktywną ruchomość, wydłużoną morfologię komórek i niskie poziomy utrzymania. Wykluczyć kultury wykazujące nadmierne zanieczyszczenia komórkowe, nienormalną morfologię lub podwyższone utrzymanie przed eksperymentami adaptacyjnymi. Po delikatnym zhomogenizowaniu kultur początkowych przez dokręcenie wentylowanego nakrętki, przekręcić kolby ręcznie przez 15 sekund, aby zapewnić jednolite rozmieszczenie komórek bez wywoływania naprężeń szybkościowych.Używając licznika Neubauera, wyznaczyć gęstość komórek. Gdy kultura jest mieszana przez przekręcenie kolby przez 15 sekund, pipetą przenieść jeden mililitr kultury do sterylnej 1,5-mililitrowej mikrocentryfugującej kulki. Wyczyścić licznik i szklany pokrywka 70% alkoholem i pozostawić licznik i pokrywkę do osuszenia na powietrzu.Pipetą przenieść 10 mikrolitrów kultury na dwie siatki licznika i nałożyć pokrywkę na mokrą próbkę.

a-method-for-adapting-euglena-gracilis-to-cassava-based-substrates

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film przedstawia metodę izolacji i sterylnego hodowania embrionalnych komórek C. elegans  in vitro.

Trawienie enzymatyczne i dysocjacja ręczna: metoda przygotowania zarodków C. elegans do hodowli komórkowej

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Tutaj prezentujemy pierwszy protokół miejscowej infiltracji próżniowej do badań in vivo genetycznej transformacji dużych roślin. Korzystając z tej metodologii, po raz pierwszy uzyskaliśmy przejściową transformację kakao za pośrednictwem Agrobacterium.

Agroinfiltracja wymuszona próżnią w celu transformacji in planta roślin opornych: kakao jako studium przypadku

Stale dokonuje się znaczących przełomów w identyfikacji komórek macierzystych. Aby jednak przełożyć te odkrycia na praktykę, konieczne jest opracowanie nowych metod dostarczania komórek. W niniejszej pracy wykazuję, że drogi oddechowe stanowią bezpieczną drogę transplantacji komórek macierzystych do płuc.

Tracheotomia: Metoda transplantacji komórek macierzystych do płuc

Poznaj metodę adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy w celu heterotroficznej uprawy mikroalg. Protokół umożliwia wykorzystanie odpadów przetwórstwa kaszawy do produkcji białkowej biomasy.

Metoda adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy do heterotroficznego uprawy

Przeglądaj więcej filmów