Ostry protokół mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis
May 8th, 2026
Ten protokół przedstawia wydajny przepływ pracy dla mikroskopii lokalizowania pojedynczych cząsteczek obrazują izolowanych jąder Arabidopsis, z wykorzystaniem zoptymalizowanego izolowania, fiksacji i etykietowania, aby osiągnąć niezawodną wizualizację na skalę nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście może być łatwo dostosowane do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokorozdzielczego obrazu.
Moje badania koncentrują się na edycji epigenomu i wizualizowanie organizmu chromatyny w jądrach Arabidopsis za pomocą mikroskopii superrozdzielczej. Istniejące metody nie są przystosowane do obrazowania STORM. Ten protokół poprawia czystość jąder, spójność oznaczeń, montaż próbek i stabilność obrazu.
Dotyczy Arabidopsis thaliana i innych systemów roślinnych do badania organizacji jąder, struktury chromatyny i epigenetyki w wysokiej rozdzielczości. Aby rozpocząć, umieść sześcio-dołkową płytkę hodowlańczą na lodzie pod okapem chemicznym. Wymieszaj roztwór fiksacyjny zawierający 4% objętościowo, metanol stabilizowany formaldehyd 0,1% Triton X100 i PBS.
Dodaj około cztery mililitry lodowego roztworu fiksacyjnego do każdego dołka pod okapem chemicznym. Używając czystych kleszczy, usuń sadzonki Arabidopsis, które są między ósmym a 15 dniem po kiełkowaniu z połowy średniej Murashige i Skoog lub MS medium. Natychmiast zanurz sadzonki w roztworze fiksacyjnym i umieść około 20 sadzonek na dołek.
Użyj trzech dołków, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału na próbkę. Umieść płytkę w komorze próżniowej wypełnionej lodem i zamknij ją. Zastosuj cykl próżni między minus 0,6 bara i minus 0,8 bara przez 15 minut, aby usunąć uwięzione powietrze i umożliwić głębokie przeniknięcie środka fiksującego do tkanek roślin.
Następnie powoli zwolnij próżnię. Wymieszaj próbkę i zastosuj próżnię przez kolejne 15 minut. Pod okapem chemicznym usuń roztwór fiksacyjny pipetą.
Wypłucz każdy dołek trzykrotnie po 10 minut każdy pod delikatnym agitowaniem, używając pięciu mililitrów lodowego PBS. Po wypłukaniu usuń PBS. Używając kleszczy, przenieś fiksowaną tkankę do 120 na 120 milimetrowej łyżeczki Petriego i dodaj 50 mikrolitrów buforu izolacji jąder do fiksowanych sadzonek.
Ostrą krawędzią łopatki posiekaj fiksowaną tkankę. Używając tej samej łopatki, zdrapkaj posiekaną tkankę na jedną krawędź łyżeczki Petriego. Dodaj 600 mikrolitrów buforu izolacji jąder i zmyj wszelkie tkanki przywierające do łopatki.
Przenieś zawiesinę tkankową do dwumilimetrowej epruwetki Dounce i pięć do dziesięciu razy zetrzyj mniejszą trzepaczką. Następnie zetrzyj większą trzepaczką, aż porusza się gładko wewnątrz epruwetki, zazwyczaj wymagając pięciu do dziesięciu pociągnięć. Przefiltruj zetrzeną zawiesinę przez filtr o 30 mikrometrach do 50-mililitrowej epruwetki.
Przenieś filtrate do nowej 1,5-mililitrowej epruwetki. Wyśrodkuj zawiesinę przez 10 minut przy 800G, używając najniższego rampu zarówno dla przyspieszenia jak i spowolnienia. Po wyśrodkowaniu zauważ, że mała biała kulka jest widoczna wśród zielonych resztek tkanki.
Odłóż nadstan i ponownie zawieś kulkę w 600 mikrolitrach buforu izolacji jąder. Wyśrodkuj ponownie przez 10 minut przy 800G i usuń nadstan. Po całkowitym zmyciu zielonych resztek przechowuj izolowaną zawiesinę jąder w czterech stopniach Celsjusza maksymalnie przez jeden tydzień i immunostanuj jądra żądanymi przeciwciałami.
Podgrzej 1,5% wagi objętowej roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia do 90 stopni Celsjusza przez jedną minutę, aby rozpuścić proszek i uzyskać przezroczysty roztwór. Skręć krótko, aby zapewnić pełne zmieszanie. Ochłodź roztwór i utrzymuj go w 37 stopniach Celsjusza przed dalszym postępowaniem, aby uniknąć denaturacji cieplnej bufora oksydazy glukozy.
Gdy roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia osiągnie 37 stopni Celsjusza, przygotuj bufor STORM, dodając 100 milimolarów merkaptoetyloaminy i bufor oksydazy glukozy do agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby osiągnąć końcową koncentrację 1X i delikatnie wymieszaj roztwór. Złóż 10 mikrolitrów mieszanki jąder na ozonowanym pokrywku 1,5H, który był poddawany oczyszczaniu w środowisku ozonowym przez 20 minut. Poczekaj trzy minuty, aby jądra osiadły na pokrywku.
Następnie usuń nadmiar płynu i poczekaj dwie minuty. Dodaj 10 mikrolitrów przygotowanego niskotopliwego agarozy do pokrywki i natychmiast przykryj szklaną płytką mikroskopijną. Uszczelnij pokrywkę używając uszczelniacza silikonowego.
Wymieszaj równe ilości roztworu A i roztworu B w małej łyżeczce Petriego używając końcówki mikropipety. Nałóż mieszaninę na krawędziach pokrywki, aby uszczelnić próbkę. Pozostaw uszczelniacz silikonowy na pięć minut, aby się stwardniał.
Zamontuj szkielet próbki na mikroskopie i znajdź fokus. Zlokalizuj i skup się na jądrze. Aktywuj moduł utrzymujący fokus, jeśli jest dostępny, aby zapewnić stabilność podczas długich nabyć.
Wybierz obszar, w którym jeden lub kilka nanodiamentów są umieszczone w pobliżu jądra, aby poprawić korekcję dryfu podczas rekonstrukcji. Dla dwukolorowego obrazu, rozpocznij nabycie z kanału dłuższej długości fali, a następ
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article introduces a streamlined and reproducible protocol for Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), specifically direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), to visualize chromatin architecture in nuclei isolated from Arabidopsis thaliana. The workflow addresses technical challenges in plant sample preparation, enabling nanoscale imaging of chromatin domains, histone modifications, and nuclear organization with enhanced clarity and reproducibility.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Super-resolution microscopy
- Chromatin organization
Background
- Confocal fluorescence microscopy is limited by diffraction, restricting resolution in chromatin studies.
- Super-resolution techniques like SMLM overcome these limitations, providing nanoscale insights.
- dSTORM is widely used in mammalian systems but less so in plants due to sample preparation challenges.
- Improved protocols are needed to facilitate SMLM in plant nuclei.
Purpose of Study
- To develop a reproducible workflow for SMLM imaging of plant nuclei.
- To enable high-resolution visualization of chromatin modifications and nuclear architecture in Arabidopsis thaliana.
- To lower technical barriers for applying super-resolution microscopy in plant biology.
Methods Used
- Fixation of Arabidopsis seedlings to preserve nuclear morphology.
- Gentle tissue chopping and centrifugation to enrich for intact nuclei.
- Fluorophore labeling of isolated nuclei in liquid medium.
- Immobilization of nuclei on low-melting agarose pads for imaging stability.
Main Results
- The protocol minimizes background fluorescence and improves labeling consistency.
- Enhanced reproducibility is achieved across biological replicates.
- Preparations allow clear visualization of chromatin modifications and nuclear architecture at the nanoscale.
- The workflow facilitates studies of epigenetic regulation and nuclear topology in plants.
Conclusions
- This protocol establishes a methodological foundation for SMLM imaging in plant systems.
- It bridges the gap between plant and mammalian cell biology in super-resolution imaging.
- The approach opens new opportunities to study genome regulation and nuclear architecture in response to developmental and environmental cues in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of chromatin architecture in plant nuclei addresses a critical gap in understanding epigenetic regulation and nuclear organization at the nanoscale. This streamlined SMLM protocol for Arabidopsis nuclei enables reproducible, high-resolution visualization, supporting predictive confidence in chromatin state analysis. The approach enhances early discovery and mechanistic de-risking for plant-based R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables nanoscale interrogation of chromatin domains and histone modifications in plant nuclei.
- Supports functional validation of epigenetic targets by visualizing nuclear architecture changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of chromatin organization.
- Improves predictive confidence in linking nuclear structure to gene regulation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible super-resolution imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-clarity readouts of chromatin modifications for assay development.
- Enables consistent labeling and imaging across biological replicates, supporting screening scalability.
- Prepares validated plant nuclear systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin imaging outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying nuclear topological changes under different conditions.
- Provides mechanistic insights relevant to environmental and developmental response studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early chromatin hypothesis testing to preclinical validation of epigenetic mechanisms in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of chromatin organization and nuclear architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of chromatin modifications and nuclear features for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling biomarker alignment in plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse plant research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in chromatin state analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for epigenetic target programs in plant R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and plant nuclear isolation.
- Needs access to dSTORM-capable imaging platforms and fluorophore labeling reagents.
- Demands cross-team standardization of fixation, labeling, and immobilization protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Sample stability and background minimization are critical for reproducible outputs.
