Name: Ukierunkowana ekspresja GFP w mieszku włosowym za pomocą transdukcji wirusa ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj metodę transdukcji wirusa ex vivo w mieszku włosowym z użyciem GFP do terapii genowej. Technika ta umożliwia badanie aktywności promotorów genów w cyklu wzrostu mieszków włosowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Aby uzyskać więcej informacji na temat ukierunkowanej ekspresji GFP w mieszku włosowym przy użyciu transdukcji wirusowej ex vivo, prosimy odwiedzić stronę <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/708">Targeted expression of GFP in the hair follicle using ex vivo viral transduction</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The correct abstract is:
There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed. 
This replaced:
The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/708">Targeted expression of GFP in the hair follicle using ex vivo viral transduction</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

ukierunkowana ekspresja gfp w mieszku włosowym przy użyciu transdukcji wirusowej ex vivo

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

W mieszku włosowym występuje wiele typów komórek, w tym komórki macierzy włosa, które tworzą trzon włosa, oraz komórki macierzyste, które mogą zainicjować tworzenie trzonu włosa we wczesnej fazie anagenu (fazie wzrostu cyklu włosa), a także pluripotencjalne komórki macierzyste, które odgrywają rolę we wzroście mieszka włosowego, lecz mają potencjał do różnicowania się w komórki pozamieszowe, takie jak neurony. W tekście omówiono te właściwości mieszka włosowego. Różne typy komórek mieszka włosowego stanowią potencjalne cele terapii genowej. Omówiono również systemy dostarczania genów do mieszka włosowego z wykorzystaniem wektorów wirusowych lub liposomów w celu celowania w poszczególne typy komórek mieszka włosowego oraz uzyskane w ten sposób wyniki.

Mieszek włosowy to niezwykle złożony wyrostek skóry, zawierający wiele typów komórek. Mieszek przechodzi stałe cykle w trakcie życia organizmu, obejmujące wzrost i resorpcję, przy czym wzrost zależy od specyficznych komórek macierzystych. Omówiono celowanie w mieszek za pomocą genów i komórek macierzystych w celu zmiany jego właściwości, w szczególności charakteru łodygi włosa. Opisano systemy dostarczania do mieszków włosowych, takie jak liposomy i wektory wirusowe stosowane w terapii genowej. Przedstawiono naturę komórek macierzystych mieszka włosowego, ze szczególnym uwzględnieniem ich pluripotencji.

ukierunkowana ekspresja GFP w mieszku włosowym przy użyciu transdukcji wirusowej ex vivo

W mieszku włosa występuje wiele typów komórek, w tym komórki macierzy włosa, które tworzą trzon włosa, oraz komórki macierzyste, które mogą inicjować jego wzrost...

Mieszek włosa to złożony wyrostek skóry składający się z sześciu koncentrycznych cylindrów z kilkoma odrębnymi typami komórek, które produkują wysoce wyspecjalizowane białka. Ciągłe przechodzenie mieszka włosa przez poszczególne stadia wzrostu sprawia, że wyrostek ten nadaje się do celowanej terapii genowej, która potencjalnie może korygować łysienie oraz utratę pigmentacji włosa. W tym filmie prezentujemy metodę histokultury włosa i skóry oraz transdukcję mieszków włosowych ex vivo białkiem GFP.Ta wydajna technika transdukcji jest przydatna do śledzenia aktywności promotorów różnych genów zainteresowania w różnych obszarach pęcherzyka w trakcie całego cyklu jego wzrostu. Nazywam się Robert Hoffman. Jestem prezesem Anti-Cancer Inc.Dzisiaj zaprezentujemy Państwu bardzo skuteczne procedury w zakresie terapii genowej mieszków włosowych. Protokół ten rozpoczyna się od histokultury skóry, po której następuje traktowanie kolagenazą. Najpierw uśmierca się myszy sześć dni po depilacji, a skórę grzbietową usuwa się na poziomie tkanki podskórnej.Po usunięciu skóry usuwa się tkankę podskórną. Następnie skórę płucze się w PBS pozbawionym wapnia i magnezu. Po płukaniu w PBS wypreparowana skóra jest przenoszona do pożywki.Próbki skóry przecina się na małe fragmenty o wielkości około jednego milimetra sześciennego. Część preparatów zostaje odłożona i hodowana w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej jako kontrola nietraktowana. Pozostałe preparaty inkubuje się w stężeniu dwóch mg/mL.Roztwór kolagenazy. Po inkubacji w medium RPMI przez 45 minut do 3,75 godziny w temperaturze 37°C, trawione preparaty są płukane w PBS wolnym od wapnia i magnezu; hodowle histologiczne mogą zostać zainfekowane wirusem w celu transdukcji GFP. Dzięki zastosowaniu kolagenazy mieszkowate włosy stały się bardziej dostępne dla wirusa w celu indukcji mieszków włosowych.Aby uzyskać ekspresję GFP, najpierw przeprowadza się infekcję wirusem adenowirusa. Następnie do skóry poddanej działaniu kolagenazy dodaje się plazmid niosący GFP. Hodowle histologiczne w stężeniu od 2,4 miliona do 5 miliardów jednostek platformujących na ml.Po dodaniu wirusa, hodowle histologiczne skóry poddane transdukcji wirusowej GFP umieszcza się w inkubatorze na okres od jednej do sześciu godzin. Około 24 godziny po zbiorze preparaty można przeszczepić myszom nago lub szczepu C 57 black six. Ekspresję GFP można następnie ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przeprowadzonej bezpośrednio na hodowlach histologicznych lub poprzez wizualizację in vivo na przeszczepionej skórze. W celu określenia wydajności transdukcji GFP, pod mikroskopem w świetle przechodzącym oraz w świetle fluorescencyjnym wyznacza się całkowitą liczbę mieszków włosowych oraz liczbę mieszków włosowych wykazujących ekspresję GFP.Analizie poddaje się pięć losowo wybranych pól widzenia mikroskopu, obejmujących obszar 0,581 mm². W celu oceny ekspresji GFP przeliczono co najmniej 500 włosów na osobnik, aby wyznaczyć procent GFP-dodatnich mieszków włosowych. Mieszkowe włosowe, w których GFP jest widoczne w dowolnym miejscu cebulki lub łodygi włosa, oceniono jako GFP-dodatnie.Przedstawiliśmy właśnie wysoce wydajną metodę transdukcji GFP do mieszków włosowych, która będzie niezwykle użyteczna w terapii genowej. Wiedza ta ma duże znaczenie kliniczne, ponieważ niesie ze sobą możliwości leczenia łysienia, zapobiegania łysieniu wywołanemu chemioterapią oraz trwałej modyfikacji koloru włosów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

targeted-expression-gfp-hair-follicle-using-ex-vivo-viral

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczne wyrażanie GFP w mieszku włosowym z wykorzystaniem ek-vivo wirusowej transdukcji

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Tutaj prezentujemy metodę dostarczania wektorów ekspresji wirusa do mózgu za pomocą jedwabnych folii fibroinowych. Ta metoda pozwala na ukierunkowane dostarczanie wektorów ekspresyjnych za pomocą światłowodów pokrytych jedwabiem/AAV, światłowodów stożkowych i okien czaszkowych.

In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV

Poznaj metodę transdukcji wirusa ex vivo w mieszku włosowym z użyciem GFP do terapii genowej. Technika ta umożliwia badanie aktywności promotorów genów w cyklu wzrostu mieszków włosowych.

ukierunkowana ekspresja GFP w mieszku włosowym przy użyciu transdukcji wirusowej ex vivo

Przeglądaj więcej filmów