ukierunkowana ekspresja GFP w mieszku włosowym przy użyciu transdukcji wirusowej ex vivo
17 marca 2008
Mieszek włosowy to niezwykle złożony wyrostek skóry, zawierający wiele typów komórek. Mieszek przechodzi stałe cykle w trakcie życia organizmu, obejmujące wzrost i resorpcję, przy czym wzrost zależy od specyficznych komórek macierzystych. Omówiono celowanie w mieszek za pomocą genów i komórek macierzystych w celu zmiany jego właściwości, w szczególności charakteru łodygi włosa. Opisano systemy dostarczania do mieszków włosowych, takie jak liposomy i wektory wirusowe stosowane w terapii genowej. Przedstawiono naturę komórek macierzystych mieszka włosowego, ze szczególnym uwzględnieniem ich pluripotencji.
Mieszek włosa to złożony wyrostek skóry składający się z sześciu koncentrycznych cylindrów z kilkoma odrębnymi typami komórek, które produkują wysoce wyspecjalizowane białka. Ciągłe przechodzenie mieszka włosa przez poszczególne stadia wzrostu sprawia, że wyrostek ten nadaje się do celowanej terapii genowej, która potencjalnie może korygować łysienie oraz utratę pigmentacji włosa. W tym filmie prezentujemy metodę histokultury włosa i skóry oraz transdukcję mieszków włosowych ex vivo białkiem GFP.
Ta wydajna technika transdukcji jest przydatna do śledzenia aktywności promotorów różnych genów zainteresowania w różnych obszarach pęcherzyka w trakcie całego cyklu jego wzrostu. Nazywam się Robert Hoffman. Jestem prezesem Anti-Cancer Inc.
Dzisiaj zaprezentujemy Państwu bardzo skuteczne procedury w zakresie terapii genowej mieszków włosowych. Protokół ten rozpoczyna się od histokultury skóry, po której następuje traktowanie kolagenazą. Najpierw uśmierca się myszy sześć dni po depilacji, a skórę grzbietową usuwa się na poziomie tkanki podskórnej.
Po usunięciu skóry usuwa się tkankę podskórną. Następnie skórę płucze się w PBS pozbawionym wapnia i magnezu. Po płukaniu w PBS wypreparowana skóra jest przenoszona do pożywki.
Próbki skóry przecina się na małe fragmenty o wielkości około jednego milimetra sześciennego. Część preparatów zostaje odłożona i hodowana w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej jako kontrola nietraktowana. Pozostałe preparaty inkubuje się w stężeniu dwóch mg/mL.
Roztwór kolagenazy. Po inkubacji w medium RPMI przez 45 minut do 3,75 godziny w temperaturze 37°C, trawione preparaty są płukane w PBS wolnym od wapnia i magnezu; hodowle histologiczne mogą zostać zainfekowane wirusem w celu transdukcji GFP. Dzięki zastosowaniu kolagenazy mieszkowate włosy stały się bardziej dostępne dla wirusa w celu indukcji mieszków włosowych.
Aby uzyskać ekspresję GFP, najpierw przeprowadza się infekcję wirusem adenowirusa. Następnie do skóry poddanej działaniu kolagenazy dodaje się plazmid niosący GFP. Hodowle histologiczne w stężeniu od 2,4 miliona do 5 miliardów jednostek platformujących na ml.
Po dodaniu wirusa, hodowle histologiczne skóry poddane transdukcji wirusowej GFP umieszcza się w inkubatorze na okres od jednej do sześciu godzin. Około 24 godziny po zbiorze preparaty można przeszczepić myszom nago lub szczepu C 57 black six. Ekspresję GFP można następnie ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przeprowadzonej bezpośrednio na hodowlach histologicznych lub poprzez wizualizację in vivo na przeszczepionej skórze. W celu określenia wydajności transdukcji GFP, pod mikroskopem w świetle przechodzącym oraz w świetle fluorescencyjnym wyznacza się całkowitą liczbę mieszków włosowych oraz liczbę mieszków włosowych wykazujących ekspresję GFP.
Analizie poddaje się pięć losowo wybranych pól widzenia mikroskopu, obejmujących obszar 0,581 mm². W celu oceny ekspresji GFP przeliczono co najmniej 500 włosów na osobnik, aby wyznaczyć procent GFP-dodatnich mieszków włosowych. Mieszkowe włosowe, w których GFP jest widoczne w dowolnym miejscu cebulki lub łodygi włosa, oceniono jako GFP-dodatnie.
Przedstawiliśmy właśnie wysoce wydajną metodę transdukcji GFP do mieszków włosowych, która będzie niezwykle użyteczna w terapii genowej. Wiedza ta ma duże znaczenie kliniczne, ponieważ niesie ze sobą możliwości leczenia łysienia, zapobiegania łysieniu wywołanemu chemioterapią oraz trwałej modyfikacji koloru włosów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.
Przegląd
Mieszek włosa jest złożonym wyrostkiem skóry, który podlega ciągłym cyklom, co czyni go celem terapii genowej. Niniejszy artykuł omawia metody histokultury i transdukcji genów w mieszkach włosowych, co może mieć znaczenie dla leczenia utraty włosów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Terapia genowa
- Dermatologia
Wstęp
- Mieszki włosowe składają się z wielu typów komórek i struktur.
- Przechodzą one przez kolejne fazy wzrostu, na które wpływają komórki macierzyste.
- Terapia genowa może potencjalnie pomóc w leczeniu takich schorzeń jak łysienie.
- Zrozumienie biologii mieszków włosowych jest kluczowe dla opracowania skutecznych metod leczenia.
Cel badania
- W celu zaprezentowania metody hodowli tkankowej mieszków włosowych.
- W celu zbadania technik transdukcji genów w mieszkach włosowych.
- W celu oceny wydajności ekspresji GFP w mieszkach włosowych.
Zastosowane Metody
- Histo-hodowla próbek skóry z następującym po niej traktowaniem kolagenazą.
- Zakażenie mieszków włosowych adenowirusem niosącym plazmid GFP.
- Ocena ekspresji GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Analiza wydajności transdukcji poprzez zliczanie mieszków włosowych pozytywnych pod kątem GFP.
Główne wyniki
- Osiągnięto efektywną transdukcję mieszków włosowych białkiem GFP.
- Ekspresję GFP można wizualizować in vivo oraz w hodowlach histologicznych.
- Metoda wykazuje potencjał do zastosowań w terapii genowej.
- Omówiono możliwości leczenia łysienia oraz modyfikacji koloru włosów.
Wnioski
- Badanie przedstawia skuteczną metodę terapii genowej mieszków włosowych.
- Zrozumienie transdukcji genów może doprowadzić do postępów w leczeniu utraty włosów.
- Przyszłe badania mogą skupić się na zastosowaniach klinicznych tych technik.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Celowana transdukcja wirusowa mieszków włosowych ex vivo umożliwia precyzyjne dostarczanie genów do odrębnych populacji komórek mieszkowych, co wspiera funkcjonalną analizę ekspresji genów w złożonej tkance regeneracyjnej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną strategii genoterapii w ramach programów rozwoju medycyny dermatologicznej i regeneracyjnej, szczególnie tam, gdzie kluczowa jest specyficzność w odniesieniu do typu komórek oraz ilościowa wydajność transdukcji. Wyniki ilościowe oraz powtarzalność tej metody czynią ją cennym narzędziem do wczesnej walidacji celów oraz badań translacyjnych w obszarze B+R w sektorze biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną celów genowych w określonych populacjach komórek mieszków włosowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie przestrzennego i czasowego śledzenia ekspresji genów za pomocą GFP.
- Ułatwia ilościową ocenę aktywności promotora oraz wydajności dostarczania genów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny system ex vivo do oceny wektorów i konstruktów dostarczania genów.
- Umożliwia uzyskanie zestandaryzowanych, mierzalnych odczytów wydajności transdukcji przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wspiera opracowywanie testów do przesiewowego wyboru kandydatów do terapii genowej celujących w biologię skóry i mieszków włosowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z systemami istotnymi dla chorób w celu modelowania zaburzeń mieszków włosowych i terapii regeneracyjnych.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, pozwalając na przeszczepy in vivo oraz podłużne monitorowanie ekspresji genów.
- Wspiera decyzje o postępach w programach terapii genowej celujących w przydatki skóry, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda transdukcji wirusowej ex vivo integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między walidacją in vitro a oceny funkcjonalnej in vivo dla kandydatów do terapii genowej celujących w biologię mieszków włosowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie ukierunkowanej analizy ekspresji genów w subpopulacjach mieszków włosowych.
- Screening: Dostarcza ilościowe, powtarzalne dane dotyczące wydajności transdukcji, które pomagają w wyborze wektora i konstruktu.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne pomiary oparte na fluorescencji w celu porównania warunków dostarczania genów i uzyskanych wyników.
- Badania translacyjne: Ułatwia ciągłość badań przedklinicznych poprzez przeszczepy i monitorowanie in vivo genetycznie zmodyfikowanych mieszków włosowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną i adaptacyjną platformę do oceny różnorodnych metod terapii genowej w modelach skóry i mieszków włosowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapii genowej i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w tkankach złożonych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy dostarczania i kwantyfikacji genów w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie ilościowych danych o transdukcji specyficznej dla typu komórek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów terapii genowej celujących w wskazania dermatologiczne i regeneracyjne, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli tkanek ex vivo, pracy z wektorami wirusowymi oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury analitycznej służącej do ilościowego obrazowania i analizy danych.
- Konieczna jest standaryzacja procesów przetwarzania tkanek oraz kryteriów oceny między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możlijna może być konieczność adaptacji metody dla różnych gatunków, typów mieszków włosowych lub wektorów dostarczania genów.
- Wydajność i swoistość mogą różnić się w zależności od typu wektora, wyboru promotora oraz stanu tkanki.
