Name: Wolnokomórkowa in vitro translacja mRNA w Drosophila Lizowaniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę wolnokomórkowej translacji mRNA in vitro w lizatach z zarodków Drosophila. Protokół umożliwia badanie syntezy białek i kontroli translacyjnej w różnych gatunkach muszek owocówek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

N.B.-Á i G.H. były wspierani przez program finansowania wewnętrznego Narodowego Instytutu Onkologii (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), Meksyk; D.E.V. jest stypendystą doktorskim programu Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) “Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022”. Dziękujemy Fannis Missirlis i Bety Osorio (CINVESTAV, Meksyk) za muchówki.

1) Budowa szablonu plasmidu dla in vitro transkrypcji
<ol>
	<li>Wybierz plazmidy zawierające 5´ nietranslatowaną sekwencję (UTR), reporter cistron, 3´ UTR i ogon poli(A) poniżej promotora polimerazy RNA T7, T3 lub SP6. Upewnij się, że każda konstrukcja zawiera unikalne miejsce restrykcyjne tuż poniżej ogona poli(A) na linearyzację plazmidu przed transkrypcją (Rysunek 1). 
	UWAGA: Wybrane miejsce enzymatycznej restrykcji powinno być starannie dobrane tak, aby miejsce rozpoznania znajdowało się poza sekwencja transkrybowaną lub takie, które pozwala na zakończenie linearyzowanego DNA na A. Ponadto, enzym restrykcyjny powinien pozostawić ostry lub 5' występ w 3' końcu szablonu. Występy 3' mogą prowadzić do aberracyjnych produktów transkrypcji. Jeśli użyty jest enzym z występem 3', fragment powinien być ostrzy przed użyciem.</li>
	<li>Weryfikuj wszystkie konstrukcje przez sekwencjonowanie przed użyciem ich jako szablonów dla in vitro transkrypcji. 
	UWAGA: Konstrukty reportera luciferase z ogonem poli(A)71 zostały użyte w tym przepływie pracy. Konstrukcje FLuc pochodzą z kasety pLUC12. Informacje o wektorze i zestawie są wymienione w Tabeli Materiałów.</li>
</ol>
2) In vitro transkrypcja zmapowanej i poliadenylowanej mRNA
<ol>
	<li>Linearyzuj każdą konstrukcję plazmidu używając unikalnego miejsca restrykcyjnego poniżej ogona poli(A) (tutaj KpnI).</li>
	<li>Rozdzielaj linearyzowane DNA przez elektroforezę na żelu agarowym 1% przez 1 h przy 100 V.</li>
	<li>Wyodrębnij DNA z żelu i sprawdź jego integralność oraz właściwą linearyzację przez identyczną elektroforezę na żelu agarowym. 
	UWAGA: Nie jest konieczne czyszczenie linearyzowanego DNA na żelu – jeśli DNA jest całkowicie rozcięte, wystarczy czyszczenie kolumnowe lub ekstrakcja fenolowa/opadnianie w ETOH.</li>
	<li>Transkrybuj oczyszczone linearyzowane DNA używając in vitro zestawu transkrypcyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść analog czapki 5´ w reakcji transkrypcyjnej aby ustabilizować RNA i stymulować translację. 
	UWAGA: Funkcjonalny analog czapki, taki jak m7G(5′)ppp(5′)G RNA, wspiera ustabilizowanie transkryptu i stymulację translacji. Niefunkcjonalny analog czapki, taki jak G(5′)ppp(5′)A, wspiera ustabilizowanie transkryptu, ale nie stymulację translacji. Ten inhibitor translacji jest używany, gdy bicistroniczne transkrypty są translatowane aby sprawdzić obecność wewnętrznych miejsc wejściowych rybosomu (IRES) sterujących translacją drugiego cistronu7. Aby sprawdzić zależność od ogona poli(A), może on być usunięty w szablonie plazmidu przed wykonaniem transkrypcji.</li>
	<li>Traktuj wszystkie reakcje transkrypcji DNase wolną od RNazy aby usunąć szablon DNA po transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie in vitro zestawy transkrypcyjne zawierają DNase wolną od RNazy.</li>
	<li>Oczyść transkrypt przez osadzanie chlorkiem litu lub oczyszczanie RNA na kolumnie zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Wszystkie in vitro zestawy transkrypcyjne zawierają odczynniki do opadania chlorkiem litu.</li>
	<li>Zmierz przez spektroskopię oczyszczony transkrypt i oceń integralność mRNA przez elektroforezę na żelu agarowym 1% przez 1 h przy 100 V.</li>
	<li>Porcjuj mRNA i przechowuj w -70 °C do użycia.</li>
</ol>
3) Rutynowa utrzymanie dużej kultury Drosophila
<ol>
	<li>Użyj odniesienia Drosophila melanogaster szczep dzikich zwierząt Oregon-R.</li>
	<li>Przygotuj pokarm dla much według uznane przepisu. 
	UWAGA: Autorzy użyli receptury Bloomington Drosophila Stock Center37 jako odniesienia do przygotowania pokarmu. Szczegóły tego przepisu są wymienione w Tabeli 237. Rysunek 2 przedstawia ogólny przepływ od pobrania embrionów przez kwantyfikację aktywności luciferase.</li>
	<li>Ustaw sześcian lub cylindryczną klatkę z akrylu o długości około 1 m i średnicy 50 cm.</li>
	<li>Zrób około 30 cm średnicę otworu w górnej części klatki i uszczelnij go siatką (Rysunek 3).</li>
	<li>Umieść mokrą papier na siatce aby zapewnić wodę dla much i wymieniać mokrą papier co dzień (Rysunek 3).</li>
	<li>Trzymaj przednią część klatki otwartą i przykrytą tkanką aby umożliwić dostęp do środka klatki. Umieść akryl na tylnej stronie plastikowej klatki dla much, całkowicie uszczelniony.</li>
	<li>Amplifyuj hodowlę much przed pobraniem embrionów i umieść około 1000 młodych much wewnątrz klatki. Utrzymuj klatkę dla much na stałej temperaturze 22-25 °C.</li>
	<li>Karm much co dzień płytkami agar-sok owocowy posypany łyżeczką od

<ol>
	<li>Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.</li>
	<li>Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.</li>
	<li>Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.</li>
	<li>Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5&#8242;-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.</li>
	<li>Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.</li>
	<li>Zapata JM, Mart&#237;nez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.</li>
	<li>Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.</li>
	<li>Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.</li>
	<li>Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.</li>
	<li>Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5&#8242; and 3&#8242; UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.</li>
	<li>Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.</li>
	<li>V&#225;zquez-Pianzola P, Hern&#225;ndez G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.</li>
	<li>Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.</li>
	<li>Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.</li>
	<li>Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.</li>
	<li>Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.</li>
	<li>Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.</li>
	<li>Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.</li>
	<li>Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.</li>
	<li>Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.</li>
	<li>Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.</li>
	<li>Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.</li>
	<li>Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.</li>
	<li>Kr&#252;ger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.</li>
	<li>Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.</li>
	<li>Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.</li>
	<li>Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.</li>
	<li>Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.</li>
	<li>Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user&#8217;s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.</li>
	<li>Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.

Drosophila lizaty na potrzeby translacji in vitro bezkomórkowej mogą przynosić wyniki powtarzalne. Embriony w różnym wieku oraz różnice w składzie buforu były wykorzystywane do badania szerokiego zakresu podstawowych zjawisk w syntezie białek i ich maszynerii (Tabela 1). W tym miejscu opisano standardową metodę, która nadaje się dla zarodków każdego wieku do przeprowadzania badań w precyzyjny, ilościowy sposób (Tabela 1). Ten protokół może być potencjalnie przy...

Przez ponad stulecie Drosophila udowodniła, że jest potężnym, genetycznie uchwytnym organizmem modelowym do badania wielu zjawisk biologicznych i cząsteczek, w tym kontroli translacji i maszyn translacyjnych1,2,3,4. Drosophila pozakomórkowa in vitro translacja stała się potężnym narzędziem do badania syntezy białek, ponieważ może naśladować wiele zdarzeń obserwowanych in vivo. Dlatego Drosophila jest idealnym systemem do odkrywania nowych funkcji i cząsteczek wykonujących translację i kontrolę translacji. Wczesne badania ustanowili in vitro, translacyjnie kompetentny system w blisko spokrewnionym z muchówkami stawonogu Artemia salina5 a później w Drosophila hydei6.
Później, lizaty odpowiedzialne na eksogenne mRNA zostały opracowane w Drosophila melanogaster. Większość badań nad Drosophila in vitro translacją przeprowadzano na zarodkach w różnym wieku, choć niektóre wariacje buforu reakcji translacji były używane przez różne grupy badawcze. Dla porównania, różne badane zjawiska i warunki reakcji translacji są wymienione w Tabeli 1. Oprócz zarodków, protokoły dla pozakomórkowej in vitro translacji używającej oocytów Drosophila10,22,23,24,25,26 oraz lizaty z hodowanych komórek Schneider lub Kc również zostały opracowane17,27,28,29,30,31,32 . Opis komponentów potrzebnych do in vitro translacji oraz porównanie lizatów z różnych gatunków są opisane w referencjach33,34.
Chociaż proces translacji mRNA jest zachowany wśród eukariontów, znaczne różnice między taksonami występują głównie na etapie inicjacji translacji, gdzie różne cząsteczki hamujące lub promujące translację działają w sposób specyficzny dla taksonu lub gatunku w trakcie rozwoju35,36. Ten protokół jest bardzo odpowiedni do badania translacji mRNA u owadów przez cały rozwój, dla którego nie można używać lizatów z daleko spokrewnionych Metazoan, w tym komercyjnych lizatów z pszenicy lub królika. Rzeczywiście, ten protokół może naśladować zdarzenia translacji zachodzące podczas embriogenezy, czego nie da się osiągnąć przy użyciu lizatów oocytów23. Do tej pory nie przeprowadzono porównania pomiędzy systemami Drosophila na zarodkach, oocytach i hodowanych komórkach. Dodanie modyfikacji potranslacyjnych do białek syntetyzowanych in vitro jest ograniczeniem tego protokołu w jego obecnym stanie. Co więcej, ta metoda nie daje przygotowawczych ilości białka w porównaniu z metodami produkcji białek rekombinowanych w bakteriach.
Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły do rutynowego hodowli dużych kafesów muchówek Drosophila, przygotowywania szablonów syntetycznego mRNA, przygotowywania lizatów kompetentnych do translacji z zarodków i przeprowadzania pozakomórkowych assayów translacji in vitro. Tabela Materiałów przedstawia reagenty wymagane w całym protokole.

<table><tbody><tr><td>Aluminum foil sheet</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>Standard household aluminum foil; any equivalent commercial brand acceptable.</td></tr><tr><td>Amino acids mixture</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Apple cider vinegar</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>Commercial apple cider vinegar (5% acidity); any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Apple or grape fruit juice</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>Commercial grape juice; or any equivalent commercial brand.</td></tr><tr><td>Bacteriological agar&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Boric acid (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, Molecular Biology grade, &ge;99.5%, powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNA cap structure</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: Non-functional cap analogue G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube (15 mL)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphokinase from rabbit muscle</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphoric acid, disodium salt</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dehydrated baker&acute;s yeast</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Commercial active dry yeast; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutant strains of Drosophila melanogaster, as well as wild-type reference strains of other Drosophila species, such as virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. are also provided by this Stock Center.</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS reagent, 99.4-100.6%, powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5%(titration)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>Commercial (~2.5-3.5% hydrogen peroxide solution; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 and AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, also termed KCH3COO</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb broth (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Luciferase assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 and AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>J.T Baker&nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS Reagent</td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Any company</td><td>N/A</td><td>Sequence-specific.</td></tr><tr><td>Pasive lysis 5X buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 microliters yellow tips.</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1ml blue tips.</td></tr><tr><td>Pipet Tips&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0.5-10 microliters clear tips.</td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS reagent grade, &ge;99.5%, liquid.</td></tr><tr><td>PYREX&reg; 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder</td><td>&nbsp; PYREX&reg;&nbsp;&nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep spin plasmid miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Rabbit reticulocyte lysate (RRL)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Renilla luciferase (RLuc) assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasin ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy minielute RNA clean up kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (However, it depends on the molecular size cutoff).</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite (bleach)</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Commercial bleach (~5-6% NaOCl); any equivalent commercial brand with similar concentration acceptable.</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stainless steel sieve</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any commercial supplier.</td></tr><tr><td>Taq plus precision DNA polymerase</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XI</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9014-25-9 or R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris (Tris base)</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70145</td><td>Molecular biology grade powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLBX9437</td><td>Laboratory Grade</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Unflavored gelatin powder</td><td>Knox</td><td>N/A</td><td>Commercial unflavored gelatin powder; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Unrefined cane sugar (piloncillo)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Commercial Mexican unrefined whole cane sugar; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Vector: pBluescript SK or KS (+/-)</td><td>Stratagene</td><td>200301</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Vector: pGEM-T or pGEM-T Easy.&nbsp;</td><td>Promega</td><td>

wolnokomórkowa in vitro translacja mrna w drosophila lizowaniu

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

Bezkomórkowa translacja mRNA in vitro odegrała kluczową rolę w zrozumieniu procesu syntezy białka podczas ekspresji genów u eukariontów. Rozwój lizatów z różnych systemów do translacji in vitro był istotny w badaniach nad rolami większości komponentów maszyn translacyjnych i w rozdzielania wielu etapów procesu syntezy białka. Różne aspekty translacji i kontroli translacji zostały przebadane przy użyciu lizatów Drosophila melanogaster. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe protokoły przygotowania syntetycznych szablonów mRNA, hodowli dużych kultur żyjących much, przygotowania lizatów kompetentnych do translacji z zarodków Drosophila oraz przeprowadzania bezkomórkowych reakcji translacji in vitro. Ten protokół jest odpowiedni dla każdego gatunku z rodzaju Drosophila—melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei itp. Dodatkowo porównujemy ten protokół z innymi systemami translacji oraz omawiamy ograniczenia, kluczowe kroki i rozwiązywanie problemów. Przedstawiono reprezentatywne wyniki, które pomagają ocenić wydajność i powtarzalność protokołu. Na koniec omawiamy potencjalne zastosowania w biotechnologii i badaniach.

Przeprowadziliśmy reakcje translacji w celu analizy zmienności wydajności pomiędzy sześcioma niezależnymi preparatami lizatów (tj. powtórzeniami biologicznymi) z wykorzystaniem embrionów w wieku od 0 do 12 godzin. Każdy słupek reprezentuje powtórzenie techniczne w trzech kopiach (Rysunek 5). Zaobserwowano podobną wydajność translacji, choć z pewną zmiennością. Porównaliśmy również wydajność translacji w embrionach w różnym wieku. Przebadano zatem lizaty z embrionów w wieku od 0 do 2 h, od 0 ...

Tu dostarczamy szczegółów dotyczących przygotowania lizatów i przeprowadzania in vitro translacji za pomocą Drosophila zarodków.

Wolnokomórkowa in vitro translacja mRNA w Drosophila Lizowaniu

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

W naszym badaniu wykorzystujemy drosfilowy system translacji bezkomórkowej do analizy syntezy białek i regulacji translacyjnej na różnych etapach rozwoju owadów. Niniejszy protokół dokładnie odtwarza zdarzenia translacyjne in vivo specyficzne dla rozwoju owadów, w przeciwieństwie do lizatów pochodzących od odległych filogenetycznie metazoa. Na początek otwórz oprogramowanie do klonowania Benchling.Wybierz odpowiedni plazmid, aby wprowadzić konstrukt zawierający niekodującą region pięć pierwszą (5' UTR), cistron reporterowy lucyferazy świetlikowej lub Fluc, niekodującą region trzy pierwszą (3' UTR) oraz ogon poliaadenylanowy lub poly(A) poniżej promotora T7. Wykorzystaj unikalną sekwencję rozpoznawczą KPN1 znajdującą się bezpośrednio za ogonem poly(A), aby zlinearyzować każdy konstrukt plazmidowy przed transkrypcją. Przed użyciem konstruktów jako matryc do transkrypcji in vitro zweryfikuj czystość i wyraźność pików uzyskanych w drodze sekwencjonowania.Rozdziel liniowy DNA za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym przy napięciu 100 V przez jedną godzinę. Wyizoluj liniowy DNA z żelu. Umieść go w mikroprobówce i dodaj bufor do trawienia agarozy (ADB) w celu oczyszczania DNA.Inkubuj

cell-free-in-vitro-mrna-translation-in-drosophila-lysates

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Opisujemy tutaj procedury ekstrakcji i oczyszczania mRNA i metabolitów z głów Drosophila. Stosujemy te techniki, aby lepiej zrozumieć perturbacje komórkowe leżące u podstaw degeneracji neuronów. Metodologie te można łatwo skalować i dostosowywać do innych projektów "omicznych".

Oczyszczanie transkryptów i metabolitów z głów Drosophila

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj metodę wolnokomórkowej translacji mRNA in vitro w lizatach z zarodków Drosophila. Protokół umożliwia badanie syntezy białek i kontroli translacyjnej w różnych gatunkach muszek owocówek.

Wolnokomórkowa in vitro translacja mRNA w Drosophila Lizowaniu

Przeglądaj więcej filmów