Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans
29 maja 2026
Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.
Wykorzystujemy endogenne znakowanie oparte na systemie CRISPR do badania lokalizacji i dynamiki białek linii zarodkowej u C.elegans. Konwencjonalne transgeny mogą wpływać na ekspresję w linii zarodkowej, natomiast niniejszy protokół umożliwia znakowanie białek w locus endogennym pod kontrolą natywną. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować geny kandydackie o dominującej ekspresji w gonadach lub komórkach zarodkowych, korzystając z publicznych baz danych oraz opublikowanej literatury.
Po otwarciu wpisu w bazie UniProt dla docelowego białka, kliknij Structure, aby ocenić cechy strukturalne oraz domeny białkowe i zidentyfikować odpowiednie miejsce do znakowania fluorescencyjnego. Przewiń w dół i otwórz wpis w AlphaFold DB, aby zweryfikować wartości ufności modelu. Kliknij Domains, aby zapoznać się ze szczegółowymi klasyfikacjami strukturalnymi.
Następnie otwórz stronę docelowego genu w bazie WormBase. Przewiń w dół i kliknij widżet Sequences, a następnie łącze do transkrypcji pierwotnej, aby otworzyć stronę transkrypcji. Przewiń do sekcji Sequences i kliknij opcję specific, aby wyświetlić sekwencję splicingowaną wybranej transkrypcji.
Na stronie narzędzia IDT CRISPA-Cas9 Guide RNA Design Tool skopiuj i wklej sekwencję pierwszego eksonu genu docelowego ze strony WormBase, a następnie z menu rozwijanego Species wybierz C. elegans w celu zaprojektowania gRNA lub guide RNA. Kliknij przycisk DESIGN, aby uzyskać i przejrzeć najbardziej rekomendowaną sekwencję gRNA oraz odpowiadającą jej sekwencję PAM. W programie SnapGene wybierz Sequence, aby zidentyfikować punkt klonowania pomiędzy promotorem CeU6 a regionami rusztowania gRNA.
Skopiuj sekwencję gRNA ze strony narzędzia IDT, wklej ją w oknie dialogowym wstawiania, a następnie kliknij Insert, aby zintegrować spacer z plazmidem ekspresyjnym CRISPR. Aby potwierdzić poprawność insercji gRNA, zaznacz sekwencję i kliknij Show alignments, aby porównać wynik sekwencjonowania metodą Sangera baza po bazie z oczekiwaną sekwencją. W celu skonstruowania plazmidu donorowego skopiuj genomowe sekwencje ramion homologii z bazy WormBase.
W programie SnapGene wklej sekwencję i kliknij Insert. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w miejscu insercji, aby otworzyć okno Set DNA Color i zmień kolor na pomarańczowy, aby zaznaczyć miejsce złączenia. Skopiuj sekwencję wstawki zielonego białka fluorescencyjnego lub GFP i wklej ją bezpośrednio w zaznaczonej pozycji.
Następnie kliknij Add Feature. Nazwij cechę GFP. Zmień jej kolor wyświetlania na zielony i kliknij OK, aby zakończyć in silico składanie plazmidu donora.
Aby wprowadzić cichą substytucję do matrycy plazmidu donora w celu zapobieżenia ponownemu cięciu przez Cas9 po integracji, skopiuj 19-nukleotydowy spacer gRNA z wektora ekspresyjnego. W zakładce plazmidu donora wklej sekwencję do paska wyszukiwania Find DNA sequence, aby zlokalizować miejsce docelowe, a następnie wybierz konkretną pozycję nukleotydową do zmutowania. W polu Replace base wprowadź nowy nukleotyd i kliknij Insert.
Kliknij prawym przyciskiem myszy zmodyfikowaną zasadę i użyj funkcji Set DNA Color, aby zmienić jej kolor na czerwony. Dopasuj wyniki sekwencjonowania metodą Sangera plazmidu donora do oczekiwanej sekwencji, aby potwierdzić jego integralność. Przygotuj mieszaninę do iniekcji, łącząc plazmid ekspresyjny CRISPR, plazmid donora oraz markery współiniekcyjne w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej do końcowej objętości 10 µL w podanym stężeniu.
Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 10 000 g przez 10 do 20 minut, aby wytrącić materiał cząsteczkowy w formie osadu i zapobiec zapychaniu kapilary do mikroiniekcji. Użyj wyciągarki do igieł, aby wykonać igły do mikroiniekcji z kapilar szklanych o długim zwężeniu i ostrym czubku, odpowiednie do iniekcji w gonady, optymalizując empirycznie ustawienia biegunowe. Podgrzej pipetę mikrokapilarną i przełam ją na dwie części, aby stworzyć narzędzie do napełniania.
Do szerokiego końca skróconej pipety mikrokapilarnej przymocuj gumową gruszkę aspiracyjną. Odessij około 1 µL mieszaniny do wstrzyknięcia do ładowarki. Wsuń ładowarkę w tylny koniec igły do wstrzykiwania i delikatnie podaj mieszaninę do wstrzyknięcia.
Umieść napełnioną igłę w pozycji poziomej na 10 minut, aby utworzyła się ciągła kolumna i roztwór osiadł w stronę czubka. Zamocuj igłę w mikroskopie do iniekcji i ustaw ostrość na czubek, korzystając z optyki pola jasnego. Otwórz czubek igły poprzez delikatny kontakt z krawędzią szkiełka nakrywkowego w oleju halokarbonowym i zweryfikuj przepływ.
Aby hodować nicienie do wstrzyknięcia, utrzymuj nicienie typu dzikiego N2 na płytkach z pożywką wysianą bakteriami OP50. Wybierz hermafrodyty w stadium L4 z prawidłowo rosnącej kultury i inkubuj w temperaturze 20°C przez 10 godzin, aby uzyskać młode dorosłe osobniki z dobrze rozwiniętą linią zarodkową. Przenieś nicienie na niezasianą płytkę, aby ograniczyć przenoszenie bakterii.
Przygotuj suchą podkładkę z 2% agarozy na szkiełku przedmiotowym. Następnie nanieś kroplę oleju halowęglowego. Używając pęsety do rzęs, przenieś nicienia na podkładkę z agarozy i unieruchom go.
Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby ustawić gonadę do wstrzyknięcia. Za pomocą sterowników mikromanipulatora ustaw igłę pod kątem od 20 do 40 stopni względem nicienia. Użyj dużego powiększenia, aby ustawić ostrość na dystalną część linii zarodkowej.
Przesuń nicienia na igłę i umieść jej końcówkę w obrębie syncytium gonadalnego. Wstrzykuj roztwór, aż gonad spuchnie. Wyjmij igłę i zmień jej położenie przed kolejnymi iniekcjami.
Dodaj bufor M9, aby zmiękczyć i częściowo rozbić żel agarozy w celu uwolnienia nicieni. Przenieś każdego nicienia na oddzielną płytkę regeneracyjną. Następnie powtórz iniekcje dla 20 do 25 nicieni.
Przeprowadź screening potomstwa F1 w celu wykrycia markerów ko-iniekcyjnych i wyselekcjonuj zwierzęta dodatnie pod względem markerów. Przenieś każdego nicienia F1 na oddzielną płytkę i odczekaj od jednego do dwóch dni na zniesienie jaj. Zlizuj każdego nicienia F1 w buforze z proteinazą K, aby przygotować matryce do PCR.
Przeprowadź PCR złączeniowy (junction PCR), używając jednego primera genomicznego poza ramieniem homologii oraz jednego wewnętrznego primera tagu. Zachowaj odpowiadające im płytki z osobnikami F1, u których wynik PCR był dodatni. Wyizoluj potomstwo F2 z dodatnich linii F1 na oddzielne płytki w celu uzyskania kolejnych pokoleń.
Poddaj osobniki dorosłe lizie w celu genotypowania. Przeprowadź reakcję PCR z użyciem starterów flankujących ramiona homologii, aby rozróżnić allele typu dzikiego oraz knock-in na podstawie wielkości produktów. Użyj narzędzia SnapGene, aby zweryfikować i potwierdzić prawidłową integrację na obu złączach insercyjnych (lewym i prawym), dopasowując wyniki sekwencjonowania metodą Sangera do oczekiwanej zmodyfikowanej sekwencji genomowej.
Użyj mikroskopii fluorescencyjnej w celu weryfikacji ekspresji i lokalizacji w linii zarodkowej. Rozszerz potwierdzone linie homozygotyczne. Prowadź hodowle i kriokonserwuj zwalidowane linie w celu długoterminowego przechowywania.
Przesiewowe badanie potomstwa F1 metodą PCR wykazało udane wprowadzenia genów (knock-ins), zidentyfikowane na podstawie amplikonu PCR złącza o długości 1 550 par zasad, uzyskanego przy użyciu jednego flankującego startera genomowego i jednego wewnętrznego startera GFP. Brak prążka o długości 1 550 par zasad u większości zwierząt F1 wskazywał na brak wykrywalnej integracji z celem, co jest spójne z nieintegracyjnym przekazywaniem DNA, a nie z naprawą sterowaną homologią. Określanie zygotyczności w potomstwie F2 pochodzącym z linii pozytywnych pod względem PCR złącza pozwala rozróżnić allele na podstawie wielkości prążka: 1 345 par zasad dla allelu typu dzikiego oraz 2 344 pary zasad dla allelu knock-in.
Heterozygoty wykazują oba prążki. Próbki homozygotyczne typu knock-in nie posiadają prążka o rozmiarze typu dzikiego, natomiast próbki z nieudaną integracją wykazują jedynie produkt o rozmiarze typu dzikiego. Dodatkowa walidacja homozygotycznej linii GFP knock-in została przeprowadzona z wykorzystaniem obrazowania mikroskopem konfokalnym, podczas którego zaobserwowano fluorescencję GFP w komórkach linii zarodkowej z sygnałem wzbogaconym w region spermatogeniczny.
Niniejszy protokół umożliwia analizę in vivo lokalizacji i dynamiki białek w linii zarodkowej C.elegans. Staranne zaprojektowanie znacznika oraz dokładna walidacja są niezbędne, aby zachować funkcję białka i zminimalizować liczbę fałszywie dodatnich kandydatów. W przyszłych badaniach ten schemat postępowania może zostać wykorzystany do śledzenia lokalizacji białek oraz badania potencjalnych oddziaływań podczas rozwoju linii zarodkowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia praktyczny schemat postępowania oparty na systemie CRISPR/Cas9 w celu fluorescencyjnego znakowania endogennych białek w linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Protokół ten umożliwia uzyskanie stabilnych alleli typu knock-in, które precyzyjnie wskazują lokalizację białek pod natywną kontrolą regulacyjną, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych metod wprowadzania transgenów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia rozwoju
- Biologia molekularna
Wstęp
- Lokalizacja białek jest kluczowa dla zrozumienia funkcji genów podczas gametogenezy u C. elegans.
- Konwencjonalne metody wprowadzania transgenów często prowadzą do zmiennej ekspresji oraz wyciszania w linii zarodkowej.
- Oznaczanie endogenne zapewnia bardziej wiarygodne i fizjologicznie istotne wzorce ekspresji.
- Edycja genomu CRISPR/Cas9 umożliwia precyzyjne wstawienie znaczników fluorescencyjnych w natywnych loci.
Cel badania
- Opisanie powtarzalnego schematu postępowania w celu generowania białek endogennych znakowanych fluorescencyjnie w linii zarodkowej C. elegans.
- Umożliwienie otrzymania stabilnych, homozygotycznych szczepów z wbudowanym genem (knock-in) do analiz rozwojowych i biologii komórki.
- Dostarczenie szeroko stosowalnego protokołu dla genów wykazujących ekspresję wzbogaconą w linii zarodkowej.
Zastosowane metody
- Wybór odpowiedniej strategii znakowania białka docelowego.
- Wprowadzenie odczynników CRISPR/Cas9 poprzez mikrowstrzykiwanie do gonad u młodych dorosłych hermafrodytów.
- Genotypowanie metodą PCR w dwóch pokoleniach w celu identyfikacji i izolacji homozygotycznych osobników knock-in.
- Mikroskopia konfokalna w celu weryfikacji fluorescencji linii zarodkowej i oceny subkomórkowej lokalizacji białka in vivo.
Główne wyniki
- Opracowanie schematu postępowania dla efektywnego generowania endogennych białek znakowanych fluorescencyjnie u C. elegans.
- Wytworzenie stabilnych alleli typu knock-in, raportujących rozmieszczenie białka pod kontrolą natywnej regulacji.
- Możliwość wiarygodnej izolacji i weryfikacji homozygotycznych szczepów znakowanych.
- Obrazowanie konfokalne potwierdza dokładną lokalizację subkomórkową znakowanych białek w linii zarodkowej.
Wnioski
- Opisany protokół CRISPR/Cas9 jest skuteczny i szeroko stosowalny do znakowania białek w linii zarodkowej C. elegans.
- Przełamuje on ograniczenia tradycyjnych metod wprowadzania transgenów, zapewniając stabilną i fizjologicznie istotną ekspresję.
- Niniejszy schemat postępowania ułatwia badania rozwojowe i biologię komórki, umożliwiając precyzyjną analizę lokalizacji białek in vivo.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wewnętrzne znakowanie fluorescencyjne z wykorzystaniem CRISPR/Cas9 w genach linii zarodkowej Caenorhabditis elegans rozwiązuje problem zmiennej lub wyciszonej ekspresji transgenów, umożliwiając precyzyjne badania lokalizacji białek pod natywną kontrolą regulacyjną. Niniejszy schemat postępowania zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i wspiera podejmowanie wiarygodnych decyzji na wczesnym etapie odkryć. Podejście to ma szerokie zastosowanie w tworzeniu istotnych fizjologicznie modeli, kluczowych dla badań translacyjnych i rozwoju portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację lokalizacji białek w celu walidacji funkcjonalnej celów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie wzorców ekspresji endogennej.
- Ułatwia badanie funkcji genów podczas gametogenezy w oparciu o postawione hipotezy.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do dalszych badań biologicznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia stabilne i powtarzalne szczepy znakowane do ilościowych analiz obrazowania.
- Standaryzuje systemy biologiczne w celu uzyskania spójnych wyników przesiewowych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę subkomórkowej dystrybucji białek in vivo.
- Wspiera skalowalne przepływy pracy w celu oceny związków w kontekście linii zarodkowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie danych o lokalizacji białek z istotnymi dla choroby procesami rozwojowymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem natywnej regulacji genów.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia artefaktów, które mogłyby zakłócić translacyjne badania biomarkerów.
- Wzmacnia podstawy do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda znakowania za pomocą systemu CRISPR/Cas9 wpisuje się w ciąg procesu badawczego, od wczesnej walidacji celu po badania przedkliniczne, wspierając zarówno studia mechanistyczne, jak i ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków poprzez wizualizację dynamiki białek endogennych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania niezbędne do opracowywania testów.
- Analityka: Zapewnia genotypowanie metodą PCR oraz odczyty z mikroskopii konfokalnej w celu rzetelnego porównania danych.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność fizjologiczną w celu dopasowania biomarkerów i modelowania przedklinicznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwe do ponownego wykorzystania szczepy znakowane dla bieżących i przyszłych inicjatyw B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy i zwiększa powtarzalność w różnych zespołach badawczych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez minimalizację ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zwalidowanych celów.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w edycji genomu CRISPR/Cas9 oraz technikach mikroiniekcji.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii konfokalnej oraz infrastruktury do genotypowania opartego na PCR.
- Konieczna jest standaryzacja strategii znakowania i protokołów przesiewowych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w przypadku różnych genów endogennych, w tym tych wzbogaconych w linii zarodkowej, u C. elegans.
- Skuteczność zależy od stabilnego odzyskiwania i przesiewania edytowanych alleli w kolejnych pokoleniach.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Germline Target Gene Selection and CRISPR Component Design in Caenorhabditis elegans
3:53
Preparing the Needle for the Gonadal Microinjection
5:30
Preparing the Worms for Injection
6:01
Performing the Gonadal Microinjection
7:07
Screening F1 and F2 Progeny
8:34
Results
10:04
Conclusion
