Name: Proste i precyzyjne podejście oparte na karmieniu doustnego podawania leków rybom (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj precyzyjną metodę doustnego podawania leków rybom z użyciem żelatyny, która minimalizuje stres zwierząt. Technika ta umożliwia indywidualne dawkowanie i jest idealna do badań farmakologicznych z udziałem Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (R35GM142566) dla J.W.K.

W tym badaniu zastosowano dorosłe samce i samice AB i TL rybek zebrowych (w wieku 4–12 miesięcy). Wszystkie zwierzęta były hodowane i trzymane na Wayne State University. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użycia zgodnie z wytycznymi Wayne State University. Ryby były trzymane w standardowych warunkach na wysoko gęstych stojakach (temperatura 27,5 ± 0,5 °C, przewodność wody 500 µS ± 10 µS, i pH 7,5 ± 0,2) z cyklem 14 h:10 h światło: ciemność (światła włączane o 08:00 h). Ryby karmiono dwa razy dziennie suchym pokarmem rano i świeżo wyklutymi solówkami po południu. Reagenty i sprzęt użyty są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Ważenie ryb i obliczanie objętości pokarmu
<ol>
	<li>Nalej około 50 mL wody systemowej do 100 mL szkła becherka i umieść go na wadze cyfrowej. Taruj wagę.</li>
	<li>Delikatnie złap pojedynczą rybę z ich domowego zbiornika za pomocą siatki z drobnymi oczkami. Krótko dotknąć siatki suchym ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś rybę do becherka, upewniając się, że woda nie wylała się na wagę.</li>
	<li>Zapisz wagę i użyj tej zmierzonej wagi, aby obliczyć wymaganą objętość pokarmu na podstawie 1% objętości na wagę ciała (V/BW) dla każdej pojedynczej ryby.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktu z solówek
<ol>
	<li>Zawiesz proszek solówek w wodzie destylowanej do stężenia końcowego 250 mg/mL. Mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wyśrodkuj zawiesinę z prędkością 12 500 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej i zachowaj nadstan.</li>
	<li>Powtórz wyśrodkowanie jeszcze raz i ponownie zebraj nadstan.</li>
	<li>Przechowywaj ekstrakt z solówek w temperaturze −20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pokarmu na bazie żelatyny
<ol>
	<li>Roztapiaj ekstrakt z solówek przed przygotowaniem i oblicz docelowe masy żelatyny (12% w/v), spiruliny (4% w/v) i, w stosownej sytuacji, związków farmakologicznych wymaganych dla pożądanej objętości pokarmu żelatynowego.</li>
	<li>Waż spirulina i proszek żelatynowy (pochodzenia świńskiego; Bloom ≈ 300 g) do osobnych 1,5 mL mikrocentrfugowych probówek i zapisz rzeczywistą masę w każdej probówce. Upewnij się, że zmierzona masa jest na poziomie lub powyżej docelowej masy dla przewidywanej końcowej objętości.</li>
	<li>Dodaj odpowiednie objętości ekstraktu z solówek, związku leku i wody do probówki zawierającej spirulina, aby osiągnąć końcowe stężenia 4% w/v spirulina i 80 mg/mL ekstraktu z solówek.</li>
	<li>Przemieszaj dokładnie, aby wyhomogenizować. Przenieś wymaganą objętość mieszanki z poprzedniego kroku do probówki zawierającej żelatynę, aby uzyskać końcowe stężenie żelatyny 12% w/v.</li>
	<li>Umieść probówkę na wstępnie podgrzanym bloku grzewczym 45 °C na 5 min, przemieszaj okresowo, aż żelatyna całkowicie się rozpuści. Jeśli rozpuszczanie jest niekompletne, delikatnie mieszaj za pomocą sterylnego drewnianego lub metalowego mieszadła, aby pomóc w homogenizacji.</li>
	<li>Podziel dokładnie wyhomogenizowaną mieszankę (do 100 µL na probówkę) do etykietowanych 1,5 mL mikrocentrfugowych probówek.</li>
	<li>Przechowywaj alikwoty w temperaturze −20 °C przez noc, aby umożliwić całkowite zestalenie i ułatwić obsługę podczas karmienia.</li>
</ol>
4. Tworzenie pojedynczych porcji pokarmu
<ol>
	<li>Podgrzej alikwoty mieszanki żelatynowej do 45 °C, aż całkowicie się rozpuści przed karmieniem.</li>
	<li>Przemieszaj rozpuszczoną mieszankę żelatyny dokładnie.</li>
	<li>Nałej objętość odpowiadającą 1% masy ciała ryby na arkusz folii parafinowej, aby uformować pojedyncze porcje (Rysunek 1). 
	UWAGA: Aby ułatwić obsługę i przechowywanie, umieść arkusz folii parafinowej wewnątrz naczynia Petriego przed nalaniem objętości. Pozwala to na to, aby folia pozostała płaska i ułatwia przeniesienie przygotowanych porcji do −20 °C w celu przechowywania.</li>
	<li>Umieść porcje w temperaturze −20 °C przez co najmniej 20 min, aby pozwolić na ponowne zestalenie.</li>
	<li>Przechowuj porcje na lodzie aż do karmienia.</li>
</ol>
5. Podawanie pokarmu żelatynowego
<ol>
	<li>Przenieś ryby z regału hodowlanego do pokoju behawioralnego i pozwól im przyzwyczaić się przez 1 godzinę.</li>
	<li>

<ol>
	<li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish emergence of a new model vertebrate.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+organism+for+behavioural+genetics.">Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics.</a> BMC Neurosci. 11 (1), 90 (2010).</li><li>Gerlai, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+translational+relevance+and+cognitive+function+the+future+of+zebrafish+in+behavioral+neuroscience.">Evolutionary conservation translational relevance and cognitive function the future of zebrafish in behavioral neuroscience.</a> Neurosci Biobehav Rev. 116, 426-435 (2020).</li><li>Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considering+aspects+of+the+3Rs+principles+within+experimental+animal+biology.">Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology.</a> J Exp Biol. 220 (17), 3007-3016 (2017).</li><li>Levin, E. D., Limpuangthip, J., Rachakonda, T., Peterson, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+nicotine+effects+on+learning+in+zebrafish.">Timing of nicotine effects on learning in zebrafish.</a> Psychopharmacology (Berl). 184 (3-4), 547-552 (2006).</li><li>Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+retinal+ablation+demonstrates+that+the+extent+of+rod+cell+death+regulates+the+origin+of+the+regenerated+zebrafish+rod+photoreceptors.">A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors.</a> J Comp Neurol. 518 (6), 800-814 (2010).</li><li>Sison, M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+performance+altering+effects+of+MK-801+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio).</a> Behav Brain Res. 220 (2), 331-337 (2011).</li><li>Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+zebrafish+model+of+bacterial+pathogenesis.">Streptococcus zebrafish model of bacterial pathogenesis.</a> Infect Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).</li><li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish.">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), e2126 (2010).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+adult+zebrafish.">Gavaging adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (78), e50691 (2013).</li><li>Ochocki, A. J., Kenney, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gelatin-based+feed+for+precise+and+non-invasive+drug+delivery+to+adult+zebrafish.">A gelatin-based feed for precise and non-invasive drug delivery to adult zebrafish.</a> J Exp Biol. 226 (2), jeb245186 (2023).</li><li>Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gelatin-based+diet+for+oral+dosing+juvenile+to+adult+zebrafish.">A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish.</a> Lab Anim Sci Prof. 32, 35 (2014).</li><li>Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+treatment+of+zebrafish+mycobacteriosis+tolerance+and+efficacy+of+treatments+with+tigecycline+and+clarithromycin.">Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin.</a> J Fish Dis. 40 (10), 1473-1485 (2017).</li><li>Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protocol+for+the+oral+administration+of+test+chemicals+to+adult+zebrafish.">A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish.</a> Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).</li><li>Atiratana, T., Goldson, A. R., Samosorn, S., Rajput, N., Praphairaksit, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Arabian+jasmine+on+zebrafish+behavior+depends+on+strain+sex+and+personality.">The effects of Arabian jasmine on zebrafish behavior depends on strain sex and personality.</a> PLoS One. 20 (9), e0332642 (2025).</li><li>Beigloo, F., Davidson, C. J., Gjonaj, J., Perrine, S. A., Kenney, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+differences+in+the+boldness+of+female+zebrafish+are+associated+with+alterations+in+serotonin+function.">Individual differences in the boldness of female zebrafish are associated with alterations in serotonin function.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Benvenutti, R., Gallas-Lopes, M., Marcon, M., Reschke, C. R., Herrmann, A. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+NMDA+receptor+antagonists+with+relevance+to+schizophrenia+a+review+of+zebrafish+behavioral+studies.">Glutamate NMDA receptor antagonists with relevance to schizophrenia a review of zebrafish behavioral studies.</a> Curr Neuropharmacol. 20 (3), 494-509 (2022).</li><li>Fowler, L. A., Williams, M. B., Dennis-Cornelius, L. N., Farmer, S., Barry, R. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+commercial+and+laboratory+diets+on+growth+body+composition+and+reproduction+in+the+zebrafish+Danio+rerio.">Influence of commercial and laboratory diets on growth body composition and reproduction in the zebrafish Danio rerio.</a> Zebrafish. 16 (6), 508-521 (2019).</li><li>Siccardi, A. J., Garris, H. W., Jones, W. T., Moseley, D. B., D&#8217;Abramo, L. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+survival+of+zebrafish+Danio+rerio+fed+different+commercial+and+laboratory+diets.">Growth and survival of zebrafish Danio rerio fed different commercial and laboratory diets.</a> Zebrafish. 6 (3), 275-280 (2009).</li><li>Oswald, M., Robison, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+alteration+of+zebrafish+feeding+behavior+in+response+to+aversive+stimuli.">Strain-specific alteration of zebrafish feeding behavior in response to aversive stimuli.</a> Can J Zool. 86 (10), 1085-1094 (2008).</li><li>Lu, Y., Patton, E. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+non-invasive+drug+treatments+in+adult+zebrafish+that+lead+to+melanoma+drug+resistance.">Long-term non-invasive drug treatments in adult zebrafish that lead to melanoma drug resistance.</a> Dis Model Mech. 15 (5), dmm049401 (2022).</li></ol>

Ten protokół opiera się na pracy opublikowanej wcześniej w Journal of Experimental Biology, Ochocki AJ, Kenney JW, 202311. Niniejszy artykuł dostarcza szczegółowych i rozszerzonych wskazówek metodologicznych dotyczących reprodukowalności.

Prezentowana tu metoda podawania żelatyny pozwala na przezwyciężenie kluczowych ograniczeń powszechnie stosowanych metod podawania leków u ryb cebra, umożliwiając indywidualne dawkowanie oparte na masie ciała z minimalnym naciskiem. Poprawia to precyzję i powtarzalność eksperymentów. Cecha żelatyny, że jest termicznie plastyczna, pozwala na przemianę jednorodnego preparatu w płyn, dokładne porcjowanie i ponowne zestalenie w indywidualne porcje, zapewniając jednolite rozprowadzanie leku, a jednocześnie dostosowując się do różnic w wielkości między osobnikami. Ponadto podawanie doustne leku za pomocą karmy żelatynowej unika stresu i potencjalnych obrażeń związanych z metodami wstrzyknięć, co stanowi ważne udoskonalenie w ramach zasad 3R4.
Zalety tej metody zależą od dokładnego wykonania. Kilka czynników proceduralnych jest kluczowych dla pomyślnej realizacji. Dokładne mierzenie pojedynczej masy ciała jest niezbędne, ponieważ dorosłe ryby cebra mogą wykazywać znaczne różnice w wielkości nawet wśród grup dopasowanych pod względem wieku, płci i rasy, przy czym masa ciała może różnić się niemal trzykrotnie między osobnikami11,18,19. Równie ważne jest dokładne wymieszanie związku w macierzy żelatynowej, aby zapewnić jednolite dawkowanie w poszczególnych porcjach karmy. Wreszcie, przyzwyczajenie ryb do karmy żelatynowej przed podaniem leku zmniejsza odmowę przyjmowania karmy; zaleca się wizualne potwierdzenie przyjęcia karmy, aby zapewnić dokładne podanie dawki.
Nawet przy prawidłowym wykonaniu, istnieją pewne praktyczne wyzwania związane z podawanie leków za pomocą karmy. Jednym z potencjalnych problemów jest niewłaściwe zestalenie się porcji karmy, co może prowadzić do szybkiego rozpadu karmy po umieszczeniu w wodzie. Zazwyczaj wynika to z nieodpowiedniej kontroli temperatury i/lub mieszania podczas przygotowywania, przedłużonego ogrzewania lub wielokrotnych cykli zamrażania-odmrażania składników karmy. Aby temu zapobiec, należy upewnić się, że żelatyna została całkowicie rozpuszczona poprzez odpowiednie ogrzewanie/mieszanie, a przygotowane składniki powinny być podzielone na jednorazowe porcje, które są rozmrażane tylko raz i używane natychmiast. W przypadku delikatnych preparatów, zaleca się przygotowanie dodatkowej porcji karmy, którą można dodać do becherki z wodą, potwierdzając właściwe zestalenie przed eksperymentem. W przypadku związków, które zmniejszają przyswajalność karmy, akceptację można poprawić poprzez dodanie środków przyciągających takich jak sok z małży12˒13 lub komercyjnych przynęt dla ryb20. W niniejszym badaniu ekstrakt z larwy soli słonejej został użyty, aby zwiększyć przyswajalność i okazał się skuteczny. Alternatywnie, podawanie wielu mniejszych dawek może poprawić przyjmowanie, osiągając pożądane kumulatywne narażenie. Poza tymi praktycznymi uwagami, podawanie leków za pomocą karmy ma również wbudowane ograniczenia farmakokinetyczne. Podobnie jak wszystkie metody doustne, wchłanianie przez przewód pokarmowy może opóźnić lub zmniejszyć biodostępność w porównaniu z metodami wstrzyknięć, a stabilność związku w macierzy karmy może się różnić.
Mimo przyzwyczajenia, niewielka liczba zwierząt może nie zjeść karmy żelatynowej i powinna być wykluczona z analizy, ponieważ mogą nie otrzymać oczekiwanej dawki leku. Współczynnik odmowy zwykle waha się od 2,4% do 6,4%15,16 i nie stanowi więc dużego problemu metodologicznego. Spożycie karmy może również różnić się w zależności od rasy. Ten efekt szczepu jest zgodny z wcześniejszymi raportami wskazującymi, że tło genetyczne może wpływać na opóźnienie w podejściu do jedzenia20. Należy uwzględnić te czynniki przy projektowaniu eksperymentów. Zaleca się raportowanie zgodności z karmieniem obok tożsamości rasy w celu poprawy przejrzystości i powtarzalności.
Kolejnym ważnym ograniczeniem niniejszego badania jest to, że protokół został opracowany i zweryfikowany wyłącznie u dorosłych ryb cebra i dlatego nie jest bezpośrednio przenośny na stadium larw. Ta metoda opiera się na indywidualnym dawkowaniu opartym na masie ciała i połknięciu dyskretnych kawałków żelatyny. Jest to możliwe u dorosłych, ale niepraktyczne u larw ze względu na małą rozwartość paszczy, zachowanie karmieniowe oparte na zawiesinie i trudność w uzyskaniu wiarygodnych indywidualnych pomiarów masy ciała. W związku z tym, adaptacja dla zastosowań larwowych wymagałaby znacznych modyfikacji. Takie modyfikacje mogłyby obejmować opracowanie mikroskopicznych cząstek i alternatywnych strategii dostarczania leku.
W porównaniu z wcześniej opisanymi metodami opartymi na karmie, podejście to oferuje lepszą dokładność dawkowania i łatwość użycia. Handlowe karmy żelatynowe wymagają porcjonowania heterogenicznego materiału, co ogranicza precyzję dawki12, podczas gdy inne metody podają jednolite ilości

Rybki zebrafish (Danio rerio) są szeroko stosowane w badaniach biomedycznych w celu badania rozwoju, fizjologii, zachowania i farmakologii1,2,3. Jednak przydatność rybek zebrafish w badaniach farmakologicznych, szczególnie u dorosłych zwierząt, jest ograniczona przez dostępność metod wprowadzania leków, które są jednocześnie precyzyjne i minimalnie inwazyjne4.
Powszechnie stosowane techniki wprowadzania leków u rybek zebrafish, takie jak podawanie leków z becherki, iniekcje dootrzewnowe i podawane doustnie przez zgłębnik, mają każda znaczne wady. Ekspozycja poprzez całkowite zanurzenie ciała w płynie z becherki zapewnia ograniczony kontrolę nad wchłanianiem leku, powoduje znaczne marnotrawstwo związków chemicznych i wprowadza zmienność z powodu różnic w szybkości wchłaniania i stabilności związku5,6,7. Podejścia oparte na iniekcjach i podawanie doustne przez zgłębnik umożliwiają bardziej precyzyjne dawkowanie, ale wymagają znieczulenia, ograniczenia ruchów i wielokrotnego obchodzenia się ze zwierzętami, co wszystko może wywoływać reakcje stresu, jednocześnie zwiększając ryzyko obrażeń lub niedotlenienia, co może zniekształcać pomiary behawioralne i fizjologiczne8,9,10. Ograniczenia te są szczególnie problematyczne w przypadku eksperymentów z powtarzającym się lub długotrwałym podawanie leków.
Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano metodę karmienia opartą na żelatynie, która umożliwia szybkie, precyzyjne i nieinwazyjne wprowadzanie leków do rybek zebrafish11. To podejście pozwala na włączenie związków farmakologicznych do małych, indywidualnie dostosowanych porcji pokarmu złożonych z żelatyny, ekstraktu z skorupiaków i spiruliny. Wprowadzanie leków za pomocą pokarmu jest nieinwazyjną alternatywą, która zgadza się z zasadami 3R (zasada zastępowania, redukcji i udoskonalania) w etycznych badaniach na zwierzętach. Chociaż poprzednie badania wykazały wykonalność wprowadzania leków za pomocą pokarmu u dorosłych rybek zebrafish12,13,14, istniejące podejścia polegają na heterogenicznych strukturach pokarmu lub stałych objętościach pokarmu, które nie uwzględniają indywidualnych różnic w masie ciała. Opisana tu metoda eliminuje te ograniczenia, umożliwiając kalibracje dawek w zależności od masy ciała.
Ten protokół dostarcza szczegółowego, krok po kroku opisu przygotowania i administrowania pokarmu opartego na żelatynie u dorosłych rybek zebrafish. Chociaż metoda jest demonstrowana przy użyciu testu behawioralnego, nowego testu zbiornika, jest ona ogólnie stosowania do innych obszarów biologii rybek zebrafish i spodziewana jest jej przystosowność do zastosowania u innych organizmów modelowych w środowisku wodnym. Ten protokół oferuje praktyczne rozwiązanie dla badaczy szukających efektywnej, powtarzalnej i mało stresującej metody wprowadzania leków u rybek zebrafish, szczególnie w przypadku badań wymagających precyzyjnej, wielokrotnej i/lub długotrwałej manipulacji farmakologicznej.

<table><tbody><tr><td>(+) MK-801 hydrogen maleate powder</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M107-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin From porcine skin powder</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G1890-100G</td><td>Mocność żelowania ~300 g Bloom, Typ A, Bioreagent</td></tr><tr><td>Mikro Fine Dried Brine shrimp</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce</td><td>Fine &lt; 400 mikrona</td></tr><tr><td>Spirulina powder</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz</td><td>99% Pure blue green algae</td></tr></tbody></table>

proste i precyzyjne podejście oparte na karmieniu doustnego podawania leków rybom

A Simple and Precise Feed-Based Approach to Oral Drug Delivery in Fish

Typowe metody podawania leków u ryb (np. dawkowanie z becherki, iniekcje dootrzewnowe lub podawanie doustne) są czasochłonne, niedokładne i/lub marnotrawne. Ponieważ te metody są również stresujące dla zwierząt, są one słabo przystosowane do wielokrotnego lub długotrwałego podawania leków oraz do eksperymentów behawioralnych, które są wrażliwe na zakłócenia związane z obsługą, ograniczając tym samym przydatność modeli ryb w badaniach biomedycznych. Aby pokonać te przeszkody, opracowano metodę żywieniową opartą na żelatynie, która umożliwia szybkie i precyzyjne dawkowanie leków u ryb przy minimalnym niepokojeniu. Metoda polega na przygotowaniu indywidualnie dostosowanych porcji karmy składającej się z żelatyny, wyciągu z kiełżaka małego, spiruliny i wybranego leku. Termoprzemienność żelatyny pozwala na upłynnienie pojedynczej jednorodnej preparacji, dokładne podzielenie według indywidualnej masy ciała i ponowne zestalenie w niestandardowe porcje. Jako dowód zasady antagonista receptora NMDA MK-801 (4 mg kg⁻1) został podany dorosłym daniom pręgowanym przed testem w nowym zbiorniku, co wywołało efekty behawioralne zgodne ze zmniejszonym zachowaniem podobnym do lęku. To podejście jest dobrze przystosowane do farmakologii behawioralnej i może być łatwo dostosowane do innych organizmów modelowych wodnych.

Smakowitość paszy żelatynowej 
Aby ocenić smakowitość paszy, dorosłym daniowi zebrafish linii AB i TL podawano paszę na bazie żelatyny przez pięć kolejnych dni zamiast porannej porcji pokarmu (Rycina 2). Wszystkie ryby linii TL spożyły paszę w ciągu 5 min podczas pierwszej ekspozycji, natomiast ryby linii AB wymagały wielokrotnej ekspozycji, przy czym 15 z 16 osobników konsekwentnie spożywało paszę po czterech kolejnych dniach aklimatyzacji (Rycina 2A). Analiza czasu spożycia paszy przy użyciu trójdrożnej analizy wariancji ANOVA (linia × płeć × dzień) wykazała istotne efekty główne linii (F₁,₁₂₅ = 19.4, P &lt; 0.0001) oraz dnia (F₄,₁₂₅ = 5.80, P &lt; 0.001), ale brak istotnego efektu głównego płci (F₁,₁₂₅ = 0.24, P = 0.63). Odnotowano istotne interakcje między linią a dniem (F₄,₁₂₅ = 3.35, P = 0.012) oraz między linią, dniem a płcią (F₄,₁₂₅ = 2.55, P = 0.04). Ryby TL obu płci spożywały paszę szybko od pierwszej ekspozycji (4–20 s), podczas gdy ryby AB wykazały dłuższe początkowe czasy spożycia (7–144 s), które zmniejszały się z każdym dniem (Rycina 2B). W czwartym i piątym dniu wszystkie ryby, z wyjątkiem jednego samca AB, spożyły paszę w ciągu 10 s. Około 95% ryb spożywa paszę żelatynową w ciągu 30 s od podania po 2–3 dniach aklimatyzacji, co zgadza się z wcześniejszymi doniesieniami15,16.
Wpływ behawioralny MK-801 podanego w pożywce żelatynowej 
Aby wykazać skuteczność dostarczania leku za pomocą żelatyny, zastosowano MK-801, antagonista receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR), podany w pożywce żelatynowej. Jako wskaźnik behawioralny mierzono dystans od dna podczas eksploracji nowego zbiornika. Znane jest, że MK-801 zmienia lokomocję oraz zachowania lękowe lub unikanie drapieżników u dorosłych danio pręgowanych17. Dorosłe ryby danio pręgowane linii AB zaaklimatyzowano do procedury karmienia, podając im przez dwa kolejne dni kawałki żelatyny bez leku, aby zapewnić oswojenie i niezawodną konsumpcję. Trzeciego dnia ryby przypisane do grupy badawczej otrzymały jednorazową dawkę MK-801 (4 mg kg⁻1) włączoną do pożywki żelatynowej. Ryby kontrolne otrzymały identyczny kawałek żelatyny zawierający jedynie nośnik (wodę). Pożywkę podano na 30 min przed oceną behawioralną w teście nowego zbiornika.
Zachowanie przypominające lęk lub unikanie drapieżników, mierzone jako odległość od dna, przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA (płeć × lek), która wykazała istotny główny efekt MK-801 (Rycina 3) (F₁,₆₉ = 24.5, P &lt; 0.001). Ryby poddane działaniu leku spędzały więcej czasu w górnej części akwarium, co jest wzorcem powszechnie interpretowanym jako zmniejszenie zachowania przypominającego lęk lub unikanie drapieżników. Nie stwierdzono głównego efektu płci (F1,69=2.52, P=0.12) ani interakcji między lekiem a płcią (F1,69=1.0, P=0.32). Testy t dla par z korektą FDR potwierdziły, że MK-801 zwiększył odległość od dna zarówno u samic (P = 0.0076), jak i u samców (P = 0.023).
Podsumowując, wyniki te wykazują, że pasza na bazie żelatyny umożliwia skuteczne podawanie związków farmakologicznych drogą doustną, wywołując oczekiwane zmiany w zachowaniu dennym indukowane lekiem w teście nowego zbiornika.
<img alt="Próbki mikromacierzy obok monety; pasek skali 5 mm; stosowane w chemii analitycznej i diagnostyce." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70856/70856fig1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie pożywki żelatynowej. Pożywkę żelatynową naniesiono pipetą na folię parafinową w pojedynczych porcjach odpowiadających 1% masy ciała, a następnie pozostawiono do zastygnięcia w temperaturze −20 °C. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Ochocki et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70856/70856fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza zachowań żywieniowych, wykres przedstawiający procent spożycia i czas jedzenia w zależności od szczepu/płci w ciągu 5 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70856/70856fig2.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Spożycie paszy na bazie żelatyny przez dorosłe danio pręgowane. (A) Procent ryb szczepów AB i TL obu płci, które spożyły paszę w ciągu 5 min od podania. (B) Czas do spożycia paszy dla ryb AB i TL z podziałem na płeć. Ryby, które nie spożyły paszy, zostały wykluczone z analizy czasu jedzenia. Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m.; n = 8 ryb na szczep i płeć. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Ochocki et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70856/70856fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy porównujący odległość od dna (cm) pod wpływem podania Vehicle w stosunku do MK-801 z podziałem na płeć." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70856/70856fig3.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Efekty behawioralne po podaniu antagonisty receptora NMDA. MK-801 (4 mg/kg) podano 30 min przed testem nowego zbiornika u dorosłych zebrafish AB obu płci. Odległość od dna zbiornika wykorzystano jako miarę zachowań lękowych/unikania drapieżnika. Dane przedstawiono na wykresach pudełkowych wskazujących medianę (linia środkowa), rozstęp międzykwartylowy (pudełko) oraz ±1,5× rozstęp międzykwartylowy (wąsy). *P &lt; 0,05 na podstawie parowych testów t skorygowanych o wskaźnik fałszywych odkryć (FDR). Wielkość próby: samice vehicle, n = 20; samice MK-801, n = 19; samce vehicle, n = 19; samce MK-801, n = 15. Pięć zwierząt wykluczono z analizy, ponieważ nie spożyły one żelu żelatynowego. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Ochocki i wsp.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70856/70856fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Stężenie docelowe</td>
			<td>Docelowa masa/objętość</td>
			<td>Rzeczywista masa/objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Żelatyna</td>
			<td>-</td>
			<td>12% (m/v)</td>
			<td>60 mg</td>
			<td>62 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina</td>
			<td>-</td>
			<td>4% (m/v)</td>
			<td>20 mg</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekstrakt z solankowych krewetek</td>
			<td>250 mg/ml</td>
			<td>80 mg/ml</td>
			<td>160 µL</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lek</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>0,4 mg/µL (4 mg/kg przy 1% BW)</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>320 µL</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość pożywki płynnej</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>625 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCałkowita objętość gotowej paszy</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>516,7 µL </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przykład przygotowania paszy żelatynowej. Stężenia roztworów stokowych, wartość docelowa oraz hipotetyczne rzeczywiste masy lub objętości użyte do przygotowania paszy na bazie żelatyny dla podania leku w dawce 4 mg/kg przy 1% masy ciała.
Plik uzupełniający 1: Przykład przygotowania paszy na bazie żelatyny dla wielu ryb. Przykład praktyczny demonstrujący sporządzenie paszy zawierającej lek oraz obliczenie indywidualnych objętości dawek w oparciu o masę ciała poszczególnych osobników.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70856/2026-02-28_Gelatin_Supplemental%20information.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Niniejsze badanie przedstawia metodę karmienia opartą na żelatynie, która umożliwia precyzyjne, nieinwazyjne podawanie leków doustnych u dorosłych rybek zebra z uwzględnieniem masy ciała. Protokół wykazuje niezawodną akceptację pokarmu i, jako dowód zasady, pomyślne podanie MK-801, które zaowocowało oczekiwanymi efektami behawioralnymi.

Proste i precyzyjne podejście oparte na karmieniu doustnego podawania leków rybom

Typical methods for drug delivery in fish (e.g., beaker dosing, intraperitoneal injections, or oral gavage) are time-consuming, imprecise, and/or ...

To badanie opisuje metodę precyzyjnego i nieinwazyjnego podawania leków dorosłym rybom zebrafish. W przeciwieństwie do stresujących, inwazyjnych lub nieprecyzyjnych tradycyjnych metod, ten protokół umożliwia nieinwazyjne i precyzyjne podawanie leków dorosłym rybom zebrafish. Aby rozpocząć, napełnij szklany kolbę o pojemności 100 mililitrów 50 mililitrami wody z systemu.Umieść ją na wadze cyfrowej i uzbież wagę, aby odjąć wagę kolby, i zresetuj wagę do zera. Użyj delikatnej siatki, aby delikatnie usunąć pojedynczą rybę z jej domowego zbiornika. Usuń nadmiar wody, krótko dotykając siatki suchym ręcznikiem papierowym.Następnie delikatnie umieść rybę w kolbie, nie rozlewając wody na wadze. Zapisz wagę i oblicz wymaganą objętość karmy jako 1% objętości na wagę ciała dla każdej pojedynczej ryby. Dodaj wcześniejzważony proszek z kiełków soli morskiej do 50 mililitrów wody destylowanej, mieszając, aby uzyskać końcową koncentrację 250 miligramów na mililitr.Mieszaj przez godzinę. Wyśrodkuj zawiesinę przy 12 500 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. I pobierz nadstan.Wyśrodkuj ponownie płyn, aby usunąć wszelkie pozostałości zawieszonego zanieczyszczenia i pobierz nadstan. Przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez maksymalnie sześć miesięcy. Aby przygotować karmę na bazie żelatyny, rozmroź ekstrakt z kiełków soli morskiej i oblicz przybliżoną objętość wymaganą dla 500 mikrolitrów karmy.Oblicz wymagane ilości składników, następnie zmierzyć i dodać odpowiednie ilości związku leku, spiruliny, wody i ekstraktu z kiełków soli morskiej do 1,5-mililitrowej mikro-centrfużującej probówki. Dokładnie wiruj, aby uzyskać jednorodność. Przenieś wymaganą objętość mieszaniny do probówki zawierającej żelatynę, aby uzyskać końcową koncentrację żelatyny 12% wagi na objętość.Umieść probówkę na wstępnie podgrzanym bloku grzewczym o temperaturze 45 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wiruj intermitentnie, aż żelatyna całkowicie się rozpuści. Jeśli konieczne, delikatnie mieszaj sterylnym drewnianym lub metalowym kijem, aby pomóc w uzyskaniu jednorodności.Przenieś 100 mikrolitrów uzyskanej jednorodnej mieszaniny do oznakowanych 1,5-mililitrowych mikro-centrfużujących probówek i utwardzaj przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wyrównaj płaski arkusz folii parafinowej w miseczce Petriego, podgrzej ponownie i wiruj przygotowaną karmę żelatynową. I pipetą pobierz objętość odpowiadającą 1% masy ciała ryby na folię parafinową, aby uformować pojedyncze kawałki.Utwardzaj kawałki, umieszczając miseczkę Petriego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut i trzymaj na lodzie do karmienia. Przenieś ryby z rusztowania hodowlowego do pomieszczenia behawioralnego, aby się zaaklimatyzowały przez jedną godzinę. Użyj przezroczystych barier, aby tymczasowo odizolować każdą rybę w zbiorniku na dwie do pięciu minut przed karmieniem.Użyj kleszczy, aby podnieść karmę z parafilmu i umieść pojedynczy żelatynowy kawałek na powierzchni wody dla każdej ryby. Obserwuj każdą rybę przez pięć minut, aby potwierdzić spożycie całego kawałka. Usuń bariery po spożyciu karmy, a następnie zwróć ryby na swoje domowe rusztowania lub wykorzystaj je do procedur eksperymentalnych.Kiedy dorosłe ryby AB i TL zebrafish otrzymywały karmę żelatynową przez pięć ranek zamiast zwyczajowego posiłku, wszystkie ryby TL zjadły kawałki w ciągu pięciu minut pierwszego dnia. Natomiast ryby AB potrzebowały czterech dni aklimatyzacji, aby osiągnąć stałą szybkość spożycia dla 15 z 16 osobników. Ryby TL obu płci spożywały karmę szybko od pierwszego kontaktu w ciągu od czterech do 20 sekund, podczas gdy ryby AB wykazywały dłuższy początkowy czas spożycia w zakresie od siedmiu do 144 sekund.Ale poprawili się poniżej 30 sekund przez kolejne dni. Po dwóch dniach aklimatyzacji do żelatynowych kawałków, dorosłe ryby AB płci męskiej i żeńskiej zostały podzielone na grupy kontrolne i leczone, a następnie karmione pojazdem lub kawałkami zawierającymi MK-801. Zachowanie analizowano jako odległość od dna w nowym teście w zbiorniku.I zarówno ryby leczone lekami, jak i samice spędzały więcej czasu w pobliżu szczytu zbiornika w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na zmniejszone zachowanie podobne do lęku lub unikanie drapieżników. Ten protokół umożliwia precyzyjne dawkowanie leków i pozwala na pomiar reakcji behawioralnych, farmakologicznych i fizjologicznych u dorosłych ryb zebrafish. Głównymi wyzwaniami są homogenizacja karmy, ustawianie i potwierdzanie spożycia przez każdą rybę.Przyszła praca będzie rozszerzać tę metodę na inne związki, różne schematy dawkowania i inne wodne organizmy modelowe.

a-simple-and-precise-feed-based-approach-to-oral-drug-delivery-in-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Ten film demonstruje technikę doustnej intubacji dorosłego danio pręgowanego w celu podania eksperymentalnych związków do przełyku i monitorowania ich wchłaniania w jelitach. Metoda ta stanowi cenny model do badania dynamiki doustnych środków profilaktycznych lub innych związków w jelicie.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego w celu podania związków eksperymentalnych

Coraz częstsze wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego wymaga opracowania skutecznych metod dostarczania znanych ilości związków i roztworów. Opisana poniżej procedura zgłębnika pozwala na doustne podawanie precyzyjnych objętości roztworu dorosłym rybom danio pręgowanym.

Dorastający dorosły danio pręgowany

Ten artykuł demonstruje zasady szybkiego, minimalnie inwazyjnego wstrzykiwania mikrocząsteczek fluorescencyjnych do układu krążenia małych ryb oraz wizualizacji in vivo mikrocząsteczek we krwi ryb.

Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

Metoda generowania modelu kardiomiopatii wywołanej doksorubicyną u dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) jest opisana tutaj. Przedstawiono dwa alternatywne sposoby iniekcji dootrzewnowej i omówiono warunki zmniejszania różnic między różnymi grupami eksperymentalnymi.

Model kardiomiopatii indukowanej doksorubicyną u dorosłych danio pręgowanego

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Tutaj opisujemy syntezę liposomów naładowanych lekiem i ich mikroiniekcję larwom danio pręgowanego w celu ukierunkowania dostarczania leków do komórek z linii makrofagów.

Kierowanie leków na larwy makrofagów danio pręgowanego poprzez wstrzykiwanie liposomów zawierających leki

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie metody samodzielnego podawania leków, które mogą być używane w mysich modelach żywienia i otyłości.

Samodzielne podawanie leków w mysich modelach żywienia i otyłości

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Tutaj opisujemy podawanie leków za pomocą mikropipet (MDA) jako alternatywną metodę do doustnego podawania leków, która zachęca zwierzę badawcze do łatwego przyjmowania leków przy minimalnym stresie i dyskomforcie.

Stosowanie podawania leków pod kontrolą mikropipet jako metody alternatywnej dla doustnego podawania przez zgłębnik w modelach gryzoni

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.

Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym

Poznaj precyzyjną metodę doustnego podawania leków rybom z użyciem żelatyny, która minimalizuje stres zwierząt. Technika ta umożliwia indywidualne dawkowanie i jest idealna do badań farmakologicznych z udziałem Danio rerio.

Proste i precyzyjne podejście oparte na karmieniu doustnego podawania leków rybom

Przeglądaj więcej filmów