Name: Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania białek w linii komórek germinalnych Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia precyzyjną analizę lokalizacji białek pod kontrolą natywnej regulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2023YFA1801100 dla L.M.), Narodowego Funduszu Nauk Przyrodniczych Chin (32400698 dla P.W., 32270774 dla L.M.).

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem Caenorhabditis elegans były prowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i wykorzystania organizmów laboratoryjnych na Uniwersytecie Normalnym w Pekinie.
<img alt="Schemat procesu CRISPR/Cas9 u C. elegans: edycja genów, mikroiniekcja, walidacja sekwencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70879/70879fig1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd endogennego znakowania fluorescencyjnego za pomocą CRISPR/Cas9 u C. elegans. Schematyczny przebieg procesu ilustrujący główne etapy generowania i walidacji endogennego wstawienia (knock-in) znacznika fluorescencyjnego. Na etapie projektowania i konstrukcji wybierany jest gen docelowy oraz miejsce insercji wzbogacone w linii zarodkowej, pDD162 służy jako plazmid CRISPR/Cas9 do ekspresji Cas9 i gRNA, a pPD95.75 jako szkielet donora, do którego subklonowany jest znacznik fluorescencyjny (np. GFP) oraz lewe i prawe ramiona homologii. Na etapie mikroiniekcji mieszanina wtryskowa CRISPR/Cas9 (zawierająca plazmid gRNA/Cas9, matrycę donora i markery współiniekcyjne) jest podawana do gonad młodych dorosłych hermafrodyt, po czym następuje rekonwalescencja na wysianych płytkach. Na etapie walidacji potomstwo pozytywne pod kątem markerów jest wybierane do dalszego genotypowania, w tym identyfikacji zdarzeń knock-in metodą PCR oraz potwierdzenia sekwencjonowaniem DNA; linie z sukcesywnie wykonanym knock-in są następnie badane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny ekspresji w linii zarodkowej i lokalizacji subkomórkowej znakowanego białka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70879/70879fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
1. Wybór genu docelowego wzbogaconego w linii zarodkowej
<ol>
	<li>Zidentyfikuj geny kandydackie wykazujące dominującą ekspresję w gonadach lub komórkach zarodkowych, korzystając z publicznych baz danych oraz opublikowanej literatury.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie miejsce wprowadzenia znacznika w oparciu o cechy białka. Zapisz wybraną izoformę oraz pozycję insercji znacznika do późniejszego projektu gRNA i matrycy donora (Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Projektowanie gRNA i matrycy donorowej
<ol>
	<li>Zidentyfikuj 20 nt sekwencję przewodniego RNA (gRNA) powyżej motywu PAM (protospacer adjacent motif; NGG), który jest niezbędny do rozpoznania przez Cas9, i umieść ją jak najbliżej zamierzonego miejsca wstawienia znacznika.</li>
	<li>Oceń potencjalne gRNA za pomocą narzędzia do projektowania online (np. narzędzia IDT CRISPR design tool) z wybranym genomem C. elegans. Wybierz przewodnik o wysokiej przewidywanej wydajności cięcia docelowego i braku wysokoryzykownych przewidywanych miejsc off-target.</li>
	<li>Sklonuj sekwencję gRNA w regionie pomiędzy promotorem U6 a rusztowaniem gRNA w obrębie plazmidowego wektora ekspresyjnego CRISPR. 
	UWAGA: Zaprojektuj primery zawierające sekwencję gRNA jako nawisy. Przeprowadź amplifikację PCR, a następnie montaż oparty na rekombinacji homologicznej – metodę klonowania niezależnego od ligacji, która eliminuje trawienie enzymami restrykcyjnymi i umożliwia jednokrokowy klonowanie bezpośrednio do wektora ekspresyjnego15.</li>
	<li>Potwierdź poprawność wstawienia sekwencji za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera.</li>
	<li>Zbuduj plazmid donorowy, wykorzystując znacznik fluorescencyjny flankowany przez lewe i prawe ramiona homologii o długości około 1 000 bp każde, pochodzące z locus docelowego. 
	UWAGA: Amplifikuj ramiona homologii z genomicznego DNA szczepu N2 przygotowanego jako lizat nicieni przy użyciu trawienia proteinazą K. Zaprojektuj primery z 15–20 bp nakładkami na zlinearyzowany wektor i znacznik fluorescencyjny. Zmontuj ramiona homologii i znacznik w szkielecie wektora via rekombinację homologiczną w jednej reakcji. Wstaw znacznik fluorescencyjny bezpośrednio po kodonie startowym ATG dla znakowania N-końcowego lub przed kodonem stop dla znakowania C-końcowego. Uwzględnij sekwencję łącznika (linkera) pomiędzy genem docelowym a znacznikiem fluorescencyjnym, aby zachować prawidłowe fałdowanie i funkcję białka. Użyj łącznika w celu zmniejszenia zawady sterycznej pomiędzy partnerami fuzji i upewnij się, że zarówno łącznik, jak i znacznik są wstawione w ramce odczytu sekwencji kodującej. Starannie wybierz miejsce wstawienia, aby uniknąć zaburzenia znanych lub przewidywanych domen funkcjonalnych, peptydów sygnałowych lub regionów transbłonowych (Supplementary File 1).</li>
	<li>Wprowadź substytucje ciche do sekwencji matrycy homologicznej donora, aby uszkodzić PAM lub sekwencję wiązania przewodnika bez zmiany sekwencji białka, co zapobiegnie ponownemu cięciu przez Cas9 po integracji. 
	UWAGA: Wprowadź synonimiczne mutacje punktowe do primerów używanych do amplifikacji ramion homologii, celując w kodony w obrębie regionu PAM.</li>
	<li>Potwierdź integralność sekwencji donora w obu ramionach homologii i w miejscach łączenia ze znacznikiem za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera. 
	UWAGA: Przechowuj zweryfikowane plazmidy w temperaturze −20 °C w przypadku przechowywania krótkoterminowego lub −80 °C w przypadku przechowywania długoterminowego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mieszaniny do iniekcji
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę do iniekcji, łącząc plazmid ekspresyjny CRISPR, plazmid donora (skonstruowany na podstawie pPD95.75) oraz markery współiniekcyjne w sterylnym ddH₂O do końcowej objętości 10 µL, zachowując stężenia wymienione w Tabeli 1. 
	UWAGA: Stężenia należy optymalizować empirycznie, aby zrównoważyć czytelność markerów, odzysk kandydatów oraz przeżywalność po iniekcji.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę do iniekcji przy 10 000 × g przez 10–20 min w celu osadzenia materiału cząsteczkowego i zapobiegania zapychaniu się kapilary do mikroiniekcji.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Komponent</td>
			<td >Funkcja</td>
			<td >Stężenie robocze (ng/μL)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >pDD162</td>
			<td >Plazmid CRISPR/Cas9 (ekspresja Cas9 i gRNA)</td>
			<td >50-100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Plazmid donorowy (szkielet pPD95.75)</td>
			<td >Matryca donorowa HDR zawierająca znacznik fluorescencyjny flankowany ramionami homologii o długości ~1 kb</td>
			<td >50-100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >pRF4</td>
			<td >Marker ko-iniekcji (fenotyp Roller)</td>
			<td >50-100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >pPD122.11</td>
			<td >Marker ko-iniekcji (ekspresja GFP)</td>
			<td >5-10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Sterylna ddH2O</td>
			<td >Uzupełnienie do objętości końcowej</td>
			<td >–</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład mieszaniny do iniekcji i funkcje plazmidów.Mieszanina do iniekcji zawiera plazmid ekspresyjny CRISPR, plazmid donorowy, pRF4 oraz pPD122.11 w indicated stężeniach, przy całkowitej objętości 10 µL.
4. Napełnianie i przygotowanie igły do iniekcji
<ol>
	<li>Wytwarzaj igły do mikroiniekcji z kapilar szklanych, używając wyciągacza do igieł skonfigurowanego tak, aby uzyskać długi stożek z ostrym końcem odpowiednim do iniekcji w gonady. 
	UWAGA: Parametry wyciągacza należy zoptymalizować empirycznie. Przykładowe parametry początkowe: heat = 540, pull = 20, velocity = 100. 
	OSTROŻNIE: Należy ostrożnie obchodzić się z wyciągniętymi igłami, aby uniknąć obrażeń wskutek nakłucia. Do manipulowania igłami należy używać pęsety, a zużyte igły utylizować w pojemniku na odpady ostre.</li>
	<li>Podgrzej pipetę mikrokapilarną i przełam ją na dwa kawałki, aby stworzyć narzędzie do ładowania. 
	UWAGA: Jako alternatywę można zastosować komercyjne końcówki do ładowania.</li>
	<li>Do szerokiego końca skróconej pipety mikrokapilarnej przymocuj gumową gruszkę aspiracyjną.</li>
	<li>Naciągnij do ładowarki około 1 µL klarownego supernatantu mieszaniny do iniekcji. 
	UWAGA: Dokładna objętość nie jest krytyczna. Należy upewnić się, że roztwór wypełnia końcówkę igły.</li>
	<li>Wprowadź ładowarkę do tylnego końca igły iniekcyjnej i delikatnie podaj mieszaninę do iniekcji.</li>
	<li>Umieść załadowaną igłę poziomo na 10 min, aby roztwór osiadł w stronę końcówki i potwierdzić obecność ciągłej kolumny cieczy.</li>
	<li>Zamocuj igłę w mikroskopie do iniekcji i ustaw końcówkę w ognisku, korzystając z optyki w jasnym polu.</li>
	<li>Otwórz końcówkę igły, delikatnie dotykając jej krawędzią szkiełka nakrywkowego w oleju halokarbonowym, a następnie sprawdź przepływ. 
	UWAGA: Dostosuj ciśnienie iniekcji (30–80 psi) tak, aby w ciągu 1 s16 wytworzyć pęcherzyk o średnicy w przybliżeniu równej średnicy gonady.</li>
</ol>
5. Przygotowanie nicieni do wstrzykiwania
UWAGA: Przygotować płytki z podłożem do wzrostu nicieni (NGM) oraz bufor M9 zgodnie z wcześniejszym opisem17. Hodować nicienie na płytkach zaszczepionych szczepem Escherichia coli OP50 (dalej określanym jako OP50) i wykonywać iniekcje w linii N2.
<ol>
	<li>Wybierz hermafrodyty w stadium L4 z wyprawionej płytki i inkubuj w temperaturze 20 °C przez 10 h, aby uzyskać młode dorosłe osobniki z dobrze rozwiniętą linią zarodkową.</li>
	<li>Przenieś nicienie na pustą płytkę, aby ograniczyć przenoszenie bakterii.</li>
	<li>Przygotuj suchą podkładkę z 2% agarozy na szkiełku przedmiotowym i nanieś kroplę oleju halokarbonowego.</li>
	<li>Przenieś nicienia na podkładkę agarową za pomocą pędzelka z rzęsy.</li>
	<li>Unieruchom nicienia i ustaw gonadę w pozycji odpowiedniej do wstrzyknięcia. 
	OSTRZEŻENIE: Iniekcje należy przeprowadzić w ciągu 20–30 min, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
</ol>
6. Wykonaj mikroiniekcję gonadalną
<img alt="Schemat C. elegans pokazujący region linii zarodkowej z zaznaczonymi sekcjami, badania mikroskopowe w genetyce." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70879/70879fig2.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Lokalizacja dystalnego syncytium gonady dla mikroiniekcji u młodych dorosłych C. elegans hermafrodytów. (A) Obraz w jasnym polu przy niskim powiększeniu zamontowanego młodej dorosłego hermafrodyty. Widoczne są oba ramiona gonady; dla jednego ramienia zaznaczono miejsce iniekcji (strzałka) jako przykład reprezentatywny. Obszar w ramce oznacza obszar pokazany przy większym powiększeniu na panelu B. (B) Widok w DIC przy większym powiększeniu dystalnej gonady odpowiadający obszarowi w ramce na panelu A. Strzałka wskazuje pozycję iniekcji w obrębie dystalnego syncytium gonady, gdzie podawana jest mieszanina iniekcyjna. Paski skali: 100 µm (A) i 20 µm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70879/70879fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Zlokalizuj unieruchomionego nicienia i zidentyfikuj gonadę, korzystając z obiektywu o niskim powiększeniu.</li>
	<li>Ustaw igłę za pomocą sterowników mikromanipulatora.</li>
	<li>Uorientuj nicienia pod kątem 20–40° względem igły.</li>
	<li>Ustaw ostrość na dystalną część linii zarodkowej, korzystając z większego powiększenia.</li>
	<li>Przesuń nicienia w stronę igły i umieść jej końcówkę w obrębie syncytium gonadalnego (Rysunek 2).</li>
	<li>Wstrzyknij roztwór i potwierdź podanie preparatu poprzez widoczne obrzęknięcie gonady. 
	UWAGA: Zoptymalizuj ciśnienie wtrysku (30–80 psi), ciśnienie kompensacyjne (0,1–0,5 psi) oraz czas trwania wtrysku (0,1–0,3 s). 
	OSTROŻEŻNIE: Nadmierne ciśnienie lub objętość mogą spowodować rozerwanie organizmu nicienia.</li>
	<li>Wycofaj igłę i ustaw ją ponownie do kolejnych wtrysków. 
	UWAGA: Wykonaj wtrysk jednostronny, aby zmaksymalizować przeżywalność, lub wtrysk obustronny, aby zwiększyć wydajność edycji.</li>
	<li>Dodaj bufor M9, aby uwolnić nicienie, a następnie przenieś każdego z nich na oddzielną płytkę regeneracyjną.</li>
	<li>Powtórz wtryski dla 20–25 nicieni. 
	UWAGA: Wymień igłę, jeśli ulegnie zapchaniu lub uszkodzeniu.</li>
	<li>Inkubuj wstrzyknięte nicienie w temperaturze 20 °C przez 2–3 dni w celu regeneracji.</li>
</ol>
7. Przesiewanie kandydatów F1 w celu zidentyfikowania linii z pozytywnym knock-in
<ol>
	<li>Przesiewowo sprawdź potomstwo F1 pod kątem markerów współwstrzyknięcia i wybierz zwierzęta wykazujące obecność markerów. 
	UWAGA: Przykłady alternatywnych fluorescencyjnych markerów współwstrzyknięcia o różnej specyficzności tkankowej i właściwościach widmowych znajdują się w Uzupełniającej tabeli 1. 
	UWAGA: W celu zwiększenia niezawodności wybierz zwierzęta wykazujące oba markery. Priorytetowo traktuj lęgi o wysokiej częstotliwości występowania markerów („lęgi jackpot”).</li>
	<li>Przenieś każdego nicienia F1 na oddzielną płytkę i pozwól na składanie jaj przez 1–2 dni.</li>
	<li>Zlizuj każdego nicienia F1 w buforze z proteinazą K, aby przygotować matryce do PCR. 
	UWAGA: Jeśli lizaty nie zostaną przetworzone natychmiast, przechowuj je w temperaturze −80 °C.</li>
	<li>Przeprowadź PCR złączeniowy (junction PCR), używając jednego primera genomicznego poza ramieniem homologii oraz jednego wewnętrznego primera znacznika. 
	UWAGA: Zachowaj odpowiednie płytki od zwierząt F1, które dały wynik dodatni w teście PCR.</li>
</ol>
8. Przesiewanie potomstwa F2 w celu wyizolowania homozygotycznych linii knock-in i potwierdzenia integracji
<ol>
	<li>Wyizoluj potomstwo F2 z linii F1 pozytywnych w testach PCR na oddzielne płytki.</li>
	<li>Pozwól nicieniom F2 na wyprodukowanie potomstwa, a następnie poddaj dorosłe osobniki lizie w celu genotypowania. 
	UWAGA: W razie potrzeby przechowuj lizaty w temperaturze −20 °C.</li>
	<li>Przeprowadź PCR z użyciem starterów flankujących ramiona homologii, aby odróżnić allele typu dzikiego od alleli knock-in na podstawie wielkości produktu.</li>
	<li>Potwierdź prawidłową integrację za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera na obu złączach insercyjnych.</li>
	<li>Zweryfikuj ekspresję i lokalizację fluorescencji w linii zarodkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Rozmnażaj potwierdzone linie homozygotyczne i prowadź ich zasoby. 
	UWAGA: Zwalidowane linie poddaj krio konserwacji w celu długoterminowego przechowywania.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+a+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).</li><li>Ebbing, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns.">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+architecture+of+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans+germ+cells.">Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells.</a> Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Fire, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+silencing+and+the+maintenance+of+a+functional+germline+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).</li><li>Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+RNAi+factors+protect+the+C.+elegans+germline+against+repetitive+sequences.">Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences.</a> Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).</li><li>Merritt, C., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+solutions+for+the+germline.">Transgenic solutions for the germline.</a> WormBook. , 1-21 (2010).</li><li>Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li><li>Vallin, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+collection+of+Mos1+transposon+insertion+mutants+for+the+C.+elegans+research+community.">A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community.</a> PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Nance, J., Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+transgenic+toolbox.">The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox.</a> Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+to+study+spermatogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).</li><li>Khan, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+ligation-independent+cloning+system+for+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+plants.">A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants.</a> Plant Methods. 13, 86 (2017).</li><li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).</li><li>Rieckher, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+microinjection.">Caenorhabditis elegans microinjection.</a> Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).</li><li>Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+substitutions+effectively+block+Cas9+and+allow+for+scarless+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Sci Rep. 6, 20889 (2016).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NATF+(native+and+tissue-specific+fluorescence):+a+strategy+for+bright,+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. 121-122, 86-93 (2017).</li></ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.

Ten przepływ pracy jest zaprojektowany, aby wygenerować stabilne, homozygotyczne linie knock-in, w których etykieta fluorescencyjna jest wstawiana w endogennym locus, aby zgłaszać lokalizację białka pod natywną kontrolą regulacyjną5,6,7,8,9,10. W praktyce, sukces jest najlepiej oceniany poprzez sekwencyjny łańcuch walidacji n...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrze ugruntowanym modelem do badań nad rozwojem rozrodczym i gametogenezą, ze względu na krótki cykl życia, przezroczyste ciało i wysoką łatwość manipulacji genetycznych1. C. elegans istnieje głównie jako samorodka hermafrodytyczny, którego gonada najpierw przechodzi spermatogenezę, a następnie przełącza się na oogenezę. Ten tryb rozmnażania upraszcza utrzymanie szczepów i ułatwia uzyskanie homozygotycznych linii2. Ostatnie badania transkryptomiczne przestrzenne znacznie rozszerzyły listę genów bogaty w gonadzie i ujawniły wyraźne seksowo specyficzne wzorce ekspresji w całym układzie rozrodczym C. elegans3. Bardziej niedawno, sekwencjonowanie RNA z pojedynczych komórek umożliwiło rekonstrukcję trajektorii rozwojowych komórek germinalnych i wywnioskowanie sieci regulacji genów rządzących spermatogenezą4. Razem, te zbiory danych generują bogate listy kandydatów, ale interpretacja funkcjonalna często wymaga obserwacji zachowania białek in vivo—konkretnie, określenia, kiedy i gdzie lokalizują się odpowiednie białka i jak ich wzorce zmieniają się w trakcie rozwoju linii germinalnej.
Konwencjonalna transgeneza w C. elegans często opiera się na mikroiniekcji gonadowej DNA plazmidowego, która łatwo generuje wielokopiane pozachromosomowe skupienia5. Jednakże w linii germinalnej, te skupienia są często mocno wyciszone, co jest uważane za mechanizm pomagający utrzymać integralność linii germinalnej poprzez ograniczenie ekspresji z DNA powtarzającego się, zachowując w ten sposób funkcję linii germinalnej i stabilność informacji genetycznej przez pokolenia6,7. W rezultacie, konstrukty ekspresji transgenów, które są łatwo ekspresowane w tkankach somatycznych, mogą być słabe lub niekonsekwentne w linii germinalnej. Nawet gdy ekspresja jest wykrywalna, efekty liczby kopii i skonstruowane elementy regulacyjne mogą przesunąć dawkowanie i czas białka, potencjalnie komplikując wnioski o natywnej lokalizacji i dynamice. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, bombardowanie mikroczęściami i Mos1-pośredniczona Jednokopijna Wstawianie (MosSCI) są szeroko stosowane do generowania zintegrowanych linii transgennych o niskiej/jednokopiowej ekspresji8,9,10. Te podejścia mogą poprawić ekspresję w linii germinalnej, ale różnią się pod względem kosztów, wydajności i tego, jak dobrze odtwarzają endogenną regulację. Edycja genomu CRISPR/Cas9 oferuje bardziej bezpośrednią drogę poprzez wstawienie fluoryzującego znacznika w miejsce endogennego poprzez naprawę kierowaną homologią, generując stabilne allele knock-in, które raportują lokalizację i dynamikę białka pod natywną kontrolą regulacji11,12,13,14.
Tutaj opisano praktyczny przepływ pracy dla CRISPR/Cas9-pośredniczonego endogennego fluoryzującego znacznikowania w C. elegans, zastosowany do genów wybranych na podstawie zgłoszonych wzorców ekspresji bogaty w linię germinalną. Protokół opisuje selekcję docelów, projektowanie szablonu donora i RNA przewodniczącego, mikroiniekcję gonadalną i przesiewowe badania poniżej w celu izolowaniu homozygotycznych linii knock-in, po których następuje walidacja za pomocą genotypowania. To podejście jest szeroko stosowane do genów ekspresowanych w linii germinalnej na różnych etapach rozwojowych i umożliwia ilościowe analizy lokalizacji i dynamiki białka in vivo. Ten przepływ pracy zapewnia praktyczną strategię do znacznikowania genów ekspresowanych w linii germinalnej i do analizy lokalizacji i dynamiki białka in vivo pod natywną kontrolą regulacji.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Beijing Lablead Biotech Co., Ltd.</td><td>QZ02</td><td>Składnik do przygotowania płytek agar NGM</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>NOVON</td><td>ZZ14011</td><td>Przygotowanie 2% podkładek agarozy</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans szczep N2&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Szczep tła do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Centryfuga</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td>Wyjaśnienie mieszanki do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Beijing Chemical Reagents Company</td><td>57-88-5</td><td>Składnik do przygotowania płytek agar NGM</td></tr><tr><td>Plazmid markera współwstrzykiwania rol-6 (su1006) (pRF4)</td><td>Guangshuo Ou Lab</td><td></td><td>Marker toczenia do wzbogacania kandydatów</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>ZEISS</td><td>LSM880 + Airyscan</td><td>Walidowanie ekspresji/lokalizacji GFP</td></tr><tr><td>Di-Potasowy wodorowfosforan (K2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7758-11-4</td><td>Składnik do przygotowania płytek agar NGM</td></tr><tr><td>Di-Sodowy wodorowfosforan (Na2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7558-79-4</td><td>Składnik do przygotowania bufora M9</td></tr><tr><td>Ladder DNA</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF288-01</td><td>Odniesienie rozmiarów do żeli agarozy</td></tr><tr><td>Podstawa plazmidu donorskiego (pPD95.75)</td><td>Addgene</td><td>1494</td><td>Podstawa konstrukcji donora HDR</td></tr><tr><td>System elektroforetyczny</td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>112-0630</td><td>Oddzielenie amplikonów PCR na żelach agarozy dla badania złącz i genotypowania zygotyczności</td></tr><tr><td>Szczep Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Źródło pokarmu dla robaków</td></tr><tr><td>Plazmid markera współwstrzykiwania fluorescencyjnego (pPD122.11)</td><td>Fire Lab</td><td></td><td>Fluorescencyjny współmarker GFP do wzbogacania kandydatów</td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny</td><td>SOPTOP</td><td>SZX12-HT</td><td>Selekcja żywych robaków pod kątem fluorescencyjnych markerów współwstrzykiwań</td></tr><tr><td>Barwnik GelRed do żeli kwasów nukleinowych</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF079-plus-01</td><td>Wizualizacja pasm DNA</td></tr><tr><td>Mikrokapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Używane z wciągarką do wytwarzania igieł wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Olej halokarbonowy 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>Zapobieganie wysychaniu podczas wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Wuhan Ruihua Instrument &amp; Equipment Co., Ltd.</td><td>HP400S</td><td>Utrzymywanie robaków w standardowej temperaturze</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7487-88-9</td><td>Składnik do przygotowania płytek agar NGM i bufora M9</td></tr><tr><td>Mikropipety kapilarne</td><td>KIMBLE</td><td>71900-50</td><td>Podgrzane i ścięte, aby stworzyć narzędzie do ładowania</td></tr><tr><td>Jednostka mikroiniekcyjna</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Dostarczanie kontrolowanych impulsów ciśnienia mieszanki wstrzykiwania do dalszej części gonad przez mikroigiełkę wstrzykiwania (uruchamiane pedałem stopy)</td></tr><tr><td>Szklane kryształki do mikroskopu</td><td>Fisherbrand</td><td>12545A 22&times;30-1</td><td>Przygotowanie 2% podkładek agarozy do montażu i unieruchamiania robaków podczas mikroiniekcji; Otwarte końcówki igieł wstrzykiwań na krawędzi szkiełka</td></tr><tr><td>Mikroskop do mikroiniekcji</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer.A1</td><td>Mikroskop do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Wciągarka do igieł</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Model P97</td><td>Wciąganie mikrokapilary do igieł wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Termocykler PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Amplifikowanie PCR</td></tr><tr><td>pDD162 (Peft-3::Cas9 + Empty sgRNA)</td><td>Addgene</td><td>47549</td><td>Ekspresja Cas9 + sgRNA</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Gibco</td><td>308723</td><td>Składnik do przygotowania płytek agar NGM</td></tr><tr><td>Diwodoryfosforan potasu (KH2PO4)&nbsp;</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7778-77-0</td><td>Składnik do przygotowania płytek agar NGM i bufora M9</td></tr><tr><td>Chlorku sodu (NaCl)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7647-14-5</td><td>Składnik do przygotowania płytek agar NGM i bufora M9</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Motic</td><td>K400L</td><td>Zbieranie i montaż robaków na podkładkach agarozy oraz wykonywanie etapów po wstrzyknięciu</td></tr></tbody></table>

endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem crispr/cas9 u caenorhabditis elegans

CRISPR/Cas9-mediated Endogenous Fluorescent Tagging of Germline-specific Genes in Caenorhabditis elegans

Lokalizacja białka w linii zarodkowej Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest kluczowa dla interpretacji funkcji genu podczas gametogenezy, jednak konwencjonalne podejścia transgenne często dają różnorodne ekspresje i mogą być wyciszone w komórkach germinalnych. Przedstawiono tu praktyczne przepływy pracy CRISPR/Cas9 wstawiające fluorescujący tag do endogennego locus, umożliwiające wygenerowanie stabilnych alleli knock-in, które raportują dystrybucję białka pod natywną regulacją. Protokół obejmuje kluczowe etapy procedury: wybór strategii tagowania odpowiedniej dla docelowego białka, dostarczanie reagentów CRISPR przez mikroiniekcję gonadalną do młodych dorosłych hermafrodytów i odzyskiwanie wstrzykniętych zwierząt do przesiewania. Kandydaci do knock-in są identyfikowani poprzez genotypowanie oparte na PCR przez dwie generacje, aby odizolować homozygotyczne robaki i zweryfikować edytowany allel. Wreszcie, mikroskopia konfokalna jest używana do zweryfikowania fluorescencji linii germinalnej i oceny lokalizacji subkomórkowej in vivo. Przepływ pracy jest zaprojektowany tak, aby był powtarzalny i szeroko stosowany dla genów wzbogaconych w linii germinalnej, zapewniając prostą drogę do ustanowienia homozygotycznych szczepów z tagami dla analiz rozwojowych i komórkowych.

Zgodnie z protokołem, młode dorosłe hermafrodyty poddano mikroiniekcji do gonad z wykorzystaniem plazmidu CRISPR/Cas9 (pDD162), plazmidu donora kodującego tag knock-in GFP flankowany ramionami homologii o długości około 1 kb (pPD95.75) oraz markerów współiniekcyjnych (pRF4 i pPD122.11). W качестве reprezentatywnego przykładu wykorzystano gen docelowy wzbogacony w linii zarodkowej, aby wygenerować stabilny, homozygotyczny allel knock-in raportujący lokalizację białka pod natywną kontrolą regulacyjną.
<p class="jove_co...

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Protein localization in the Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is central to interpreting gene function during gametogenesis, yet conventional ...

Wykorzystujemy endogenne znakowanie oparte na systemie CRISPR do badania lokalizacji i dynamiki białek linii zarodkowej u C.elegans. Konwencjonalne transgeny mogą wpływać na ekspresję w linii zarodkowej, natomiast niniejszy protokół umożliwia znakowanie białek w locus endogennym pod kontrolą natywną. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować geny kandydackie o dominującej ekspresji w gonadach lub komórkach zarodkowych, korzystając z publicznych baz danych oraz opublikowanej literatury.Po otwarciu wpisu w bazie UniProt dla docelowego białka, kliknij Structure, aby ocenić cechy strukturalne oraz domeny białkowe i zidentyfikować odpowiednie miejsce do znakowania fluorescencyjnego. Przewiń w dół i otwórz wpis w AlphaFold DB, aby zweryfikować wartości ufności modelu. Kliknij Domains, aby zapoznać się ze szczegółowymi klasyfikacjami strukturalnymi.Następnie otwórz stronę docelowego genu w bazie WormBase. Przewiń w dół i kliknij widżet Sequences, a następnie łącze do transkrypcji pierwotnej, aby otworzyć stronę transkrypcji. Przewiń do sekcji Sequences i kliknij opcję specific, aby wyświetlić sekwencję splicingowaną wybranej transkrypcji.Na stronie narzędzia IDT CRISPA-Cas9 Guide RNA Design Tool skopiuj i wklej sekwencję pierwszego eksonu genu docelowego ze strony WormBase, a następnie z menu rozwijanego Species wybierz C. elegans w celu zaprojektowania gRNA lub guide RNA. Kliknij przycisk DESIGN, aby uzyskać i przejrzeć najbardziej rekomendowaną sekwencję gRNA oraz odpowiadającą jej sekwencję PAM. W programie SnapGene wybierz Sequence, aby zidentyfikować punkt klonowania pomiędzy promotorem CeU6 a regionami rusztowania gRNA.Skopiuj sekwencję gRNA ze strony narzędzia IDT, wklej ją w oknie dialogowym wstawiania, a następnie kliknij Insert, aby zintegrować spacer z plazmidem ekspresyjnym CRISPR. Aby potwierdzić poprawność insercji gRNA, zaznacz sekwencję i kliknij Show alignments, aby porównać wynik sekwencjonowania metodą Sangera baza po bazie z oczekiwaną sekwencją. W celu skonstruowania plazmidu donorowego skopiuj genomowe sekwencje ramion homologii z bazy WormBase.W programie SnapGene wklej sekwencję i kliknij Insert. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w miejscu insercji, aby otworzyć okno Set DNA Color i zmień kolor na pomarańczowy, aby zaznaczyć miejsce złączenia. Skopiuj sekwencję wstawki zielonego białka fluorescencyjnego lub GFP i wklej ją bezpośrednio w zaznaczonej pozycji.Następnie kliknij Add Feature. Nazwij cechę GFP. Zmień jej kolor wyświetlania na zielony i kliknij OK, aby zakończyć in silico składanie plazmidu donora.Aby wprowadzić cichą substytucję do matrycy plazmidu donora w celu zapobieżenia ponownemu cięciu przez Cas9 po integracji, skopiuj 19-nukleotydowy spacer gRNA z wektora ekspresyjnego. W zakładce plazmidu donora wklej sekwencję do paska wyszukiwania Find DNA sequence, aby zlokalizować miejsce docelowe, a następnie wybierz konkretną pozycję nukleotydową do zmutowania. W polu Replace base wprowadź nowy nukleotyd i kliknij Insert.Kliknij prawym przyciskiem myszy zmodyfikowaną zasadę i użyj funkcji Set DNA Color, aby zmienić jej kolor na czerwony. Dopasuj wyniki sekwencjonowania metodą Sangera plazmidu donora do oczekiwanej sekwencji, aby potwierdzić jego integralność. Przygotuj mieszaninę do iniekcji, łącząc plazmid ekspresyjny CRISPR, plazmid donora oraz markery współiniekcyjne w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej do końcowej objętości 10 µL w podanym stężeniu.Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 10 000 g przez 10 do 20 minut, aby wytrącić materiał cząsteczkowy w formie osadu i zapobiec zapychaniu kapilary do mikroiniekcji. Użyj wyciągarki do igieł, aby wykonać igły do mikroiniekcji z kapilar szklanych o długim zwężeniu i ostrym czubku, odpowiednie do iniekcji w gonady, optymalizując empirycznie ustawienia biegunowe. Podgrzej pipetę mikrokapilarną i przełam ją na dwie części, aby stworzyć narzędzie do napełniania.Do szerokiego końca skróconej pipety mikrokapilarnej przymocuj gumową gruszkę aspiracyjną. Odessij około 1 µL mieszaniny do wstrzyknięcia do ładowarki. Wsuń ładowarkę w tylny koniec igły do wstrzykiwania i delikatnie podaj mieszaninę do wstrzyknięcia.Umieść napełnioną igłę w pozycji poziomej na 10 minut, aby utworzyła się ciągła kolumna i roztwór osiadł w stronę czubka. Zamocuj igłę w mikroskopie do iniekcji i ustaw ostrość na czubek, korzystając z optyki pola jasnego. Otwórz czubek igły poprzez delikatny kontakt z krawędzią szkiełka nakrywkowego w oleju halokarbonowym i zweryfikuj przepływ.Aby hodować nicienie do wstrzyknięcia, utrzymuj nicienie typu dzikiego N2 na płytkach z pożywką wysianą bakteriami OP50. Wybierz hermafrodyty w stadium L4 z prawidłowo rosnącej kultury i inkubuj w temperaturze 20°C przez 10 godzin, aby uzyskać młode dorosłe osobniki z dobrze rozwiniętą linią zarodkową. Przenieś nicienie na niezasianą płytkę, aby ograniczyć przenoszenie bakterii.Przygotuj suchą podkładkę z 2% agarozy na szkiełku przedmiotowym. Następnie nanieś kroplę oleju halowęglowego. Używając pęsety do rzęs, przenieś nicienia na podkładkę z agarozy i unieruchom go.Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby ustawić gonadę do wstrzyknięcia. Za pomocą sterowników mikromanipulatora ustaw igłę pod kątem od 20 do 40 stopni względem nicienia. Użyj dużego powiększenia, aby ustawić ostrość na dystalną część linii zarodkowej.Przesuń nicienia na igłę i umieść jej końcówkę w obrębie syncytium gonadalnego. Wstrzykuj roztwór, aż gonad spuchnie. Wyjmij igłę i zmień jej położenie przed kolejnymi iniekcjami.Dodaj bufor M9, aby zmiękczyć i częściowo rozbić żel agarozy w celu uwolnienia nicieni. Przenieś każdego nicienia na oddzielną płytkę regeneracyjną. Następnie powtórz iniekcje dla 20 do 25 nicieni.Przeprowadź screening potomstwa F1 w celu wykrycia markerów ko-iniekcyjnych i wyselekcjonuj zwierzęta dodatnie pod względem markerów. Przenieś każdego nicienia F1 na oddzielną płytkę i odczekaj od jednego do dwóch dni na zniesienie jaj. Zlizuj każdego nicienia F1 w buforze z proteinazą K, aby przygotować matryce do PCR.Przeprowadź PCR złączeniowy (junction PCR), używając jednego primera genomicznego poza ramieniem homologii oraz jednego wewnętrznego primera tagu. Zachowaj odpowiadające im płytki z osobnikami F1, u których wynik PCR był dodatni. Wyizoluj potomstwo F2 z dodatnich linii F1 na oddzielne płytki w celu uzyskania kolejnych pokoleń.Poddaj osobniki dorosłe lizie w celu genotypowania. Przeprowadź reakcję PCR z użyciem starterów flankujących ramiona homologii, aby rozróżnić allele typu dzikiego oraz knock-in na podstawie wielkości produktów. Użyj narzędzia SnapGene, aby zweryfikować i potwierdzić prawidłową integrację na obu złączach insercyjnych (lewym i prawym), dopasowując wyniki sekwencjonowania metodą Sangera do oczekiwanej zmodyfikowanej sekwencji genomowej.Użyj mikroskopii fluorescencyjnej w celu weryfikacji ekspresji i lokalizacji w linii zarodkowej. Rozszerz potwierdzone linie homozygotyczne. Prowadź hodowle i kriokonserwuj zwalidowane linie w celu długoterminowego przechowywania.Przesiewowe badanie potomstwa F1 metodą PCR wykazało udane wprowadzenia genów (knock-ins), zidentyfikowane na podstawie amplikonu PCR złącza o długości 1 550 par zasad, uzyskanego przy użyciu jednego flankującego startera genomowego i jednego wewnętrznego startera GFP. Brak prążka o długości 1 550 par zasad u większości zwierząt F1 wskazywał na brak wykrywalnej integracji z celem, co jest spójne z nieintegracyjnym przekazywaniem DNA, a nie z naprawą sterowaną homologią. Określanie zygotyczności w potomstwie F2 pochodzącym z linii pozytywnych pod względem PCR złącza pozwala rozróżnić allele na podstawie wielkości prążka: 1 345 par zasad dla allelu typu dzikiego oraz 2 344 pary zasad dla allelu knock-in.Heterozygoty wykazują oba prążki. Próbki homozygotyczne typu knock-in nie posiadają prążka o rozmiarze typu dzikiego, natomiast próbki z nieudaną integracją wykazują jedynie produkt o rozmiarze typu dzikiego. Dodatkowa walidacja homozygotycznej linii GFP knock-in została przeprowadzona z wykorzystaniem obrazowania mikroskopem konfokalnym, podczas którego zaobserwowano fluorescencję GFP w komórkach linii zarodkowej z sygnałem wzbogaconym w region spermatogeniczny.Niniejszy protokół umożliwia analizę in vivo lokalizacji i dynamiki białek w linii zarodkowej C.elegans. Staranne zaprojektowanie znacznika oraz dokładna walidacja są niezbędne, aby zachować funkcję białka i zminimalizować liczbę fałszywie dodatnich kandydatów. W przyszłych badaniach ten schemat postępowania może zostać wykorzystany do śledzenia lokalizacji białek oraz badania potencjalnych oddziaływań podczas rozwoju linii zarodkowej.

crisprcas9-mediated-endogenous-fluorescent-tagging-germline-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

CRISPR/Cas9-pośredniczone Endogenousne Znaczenie Fluorescencyjne Oznaczania Genów Specyficznych dla Linii Zarodkowej w Caenorhabditis elegans

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania białek w linii komórek germinalnych Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia precyzyjną analizę lokalizacji białek pod kontrolą natywnej regulacji.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów