Name: Ocena wpływu pokrytych filtrów i filtrów wstępnych na zakaźność i stężenie aerozolu zawierającego wirusa Phi6 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę oceny powłok antywirusowych z miedzi i srebra na filtrach powietrza przy użyciu komory aerozolowej i bakteriofaga Phi6. Badanie pomaga rozwijać skuteczniejsze technologie filtracji powietrza w pomieszczeniach zamkniętych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sari Korhonen jest dziękowana za doskonałą pomoc techniczną. Pavlina Gregorova jest wdzięczna za radę dotyczącą protokołu qRT-PCR. Dziękujemy późnemu Profesorowi Dennisowi H. Bamfordowi za jego nieocenione wkłady w projektowanie ustawienia komory oraz za całą pomoc w trakcie eksperymentów. Dr A.-P. Hyvärinen jest wdzięcna za pomoc w ustawianiu komory do testowania aerozoli. Zasłużonym dziękom podlegają udostępnienie obiektów i ekspertyza jednostki Instruct-HiLIFE Biocomplex na Uniwersytecie Helsińskim, będącej członkiem Instruct-ERIC Centre Finland, FINStruct i Biocentrum Finlandii. Badanie zostało sfinansowane przez Radę Badań Finlandii, specjalne finansowanie COVID 335681 i finansowanie 368144 dla N.S.A. Rada Badań Finlandii jest wdzięczna za finansowanie projektu ACCC Flagship (grant nr 337552). Ujawniamy wsparcie finansowe ze strony Clean Touch Medical LTD, M-Filter LTD i UniqAir LTD w zakresie finalizowania eksperymentów, przy czym firmy te nie odegrały żadnej roli w projektowaniu eksperymentów, ich realizacji, raportowaniu ani w pisaniu żadnej części manuskryptu.

Wirus, szczepy, pożywki wzrostowe i miana wirusa zakaźnego 
Bakteriofag Phi6, pierwotnie przekazany grupie badawczej przez dr Anne K. Vidaver40, był namnażany z wykorzystaniem bakterii gospodarza Pseudomonas syringae pv. phaseolicola HB10Y. Gospodarza hodowano w pożywce Luria–Bertani (LB) w temperaturze 22 °C. Zapasy Phi6 na agarze przygotowano z materiału zamrożonego poprzez rozcieńczenia seryjne, zgodnie z protokołem Bamforda i wsp. (1995)41, i wykorzystano zarówno do testów żywotności na powierzchni, jak i do oczyszczania wirusa.
Oczyszczanie i zagęszczanie Phi6 przeprowadzono zgodnie z protokołem opracowanym przez Bamford i wsp. (1995)41. Otrzymaną zawiesinę rozcieńczono w 20 mM buforze fosforanu potasu (K₃PO₄) zawierającym 1 mM chlorku magnezu (MgCl₂), dostosowanym do pH 7.2, aby uzyskać końcowy miano wynoszący 5 × 1010–1011 jednostek tworzących plak (PFU/mL). Tak przygotowaną zawiesinę wykorzystano następnie w eksperymentach generowania aerozolu.
Wyliczanie zakaźnych cząsteczek wirusa przeprowadzono za pomocą standardowego testu plackowego z dwuwarstwową nakładką agaru, który został zoptymalizowany dla bakteriofaga Phi642. W skrócie, najpierw dla każdej próbki wirusa lub kontrolnej przygotowano rozcieńczenia seryjne w podłożu LB, po czym do 100 µL każdego rozcieńczenia dodano 200 µL zawiesiny bakterii gospodarza oraz 3 mL miękkiego agaru. Mieszaniny miękkiego agaru naniesiono na powierzchnię płytek z agarem LB, a następnie płytki inkubowano przez noc w temperaturze 22 °C. Następnie policzono placki i obliczono liczbę PFU/mL według wzoru: ( liczba placków × czynnik rozcieńczenia ) / objętość naniesiona na płytkę.
Analiza qRT-PCR 
Przygotowanie próbek do ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) przeprowadzono zgodnie z protokołem Gregorova i wsp. (2022)43. Krzywe standardowe dla RNA P2 i P8 wygenerowano, stosując serię rozcieńczeń 10-krotnych w zakresie od 102 do 109 cząsteczek na 5 µL. Każde rozcieńczenie przetwarzano w sposób identyczny jak próbki doświadczalne, w tym poprzez dodanie chloroformu, mieszanie w wortexie, wirowanie przy 10000 × g przez 1 min w 22 °C oraz przeprowadzenie cykli (informacje o cyklach i starterach znajdują się w Uzupełniającej tabeli 1 oraz Uzupełniającej tabeli 2). Kontrole negatywne przygotowano, zastępując 5 µL matrycy RNA wodą ultrapurystyczną. Dane z qRT-PCR analizowano przy użyciu dedykowanego oprogramowania do projektowania i analizy (patrz Tabela materiałów).
Konfiguracja komory aerozolowej 
Do aerozolizacji wirusów i testowania filtrów opracowano specjalnie zbudowaną, autoklawowalną komorę aerozolową, wzorowaną na opisanym wcześniej systemie31. Komora eksperymentalna składała się z cylindrycznego szklanego korpusu z dopasowaną pokrywą, wewnętrznego metalowego stelaża oraz uszczelek izolacyjnych zapewniających szczelność (patrz Tabela materiałów oraz Rycina uzupełniająca 1).
Ogólna konfiguracja badania, wraz z komorą, została przedstawiona na Rysunku 1. Aby zapewnić stabilny i powtarzalny dopływ aerozoli wirusowych, zastosowano nebulizator w połączeniu z pompką powietrzną (patrz Tabela materiałów).
Wewnątrz komory nebulizator generował przepływ aerozolu o natężeniu 8 L/min. Około trzech czwartych tego przepływu kierowano do układu wydechowego przez filtr HEPA, natomiast pozostała jedna czwarta (2 L/min) trafiała do komory. Taki podział miał na celu zmniejszenie wilgotności podczas długotrwałych pomiarów. Aerozole wprowadzano do komory za pomocą metalowego lejka, który kierował strumień na powierzchnię filtra lub prefiltra.
Eksperymenty aerozolowe przeprowadzono w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Po przejściu przez komorę przepływ powietrza został osuszony w desykatorem, aby chronić filtr HEPA oraz przepływomierz przed nadmierną wilgocią. Zewnętrzna pompa dodatkowo wspomagała przepływ powietrza, wytwarzając w systemie podciśnienie i zapewniając wydajny odpływ przez port wylotowy.
<img alt="Schemat filtracji HEPA, układ aerozolu wirusowego; nebulizator, pompa, przepływomierz; badanie oczyszczania powietrza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70877/70877fig1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat eksperymentalnej komory aerozolowej i pobierania próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70877/70877fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Projekt badania 
W niniejszym badaniu oceniono właściwości przeciwwirusowe powłok oraz materiałów filtracyjnych i prefiltracyjnych wymienionych w Tabeli 1, Tabeli uzupełniającej 3 oraz Tabeli uzupełniającej 4 (patrz również Tabela materiałów). Badanie przeprowadzono w dwóch etapach: testy powierzchniowe oraz testy prefiltrów w komorze aerozolowej.
W testach powierzchniowych wszystkie materiały powłokowe zostały najpierw ocenione na płaskich próbkach w celu określenia ich aktywności przeciwwirusowej. Powlekłe próbki dostarczyła firma Clean Touch Medical LTD (Tabela 1 oraz Tabela materiałów). Wszystkie powłoki opierają się na aktywnych składnikach miedzi i/lub srebra osadzonych w zastrzeżonych matrycach; różnice między formulacjami dotyczą przede wszystkim składu metali, ich stężenia oraz kompatybilności z powierzchnią (np. powierzchnie płaskie w porównaniu z filtrami porowatymi) (Tabela uzupełniająca 3).
Testy filtrów wstępnych w komorze aerozolowej: spośród dostępnych powłok tylko powłoka VS-B na bazie miedzi i srebra mogła zostać naniesiona na filtry wstępne podczas badania. W związku z tym filtry wstępne traktowane powłoką VS-B zostały przebadane w komorze aerozolowej w celu oceny ich skuteczności przeciwwirusowej w warunkach ekspozycji na aerozol. Zdjęcia wszystkich filtrów i filtrów wstępnych użytych w badaniu znajdują się na Ryc. uzupełniającej 2.
Skuteczność przeciwwirusową określono za pomocą dwóch komplementarnych metod: testu plackowego w celu pomiaru liczby zakaźnych cząsteczek wirusa (patrz sekcja „Wirusy, szczepy, pożywki i miana wirusa zakaźnego”) oraz ilościowej PCR (qPCR) w celu określenia liczby kopii genomu wirusa (patrz sekcja „Analiza qRT-PCR”).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td rowspan="2">Filtry i prefiltry</td>
			<td rowspan="2">Filtr dostarczony przez</td>
			<td >Powłoki</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >(Wszystkie dostarczone przez Clean Touch Medical)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prefiltr poliestrowy FMR-5, niepowlekany (FMR-5)</td>
			<td rowspan="5">M-filter LTD</td>
			<td rowspan="7">Eksperymentalny środek powierzchniowy na bazie miedzi A6 (A6) 
			Eksperymentalny środek powierzchniowy na bazie miedzi B4 (B4) 
			Miedziano-srebrny środek powierzchniowy Viral Safe (VS) 
			Miedziano-srebrny środek powierzchniowy Viral Safe B (VS B)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prefiltr poliestrowy FMR-5, powlekany VS B (FMR-5 VS B)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prefiltr poliestrowy S-11, niepowlekany (S-11)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prefiltr poliestrowy S-11, powlekany VS B (S-11 VS B)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dwuwarstwowy filtr z włókna szklanego GF-2, niepowlekany (filtr typu HEPA) (GF-2)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prefiltr Bulpren BP-6, 6 mm, niepowlekany (BP-6)</td>
			<td rowspan="2">Clean Touch Medical LTD</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prefiltr Bulpren BP-6, 6 mm, powlekany VS B (BP-6 VS B)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Filtry i powłoki powierzchniowe użyte w niniejszym badaniu.
Wydajność antywirulanych powłok powierzchniowych 
Opracowano test żywotności powierzchniowej w celu oceny trwałości zakaźności wirusa na różnych materiałach powłokowych. W skrócie, 20 µL roztworu zapasowego Phi6 (patrz sekcja „Wirus, szczepy, pożywki i miano wirusa zakaźnego”) naniesiono pipetą na powlekane próbki testowe i równomiernie rozprowadzono na obszarze 2 cm × 2 cm za pomocą sterylnego trójkąta szklanego. Próbki inkubowano w komorze bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze 22 °C przez 1 min, 5 min, 1 h lub 3 h.
Wirusy odzyskano poprzez dodanie 180 µL świeżego pożywki LB na powierzchnię i wypłukanie poprzez wielokrotne pipetowanie. Jako powierzchnię kontrolną wykorzystano plastikową płytkę Petriego. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w temperaturze 22 °C. Liczbę infekcyjnych cząsteczek wirusa określono za pomocą metody płytkowej41.
Wpływ powłoki przeciwwirusowej VS-B na skuteczność filtra/prefiltra 
Gromadzenie wirusów i badanie wydajności filtrów przeprowadzono z wykorzystaniem metody impakcji z użyciem szalki Petriego zawierającej 20 mM bufor HEPES (pH 7,2) lub szklanego impingera wirowego (dalej nazywanego „impingerem”; patrz Tabela materiałów)44. W przypadku pobierania próbek metodą impakcji, szalkę Petriego umieszczono bezpośrednio pod filtrem, aby zmaksymalizować osadzanie się cząstek (Rycina 1). W eksperymentach z filtrami GF‑2, które były użytkowane przez 3 miesiące, zamiast szalki Petriego zastosowano impinger w celu zwiększenia czułości. Impinger jest urządzeniem szklanym wyposażonym w trzy dysze i wymaga zewnętrznej pompy do pobierania powietrza do cieczy. Przepływ powietrza przez dysze generuje ruch wirowy cieczy zbierającej wzdłuż wewnętrznej ścianki, co ułatwia łagodne usuwanie cząstek. W tej konfiguracji przepływ powietrza przez filtr utrzymywano na poziomie 2 L/min, a po opuszczeniu komory dodatkowy zawór zwiększał całkowity dopływ powietrza do 10 L/min. Aerozole wychwytywano w 5 mL 20 mM buforu HEPES (pH 7,2), uzupełniając odparowany bufor co 30 min. W eksperymentach z użyciem impingera usunięto zarówno szalkę Petriego, jak i prefiltr bulpren (stosowany do wyrównania przepływu powietrza; Rycina uzupełniająca 1 oraz Rycina uzupełniająca 2B).
Szczegółowy protokół pobierania próbek przedstawiono w Tabeli 2. Aerozole wirusowe zbierano poprzez odzyskanie 1 mL zawiesiny z czałek Petriego zawierających 20 mL buforu HEPES 20 mM (pH 7,2). Z tej ilości 800 µL wykorzystano do analizy qRT‑PCR, a 200 µL do miareczkowania wirusa. Każdy filtr lub przefiltrowano w trzech powtórzeniach, a serie kontrolne bez filtra/przedfiltru przeprowadzano przez 15 min przed i po każdym eksperymencie w komorze. Po kontroli przedeksperymentalnej do komory wprowadzono badany filtr lub przedfiltr, a następnie komora pracowała przez 3 h, po czym usunięto filtr/przedfiltr i przeprowadzono kontrolę poeksperymentalną. Próbki do qRT‑PCR i miareczkowania wirusa pobierano co 30 min, co pozwoliło na uzyskanie ośmiu próbek do qRT‑PCR i ośmiu próbek do miareczkowania w każdym eksperymencie. W eksperymentach z użyciem impingera próbki do miareczkowania pobierano tylko raz, na koniec 3-godzinnego cyklu. Każdą próbkę do qRT‑PCR zamrożono gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania, natomiast próbki do miareczkowania wirusa przetwarzano niezwłocznie po eksperymencie przy użyciu metody płytkowej. Roztwór wirusa użyty w nebulizatorze miareczkowano zarówno przed, jak i po każdym eksperymencie w celu monitorowania stabilności.
Trzy różne filtry wstępne: BP-6, S-11 i FMR-5 oraz filtr GF-2 (Tabela 1 oraz Rycina uzupełniająca 2, Tabela uzupełniająca 4) zostały pokryte VS-B. Filtry wstępne składały się z syntetycznych materiałów włóknistych o różnej gęstości strukturalnej, zaprojektowanych głównie do usuwania grubych cząstek i stabilizacji przepływu powietrza, natomiast filtr GF-2 jest wysokowydajnym filtrem z włókna szklanego o charakterystyce typu HEPA. W celu porównania w komorze aerozolowej przetestowano filtry wstępne bez powłoki oraz układ bez filtra.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Punkt czasowy</td>
			<td >Układ</td>
			<td >Próbki</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kontrola</td >
			<td >0-15 min</td >
			<td >Brak filtra/prefiltra, szalka Petri z 20 mL HEPES</td >
			<td rowspan="8">200 μl do mianowania, 800 μL zamrożone do qRT-PCR</td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="6">Eksperyment</td >
			<td >0-30 min</td >
			<td >Analizowany filtr/prefiltr, nowa szalka Petri z 20 mL HEPES</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >30-60 min</td >
			<td >Analizowany filtr/prefiltr, ta sama szalka Petri z 19 mL HEPES</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >60-90 min</td >
			<td >Analizowany filtr/prefiltr, ta sama szalka Petri z 18 mL HEPES</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >90-120 min</td >
			<td >Analizowany filtr/prefiltr, ta sama szalka Petri z 17 mL HEPES</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >120-150 min</td >
			<td >Analizowany filtr/prefiltr, ta sama szalka Petri z 16 mL HEPES</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >150-180 min</td >
			<td >Analizowany filtr/prefiltr, ta sama szalka Petri z 15 mL HEPES</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Kontrola</td >
			<td >0-15 min</td >
			<td >Brak filtra/prefiltra, nowa szalka Petri z 20 mL HEPES</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Harmonogram pobierania próbek.
Wpływ powłoki przeciwwirusowej VS na używane filtry 
Trwałość działania przeciwwirusowego na filtrach typu HEPA GF-2 powleczonych miedzio-srebrnym środkiem powierzchniowym Viral Safe (VS) oceniono poprzez pomiar wydajności filtracji filtrów, które były użytkowane przez 3 miesiące, w oparciu zarówno o liczbę wirusów zakaźnych, jak i liczbę kopii genomu wirusowego. W tych eksperymentach wykorzystano cztery oczyszczacze powietrza (patrz Tabela materiałów), z których każdy był wyposażony w filtr HEPA i warstwę węgla aktywnego. Przed pobraniem i analizą filtry pracowały przez okres 3 miesięcy w dwóch restauracjach: jedna była restauracją typu fine-dining, a druga stołówką pracowniczą w fabryce (więcej informacji w Rysunek uzupełniający 3 oraz Rysunek uzupełniający 4). Wydajność tych używanych filtrów porównano z wydajnością czystych, niepowlekanych filtrów GF-2.
Przed badaniami w komorze zużyte filtry wyjęto z metalowych klatek oczyszczaczy powietrza, rozłożono i pocięto na kawałki o odpowiedniej wielkości do komory aerozolowej wewnątrz dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić bezpieczeństwo biologiczne i zminimalizować kontaminację krzyżową. Filtry GF‑2 pobrane z restauracji typu fine-dining oraz z kantyny pracowniczej poddano następnie badaniom w układzie eksperymentalnym opisanym w sekcji „study design”, wykorzystując zmodyfikowany impinger o pojemności 5 mL do pobierania aerozolu.
Oprócz skuteczności przeciwwirusowej oceniono fizyczne właściwości powierzchni filtrów. Lipofilność oceniano poprzez naniesienie kropli 50 µL oleju rzepakowego, natomiast hydrofobowość określono poprzez naniesienie kropli 50 µL wody dejonizowanej na wycięte paski filtrów. Kąty zwilżania udokumentowano fotograficznie zgodnie z procedurą Xiao i Wiesnera (2012)45. Odpychanie wody ilościowo określono za pomocą pomiarów czasu penetracji kropli wody (WDPT) zgodnie z opisem Lichnera i wsp. (2006), przy czym wszystkie wartości przekroczyły 7200 s46.
Analiza statystyczna 
Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu standardowego oprogramowania statystycznego (patrz Tabela materiałów), aby ocenić istotność zaobserwowanych różnic między testowanymi materiałami powłok i filtrami. Analiza statystyczna dla wszystkich eksperymentów została wykonana w dwóch etapach: przy użyciu testu H Kruskala-Wallisa oraz testu post-hoc Gamesa-Howella. Test H Kruskala-Wallisa zastosowano w celu ustalenia, czy zaobserwowano istotne różnice, a konkretne różnice między typami próbek określono za pomocą wielokrotnych porównań średnich z zastosowaniem testu post-hoc Gamesa-Howella.
Testy wydajności powłok analizowano statystycznie poprzez porównanie spadku stężeń wirusa zakaźnego w 1 min i 5 min w stosunku do stężeń początkowych. Ze względu na zamysł wykorzystania powłok na filtrach, poszukiwano statystycznie istotnych odchyleń w żywotności wirusa w porównaniu z kontrolą w pierwszych minutach testu.
Analizę statystyczną w celu określenia istotnych różnic w wydajności filtrów wstępnych z powłoką i bez powłoki pod kątem liczby jednostek zakaźnych oraz wyników qPCR przeprowadzono oddzielnie dla każdego punktu czasowego: 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min i 180 min. Następnie dane pogrupowano według rodzaju filtra wstępnego oraz obecności powłoki na jego powierzchni. Podobnie oceniono wydajność użytych filtrów GF-2 pod kątem inaktywacji wirusów i efektywności filtracji, grupując dane według lokalizacji oraz obecności powłoki na powierzchni filtra.

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

W tej pracy przedstawiamy protokół oceny efektywności powłok powierzchniowych filtrów antywirusowych i przedprzędzi w komorze aerozolowej mikrobiologicznej. Zbudowana komora oferuje kontrolowany, zamknięty system nadający się do aseptycznych analiz mikrobiologicznych, ponieważ jest sterylizowana, przenośna, przejrzysta i ma małą skalę (3 L) w porównaniu z niektórymi wcześniej opisanymi komorami31,50,51.
Wszystkie materiały powłokowe przetestowane w tej pracy potwierdziły posiadanie działania antywirusowego (Rysunek 2A), przy czym eksperymentalna powłoka powierzchniowa na bazie miedzi B4 wykazała najwyższą skuteczność, zmniejszając zakaźność wirusów poniżej granicy wykrywalności w ciągu 10 min. Powłoka na bazie miedzi A6 ściśle nadążała, osiągając całkowitą inaktywację wirusa w 25 min (Rysunek 2A). Te wyniki są zgodne z wcześniejszymi raportami dotyczącymi właściwości antywirusowych miedzi i srebra17,18,20,21,22,52. Żadna inaktywacja wirusa nie została zaobserwowana w ciągu pierwszych 5 min przed zesuszeniem kropel, co wskazuje, że wczesne zmniejszenie zakaźności było w dużej mierze spowodowane suszeniem, a nie samą powłoką (kontrola, Rysunek 2A, Rysunek 2B)36. Powłoki B4 i A6 wykazywały szybszą kinetykę inaktywacji w porównaniu z powłokami VS i VS-B, podczas gdy VS-B potrzebowało do 60 min, aby osiągnąć limit wykrywalności (Rysunek 2A). Przedprzędzia z powłokami B4 i A6 były niedostępne; dlatego VS-B zostało wybrane do kolejnych eksperymentów z aerozolami filtracyjnymi.
Wyniki tej pracy podkreślają, że filtry HEPA i przedprzędzia skutecznie zmniejszają liczbę wirusów przechodzących przez nie nawet w przypadku braku powłok antywirusowych. Stres mechaniczny na zawieszone wirusy podczas filtracji doprowadził do zmniejszenia zakaźności wirusów o 1,0–2,0 log (z ~8 × 105 – 1 × 107 PFU/mL do ~5 × 104 – 105, Rysunek 3A). To zmniejszenie było konsekwentnie obserwowane we wszystkich testach przedprzędzi, co wspiera wcześniejsze ustalenia50,53,54. Dla filtra HEPA typu GF-2 utrata zakaźności wirusów była jeszcze większa, bez wykrywalnych zakaźnych cząstek w granicach wrażliwości metody (Rysunek 3A). Niższa zakaźność w stosunku do liczby kopii genomu sugeruje, że filtracja wywiera mechaniczne uszkodzenia na cząstkach wirusowych, zjawisko to jest szczególnie widoczne dla wirusa Phi6 otoczonego osłonką. Ponieważ wirusy otoczone osłonką są bardziej podatne na zakłócenia mechaniczne, ta różnica może być mniejsza dla wirusów nieotoczonych osłonką55.
W testach aerozolowych powłoki nie wywierały statystycznie istotnego wpływu na wydajność filtracji przedprzędzi. Prawdopodobnie oznacza to ograniczony kontakt między powłoką a wirusami przechodzącymi przez filtr, co prowadzi do podobnych wyników dla powłokowanych i niepowłokowanych przedprzędzi (Rysunek 3B, Rysunek 4B). Obliczone czasy przebywania poniżej sekundy sugerują, że antywirusowa kinetyka inaktywacji musi zachodzić w bardzo krótkim czasie, aby być skuteczna w realnych warunkach przepływu powietrza. Ponadto nasze wyniki sugerują, że testowane powłoki nie wykazują elektrostatycznej afinicji charakterystycznej dla jonów miedzi do ujemnie naładowanych cząstek biologicznych, co mogłoby w przeciwnym razie przyciągać wirusy do filtra i zmniejszać ich przejście56. Dlatego główna korzyść z powłok przedprzędzi może polegać na ich właściwościach samonaczyszczania po załadowaniu, jak to zostało wykazane w testach na powierzchni, a nie na zwiększaniu mechanicznej wydajności filtracji. Co ważne, eksperymenty przeprowadzone w tej pracy reprezentują warunki filtracji jednoprzelotowej, gdzie zawieszone cząstki wchodzą w interakcję z filtrem tylko raz. Prowadzi to do bardzo krótkich czasów przebywania i ograniczonego kontaktu wirus-powierzchnia, co prawdopodobnie zmniejsza obserwowalny wpływ powłok antywirusowych. W przeciwieństwie do tego, rzeczywiste systemy oczyszczania powietrza działają zwykle w warunkach recyrkulacji, gdzie wielokrotne przejście powietrza zwiększa łączny kontakt i może zwiększyć efektywność powłok.
Nasze wyniki wskazują, że filtry GF-2 wykazały lepszą usuwanie zaka

Zrozumienie przenoszenia wirusów drogą powietrzną uległo znacznemu postępowaniu podczas pandemii COVID-19. Biorąc pod uwagę, że środowiska wewnątrz budynków prezentują znacznie wyższe ryzyko przenoszenia niż środowiska na zewnątrz, istnieje pilna potrzeba opracowania bardziej efektywnych strategii ochronnych1,2. W tym kontekście, systemy klimatyzacji i czyszczenia powietrza o wysokiej wydajności stanowią istotne elementy łagodzenia przenoszenia wirusów w przestrzeniach zamkniętych.
Filtracja powietrza jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych metod stosowanych w systemach czyszczenia powietrza, polegającą na wewnętrznych fizycznych właściwościach filtracji i wielowarstwowym filtrowaniu3,4,5. Często obejmuje to filtr wstępny, gruboziarnisty filtr, który uchwytuje duże cząstki; średniowydajny filtr, na przykład filtr węglowy; oraz filtr powietrza o wysokiej efektywności (HEPA), który usuwa co najmniej 99,97% cząstek o najbardziej penetrującym rozmiarze cząstek 0,3 μm6,7. Właściwości fizyczne filtrów zawierają wiele przeciwdrobnoustrojowych korzyści. Wcześniej wykazano, że materiały porowate mogą inaktywować wirusy poprzez ich uwięzienie i wysuszenie8,9,10. Można również odpowiednio wykorzystać hydrofobowość lub hydrofilność. Wirusy o hydrofobowych powłokach preferują hydrofobowe powierzchnie do sorpcji, podczas gdy powierzchnie hydrofilowe przyciągają wirusy hydrofilowe11,12. Ponadto, antywirusowe powłoki na powierzchniach mogą być wykorzystywane do dalszego zwiększenia czystości. Powłoki filtrów mają na celu natychmiastową inaktywację patogenów, gdy dotykają filtra13,14. Te cechy mogą zwiększyć bezpieczeństwo eksploatacyjne, szczególnie w szpitalach, ale również w środowiskach publicznych podczas epidemii i pandemii14.
W praktycznych zastosowaniach, efekt inaktywacji powłok filtra musi być wystarczająco szybki, aby móc być wykorzystany w przepływającym powietrzu. W związku z tym, powierzchnia do bezpośredniego kontaktu pomiędzy powłoką a cząstkami wirusa powinna być wystarczająca, a powłoka powinna być w stanie inaktywować wirusa w określonym czasie kontaktu. Metale ciężkie, takie jak miedź i srebro, są znane z przeciwwirusowych efektów15,16,17. Ten przeciwwirusowy efekt został zaobserwowany dla wirusów takich jak poliowirus, wirus ospy prawdziwej, wirus opryszczki pospolitej 1, Phi6, papovirus SV-40, adenowirus, wirus stomatytu pęcherzykowego, koronawirus SARS, bakulowirus i wirus infekcyjnego zapalenia otrzewnej u kotów18,19,20,21,22. Mechanizmy obejmują uwolnienie jonów miedzi i srebra oraz wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS), które reagują z białkami wirusowymi i utleniają kwasy nukleinowe23,24,25,26,27,28,29,30.
Do przeprowadzenia tego badania opracowano komorę testową filtra aerozolu o regulowanych właściwościach pobierania próbek aerozolu i wirusów, opartą na poprzednim setupie komory przedstawionym przez Sofieva i in. (2022) (patrz Rysunek 1 i Dodatkowy Rysunek 1)31. Zaadaptowana komora została zaprojektowana jako zamknięty system, w którym modele wirusów powodujących choroby układu oddechowego są narażone na działanie filtrów, oceniając skuteczność antywirusową powłok pokrytych i niepokrytych filtrów. Bakteriofag Phi6 otoczonego otoczkami został wybrany jako surogat dla wirusów dróg oddechowych, ponieważ jest dobrze przebadanym i szeroko stosowanym modelem nadającym się do badań aerozoli wirusowych. Ponieważ Phi6 jest niepatogenny dla ludzi i klasyfikowany jako Poziom Bezpieczeństwa Biologicznego 1 (BSL-1), pozwala na bezpieczną i praktyczną ocenę powłok przeciwwirusowych w środowisku laboratorium Poziomu Bezpieczeństwa Biologicznego 2 (BSL-2) zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Ponadto, Phi6 dzieli podobieństwa strukturalne z wirusami otoczonego otoczkami, które powodują choroby układu oddechowego, takie jak ciężki ostry zespół oddechowy koronawirusów 1 i 2 (SARS-CoV-1 i SARS-CoV-2). Jego lipidowa otoczka nadaje mu specyficzną wrażliwość na wysuszenie i chemiczną inaktywację, zapewniając reprezentatywny model do oceny skuteczności powłok przeciwdrob

<table><tbody><tr><td>Aerosol chamber glass cylinder and lid</td><td>Laborexin Oy</td><td>N/A</td><td>Nabrzmiały szklany cylinder i pokrywa do utrzymania aerozolu.</td></tr><tr><td>Aerosol chamber inner metal scaffold</td><td>Clean Touch Medical Ltd.</td><td>N/A</td><td>Nabrzmiały stalowy szkielecik do zamontowania filtra.</td></tr><tr><td>Aerosol chamber lid insulating gaskets</td><td>Etra Oy (Etola Group)</td><td>N/A</td><td>Nabrzmiałe gumowe uszczelki do hermetycznego uszczelnienia.</td></tr><tr><td>Air pump, WI 53082</td><td>Thomas Industries Inc.</td><td>N/A</td><td>Pompa membranowa służąca do utrzymania regulowanego przepływu powietrza przez komorę.</td></tr><tr><td>BioSampler</td><td>SKC Inc.</td><td>https://international.skcinc.com/products/air/bioaerosol-samplers/biosampler</td><td>Całkowicie szklany wirujący uderzeniowiec służący do wysokowydajnego pobierania wirusów z powietrza.</td></tr><tr><td>Coated test pieces</td><td>Clean Touch Medical Ltd.</td><td>www.cleantouchmedical.com</td><td>Połyskujące papierowe slajdki pokryte antymikrobialnymi preparatami do testowania efektywności powierzchni.</td></tr><tr><td>CompAir Pro NE-C900 nebulizer</td><td>Omron Healthcare</td><td>NE-C900&nbsp;</td><td>Kompresorowy nebulizator o wysokiej wydajności służący do generowania aerozolu wirusowego.</td></tr><tr><td>SPSS Statistics software</td><td>IBM Corp.</td><td>https://www.ibm.com/products/spss</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej, wersja 28.0.</td></tr><tr><td>QuantStudio Design and Analysis Software</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/technical-resources/software-downloads.html#pcr</td><td>Oprogramowanie do analizy danych qRT-PCR, wersja 1.3.1.</td></tr><tr><td>UniqAir PRO air purifier</td><td>UniqAir Oy</td><td>https://www.uniqair.fi/</td><td>Komercyjna jednostka do oczyszczania powietrza używana do oczyszczania komory.</td></tr></tbody></table>

ocena wpływu pokrytych filtrów i filtrów wstępnych na zakaźność i stężenie aerozolu zawierającego wirusa phi6

Evaluating the Effect of Coated Filters and Pre-Filters on the Infectivity and Concentration of Aerosolized Phi6 Virus

Rozwój skutecznych technologii filtrowania powietrza w pomieszczeniach zyskał na znaczeniu po pandemii choroby COVID-19. Celem niniejszego badania jest ocena skuteczności przeciwwirusowej różnych powłok na bazie miedzi i srebra dla filtrów powietrza, z wykorzystaniem standaryzowanej komory bioaerozoli i bakteriofaga Phi6 otoczonego błoną jako substytutu dla wirusów dróg oddechowych. Testy powierzchni potwierdziły, że wszystkie powłoki wykazywały aktywność przeciwwirusową, przy czym konkretna formułacja powłoki na bazie miedzi (B4) osiągnęła pełne unieruchomienie wirusa Phi6 w ciągu 10 min, A6 w 25 min, a VS-B w 60 min; wczesne zmniejszenie zakaźności było głównie spowodowane wysychaniem kropel. Eksperymenty z aerozolami wykazały, że filtry HEPA i filtry wstępne znacząco zmniejszyły zakaźność wirusową nawet bez powłok, przy czym mechaniczne filtrowanie powodowało zmniejszenie o 1,0–2,0 log, a filtry ze szkła GF-2 wysokiej klasy eliminowały wykrywalny zakaźny wirus. Powłoki nie poprawiły znacząco wydajności filtracji, prawdopodobnie ze względu na ograniczony kontakt wirusa z powierzchniami powlekanemi. Użyte filtry GF-2 wykazały lepsze usuwanie wirusów, co przypisywano akumulacji cząstek i zagęszczeniu filtra, podczas gdy powłoki nie zmieniały liczby kopii wirusów przechodzących przez nie. Powłoki VS-B wykazywały właściwości lipofilowe, co sugeruje dodatkowe funkcjonalne korzyści. Ta metodologia podkreśla, że chociaż wydajność filtra jest głównie sterowana przez mechaniczne uwięzienie i akumulację cząstek, zintegrowane powłoki powierzchniowe zapewniają mechanizm samoczyszczący poprzez unieruchomienie uwięzionych cząstek wirusowych; zaproponowano integrację światła ultrafioletowego (UV) jako potencjalny przyszły kierunek badań w celu dalszego zwiększenia wydajności systemu.

Przedstawiamy tutaj badanie mające na celu ocenę skuteczności przeciwwirusowej powłok powierzchniowych na filtrach powietrza na bazie miedzi i srebra. Korzystając z komory bioaerozolowej i bakteriofaga Phi6, ta metoda mierzy nieaktywację wirusów i efektywność mechanicznej filtracji dla samoczyszczących technologii czyszczenia powietrza wewnętrznego.

Ocena wpływu pokrytych filtrów i filtrów wstępnych na zakaźność i stężenie aerozolu zawierającego wirusa Phi6

Development of efficient indoor air filtration technologies has gained prominence following the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. The goal of ...

Badanie wpływu przefiltrów i powłok przeciwwirusowych na zmniejszanie zakaźności i stężenia wirusów przenoszonych drogą powietrzną w środowiskach zamkniętych. Obecne podejścia nie uwzględniają realistycznej dynamiki przepływu powietrza. Nasz protokół odtworzy warunki aerozolowe i mierzy zarówno zakaźne wirusy, jak i całkowitą ładunkową wirusową.Na początek, rozcieńcz czystą zawiesinę szczepu bakteriofaga phi6 w 20 milimolarowym buforze fosforanowym potasu zawierającym jeden milimolar chlorku magnezu dostosowanym do pH 7,2. Złóż wszystkie filtry, przefiltry i materiały powłok przeciwwirusowych w szafce bezpieczeństwa biologicznego, aby wykonać testy powierzchni. Oceń aktywność przeciwwirusową wszystkich materiałów powłokowych na podstawie miedzi lub składników aktywnych miedzi i srebra osadzanych w własnościowych macierzach, a mianowicie A6, B4, VS i VS B na płaskich próbkach testowych.Następnie, nakłuj 20 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny szczepu bakteriofaga phi6 na powleczone próbki testowe, aby wykonać test żywotności na powierzchni. Rozprowadź próbkę równomiernie na obszarze dwóch na dwa centymetry, używając sterylnego szkła trójkątnego. Inkubuje próbki w 22 stopniach Celsjusza do czterech punktów czasowych, w tym jedna minuta, pięć minut, jedna godzina lub trzy godziny.Dodaj 180 mikrolitrów świeżego bulionu LB do powierzchni, aby odzyskać wirusy po każdym punkcie czasowym. Umyj powierzchnię poprzez wielokrotne nakłuwanie 10 do 20 razy, aby zebrać próbkę. Użyj plastikowego naczynia Petriego jako kontrolnej powierzchni.Wyznacz skuteczność przeciwwirusową powłok powierzchniowych za pomocą testu płytowego, aby zmierzyć liczbę zakaźnych cząstek wirusowych i ilościową odwrotną transkryptazę reakcji łańcuchowej polimerazy, czyli qRT-PCR, aby określić liczbę kopii genomu wirusowego. Rozcieńcz czystą i skoncentrowaną zawiesinę bakteriofaga phi6, jak pokazano wcześniej, aby uzyskać stężenie wirusowe w zakresie 2,5 razy 10 do potęgi 10 do 4,08 razy 10 do potęgi 11 jednostek tworzących plamy na mililitr. Następnie, złóż komorę aerozolową eksperymentalną, używając cylindrycznego szklanego korpusu z pasującą pokrywą.Włóż wewnętrzny metalowy stelaż do komory i zabezpiecz uszczelki izolacyjne, aby zapewnić szczelność. Użyj nebulizatora w połączeniu z pompą powietrza, aby wygenerować stabilny i powtarzalny wlot aerozolu wirusowego. Tytruj roztwór wirusowy użyty w nebulizatorze przed i po każdym eksperymencie, aby monitorować stabilność.Ustaw przepływ aerozolu na osiem litrów na minutę w komorze. Aby zmniejszyć wilgotność podczas długotrwałych pomiarów, skieruj około trzy czwarte przepływu aerozolu do wydechu przez filtr powietrza wysokiej sprawności, czyli HEPA. Pozostałe jedno czwarte przepływu odpowiadające dwu litrom na minutę pozwól wejść do komory.Użyj lejka, aby skierować przepływ aerozolu w kierunku powierzchni filtra lub przefiltra w komorze. Odwilgotnij wypływ powietrza za pomocą eksykatora, aby chronić filtr HEPA i miernik przepływu przed nadmierną wilgocią. Za pomocą zewnętrznej pompy, stwórz ciśnienie ujemne w systemie i dodatkowo wspomóż przepływ powietrza, aby zapewnić wydajne odprowadzanie przez otwór wylotowy.Oceń właściwości przeciwwirusowe niepowleczonych lub powleczonych VS B poliestrowych i bulprenowych przefiltrów obok dwuwarstwowych materiałów z włókna szklanego w komorze aerozolowej. Aby ocenić efekt przeciwwirusowy przez próbkowanie impaktowe, umieść naczynie Petriego zawierające 20 milimolarowy bufor HEPES o pH 7,2 bezpośrednio pod testowanym przefiltrem, aby zmaksymalizować osadzanie cząstek. Alternatywnie, aby przetestować efekt przeciwwirusowy filtrów GF2, ustaw trójstrumieńkowy całoszklany wirujący uderzeniowiec podłączony do zewnętrznej pompy do zbierania aerozolu.Utrzymuj przepływ powietrza przez testowany przefiltr lub filtr na poziomie dwóch litrów na minutę. Zwiększ całkowitą ilość powietrza do 10 litrów na minutę, używając dodatkowej zaworu po wylocie z komory. Zbierz aerozole w pięciu mililitrach 20 milimolarowego bufora HEPES.I uzupełniaj odparowany bufor co 30 minut. W przypadku trzykrotnego pobierania próbek, przeprowadź kontrolne uruchomienia bez przefiltrów lub filtrów przez 15 minut przed i po każdym eksperymencie. Po kontrolnym uruchomieniu przed eksperymentem, włóż filtr lub przefiltr do komory i eksploatuj system przez trzy godziny.Zbieraj aerozole wirusowe, odzyskują jednego mililitra zawiesiny z naczyń Petriego zawierających 20 mililitrów bufora co 30 minut. Zdejmij filtr i przeprowadź kontrolne uruchomienie po eksperymencie. Zbieraj próbki co 30 minut podczas eksperymentu, aby uzyskać osiem próbek qRT-PCR i tytulacji na każdy eksperyment.W eksperymentach z uderzeniowcem, zbieraj próbki tytulacyjne tylko raz na końcu trzech godzinnego uruchomienia. Użyj 800 mikrolitrów zebranej próbki do analizy qRT-PCR, a pozostałe 200 mikrolitrów do tytulacji wirusowej. Nag

evaluating-effect-coated-filters-pre-filters-on-infectivity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena wpływu pokrytych filtrów i filtrów wstępnych na zakaźność i stężenie zaerozolizowanego wirusa Phi6

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Anion Exchange Resin–Based Detection of Viruses from Bioaerosols

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Mycie rąk jest powszechnie zalecane, aby zapobiec przenoszeniu chorób zakaźnych. Jednak niewiele jest dowodów na to, które metody mycia rąk są najskuteczniejsze w usuwaniu patogenów chorób zakaźnych. Opracowaliśmy metodę oceny skuteczności metod mycia rąk w usuwaniu mikroorganizmów.

Metoda badania skuteczności mycia rąk w usuwaniu pojawiających się zakaźnych patogenów

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzania przenośnych ekspozycji aerozoli komórkowych i mierzenia odpowiedzi komórkowej. W metodzie wykorzystuje się komórki hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, naśladując fizjologię in vivo. Odpowiedź komórkową na aerozole z nanocząstek miedzi obserwowano jako stres oksydacyjny poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i cytotoksyczność jako uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej.

Nowa przenośna kaseta do naświetlania in vitro do pobierania próbek aerozoli

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Zgłoszono tutaj protokół do ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa za pomocą monitorowania w czasie rzeczywistym impedancji elektrycznej zainfekowanych komórek. Praktyczne zastosowanie tej metody przedstawiono poprzez ilościowe określenie rozpadu wirusa grypy A przy różnych parametrach fizykochemicznych naśladujących warunki środowiskowe.

Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy protokół pakowania pseudowirusów i pomiaru aktywności neutralizującej przeciwciała.

Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

W odpowiedzi na pandemię koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), opracowano protokół laboratoryjny w celu przetestowania skuteczności dezynfekcji wirusowej za pomocą prania gorącą wodą osłon twarzy, bawełnianych fartuchów i spodni dżinsowych. Wirus Phi6 (bakteriofag) został wykorzystany jako organizm do zbadania skuteczności dezynfekcji.

Określanie skuteczności dezynfekcji wirusowej podczas prania gorącą wodą

Poznaj metodę oceny powłok antywirusowych z miedzi i srebra na filtrach powietrza przy użyciu komory aerozolowej i bakteriofaga Phi6. Badanie pomaga rozwijać skuteczniejsze technologie filtracji powietrza w pomieszczeniach zamkniętych.

Ocena wpływu pokrytych filtrów i filtrów wstępnych na zakaźność i stężenie aerozolu zawierającego wirusa Phi6

Przeglądaj więcej filmów