Name: Sprostowany protokół do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-08T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj uproszczony protokół mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek dSTORM w jądrach Arabidopsis thaliana. Ta metoda umożliwia nanorozdzielcze wizualizowanie organizacji chromatyny i epigenetyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laboratorium Lavis i zespołowi Open Chemistry w Janelia za hojne dostarczenie barwników JF i JFX. Jesteśmy również wdzięczni Elizabeth Kracik-Dyer i Célia Baroux za uprzejme udostępnienie ich protokołu, a także Aline Probst i Guillermo Orsi za pomocne rady. Obrazowanie optyczne zostało przeprowadzone na platformie obrazowania M4D centrum Grenoble Instruct-ERIC (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA- UGA- EMBL) w ramach Partnerstwa Grenoble dla Biologii Strukturalnej, wspierane przez Francuską Infrastrukturę dla Zintegrowanej Biologii Strukturalnej (ANR-10-INBS-0005-02) i Grenoble Alliance for Integrated Structural & Cell Biology Labex, projekt Szkoły Doktoranckiej Uniwersytetu Grenoble Alpes (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR- 17-EURE- 0003). Wyrażamy uznanie dla Tip ten Brink za opracowanie pakietu Python AnalyzeFRC w Dziale Fizyki Obrazowania (ImPhys), Wydziale Nauk Stosowanych, TU Delft.

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat materiałów i instrumentów użytych w tym protokole są dostępne w Tabeli Materiałów. O ile nie określono inaczej, bufory są filtrowane przez apyrogenne filtry 0,2 μm. W całym protokole stosuje się podwójnie destylowaną, ultraczystą wodę (ddH2O). Kroki wirowania są przeprowadzane w 1,5 mL mikroprobówkach za pomocą wirnika kątowego.
1. Fiksacja siewek i uwolnienie jąder
<ol>
	<li>Umieść 6-dołkową płytkę hodowlań na lodzie pod oknem ciągowym, a następnie dodaj do każdego dołka około 4 mL lodowatej substancji fiksującej przygotowanej bezpośrednio przed użyciem pod oknem ciągowym (4% (v/v) metanolowa stabilizowana formalina, 0,1% Triton X-100 w 1× buforze fosforanowym [PBS]).</li>
	<li>Za pomocą czystych kleszczy usuń siewki (między 8 a 15 dniami po kiełkowaniu), które były hodowane na półpłytkach Murashige i Skoog Medium 2,2 g/L MS salts, 1% sukroz (w/v), pH 5,7, jak opisano dla siewek MS w referencji24, i natychmiast zanurz je w substancji fiksującej. Użyj jednego dołka na około 20 siewek (3 dołki były potrzebne, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału na próbkę).</li>
	<li>Umieść płytkę w komorze próżniowej wypełnionej lodem i zastosuj próżnię o ciśnieniu wahanym się między 0,2 bar a 0,8 bar przez 15 min, aby usunąć uwięzione powietrze i umożliwić głębokie przenikanie środka fiksującego do tkanek roślin25. Powoli zwolnij próżnię, wymieszaj próbkę, a następnie zastosuj próżnię przez kolejne 15 min.</li>
	<li>Pod oknem ciągowym usuń substancję fiksującą za pomocą pipety i przepłucz każdy dołek 3 razy przez 10 min pod łagodnym mieszaniem, używając 5 mL lodowego PBS.</li>
	<li>Usuń PBS i za pomocą kleszczy przenieś usztywnioną tkankę do 120 mm × 120 mm naczynia Petriego. Dodaj do usztywnionych siewek 50 μL Buforu Izolacji Jąder (NIB), przygotowanego zgodnie z opisem Kracik-Dyer i Baroux (45 mM MgCl2, 20 mM MOPS, 30 mM cytrynianu sodu, 0.3% Triton X-100. Dostosuj do pH 7 za pomocą 1 N HCl)19. Rozdrabniacz blaszką. 
	UWAGA: Okazało się, że ostrza mikrotomu są bardziej efektywne niż konwencjonalne ostrza do golenia w tym zadaniu.</li>
	<li>Zdrap pokrojony materiał na jedną krawędź naczynia Petriego za pomocą tej samej blaszki i dodaj 600 μL NIB, upewniając się, że zdejmiesz również każdy materiał przywierający do ostrza.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę tkankową do 2 mL rury homogenizatora Dounce i 5-10 razy przesuń mniejszym tłóczkiem, a następnie większym tłóczkiem, aż się gładko porusza wewnątrz rury (znowu zwykle potrzeba 5-10 przesuwów).</li>
	<li>Przefiltruj uzyskany zhomogenizowany próbek przez 30 μm sitko do 1,5 mL mikroprobówki.</li>
	<li>Wiruj zawiesinę przez 10 min przy 800 × g używając najniższego przyspieszenia zarówno podczas przyspieszania, jak i spowalniania. Wśród zielonych zanieczyszczeń tkankowych widoczny jest mały biały pellet.</li>
	<li>Odsuń nadstan i ponownie zawieś pellet w 150 μL NIB.</li>
	<li>Wiruj ponownie przez 10 min przy 800 × g i odsuń nadstan. Jeśli widać jakieś zielone zanieczyszczenia, przepłucz po raz drugi. Ponownie zawieś w 50 μL do 150 μL NIB, w zależności od wielkości pelletu.</li>
	<li>Przechowuj uzyskany izolowany zawiesinę jąder w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień przed wykonaniem barwienia. Zaleca się jednak natychmiastowe przejście do kolejnego kroku.</li>
</ol>
2. (Immuno)barwienie
UWAGA: W następujących krokach protokół jest stosowany do objętości 50 μL zawiesiny jąder, co zazwyczaj odpowiada 20 siewkom. O ile nie określono inaczej, następujące kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Wiruj roztwór przez 10 min przy 800 × g i odsuń nadstan. Uważaj, aby nie dotykać pelletu.</li>
	<li>Ponownie zawieś jądra przez delikatne pipetowanie w 50 μL buforu blokującego (143 mM NaCl, 4% BSA w PBS, przechowywany w 4 °C). Inkubacja przez 30 min pod łagodnym mieszaniem.</li>
	<li>Wiruj roztwór przez 10 min przy 800 × g i odsuń nadstan bez dotykania pelletu jąder.</li>
	<li>Ponownie zawieś jądra przez delikatne pipetowanie w 50 μL 1× PBS. Wiruj ponownie przez 10 min przy 800 × g. Odsuń nadstan jak wyżej.</li>
	<li>Ponownie zawieś jądra w 50 μL roztworu przeciwciała pierwotnego przygotowanego w buforze immunobarwienia składającego się z 143 mM NaCl, 1% BSA, 0,05% Tween 20 w PBS (szczegóły dotyczące przeciwciał i rozcieńczeń roboczych znajdują się w Tabeli Materiałów). Inkubacja próbek przez 60 min pod łagodnym mieszaniem.</li>
	<li>Przejdź do 2 przepłuki

<ol>
	<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128 (4), 787-800 (2007).</li><li>Rowley, M. J., Corces, V. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+3D+genome+architecture.">Organizational principles of 3D genome architecture.</a> Nat Rev Genet. 19 (12), 789-800 (2018).</li><li>Fransz, P., de Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li><li>Tessadori, F., Chupeau, M. C., Chupeau, Y., Knip, M., Germann, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+dissociation+and+sequential+reassembly+of+pericentric+heterochromatin+in+dedifferentiated+Arabidopsis+cells.">Large-scale dissociation and sequential reassembly of pericentric heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells.</a> J Cell Sci. 120 (7), 1200-1208 (2007).</li><li>Caballero, L., Pasternak, T., Riyazuddin, R., P&#233;rez-P&#233;rez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+high-resolution+3D+chromatin+maps+with+cell+division+and+cell+differentiation+at+the+root+apical+meristem.">Connecting high-resolution 3D chromatin maps with cell division and cell differentiation at the root apical meristem.</a> Plant Cell Rep. 43 (10), 232 (2024).</li><li>Pavlova, P., van Zanten, M., Snoek, B. L., de Jong, H., Fransz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+morphometric+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+nuclei+reveals+characteristic+profiles+of+different+cell+types+and+accessions.">2D morphometric analysis of Arabidopsis thaliana nuclei reveals characteristic profiles of different cell types and accessions.</a> Chromosome Res. 30 (1), 5-24 (2022).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+Wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett, OL. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt Lett, OL. 24 (14), 954-956 (1999).</li><li>Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Quantitative Single-Molecule Localization Microscopy.</a> Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).</li><li>Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Heilemann, M., van de Linde, S., Sch&#252;ttpelz, M., Kasper, R., Seefeldt, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Ricci, M. A., Manzo, C., Garc&#237;a-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fibers+are+formed+by+heterogeneous+groups+of+nucleosomes+in+vivo.">Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo.</a> Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Jin, J., Uttam, S., Fu, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+higher-order+chromatin+structures+at+different+epigenomic+states+in+single+mammalian+cells.">Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells.</a> Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).</li><li>Nozaki, T., Imai, R., Tanbo, M., Nagashima, R., Tamura, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organization+of+chromatin+domains+revealed+by+super-resolution+live-cell+imaging.">Dynamic organization of chromatin domains revealed by super-resolution live-cell imaging.</a> Molecular Cell. 67 (2), 282-293.e7 (2017).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+in+plant+cell+imaging.">Super-resolution microscopy in plant cell imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Kracik-Dyer, E., Baroux, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+STED+Imaging+of+isolated+Arabidopsis+thaliana+nuclei.">3D STED Imaging of isolated Arabidopsis thaliana nuclei.</a> Methods Mol Biol. 2873, 263-280 (2025).</li><li>Gaifas, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+live+fluorescence+imaging+with+in+situ+cryoelectron+tomography+sheds+light+on+the+septation+process+in+Deinococcus+radiodurans.">Combining live fluorescence imaging with in situ cryoelectron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 122 (19), e2425047122 (2025).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+time-lapse+microscopy.">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated time-lapse microscopy.</a> J Vis Exp. (53), e3145 (2011).</li><li>Vauclare, P., Wulffel&#233;, J., Lacroix, F., Servant, P., Canfalonieri, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+nucleoid+remodeling+in+Deinococcus+radiodurans+is+associated+with+major+changes+in+Heat+Unstable+(HU)+protein+dynamics.">Stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans is associated with major changes in Heat Unstable (HU) protein dynamics.</a> Nucleic Acids Res. 52 (11), 6406-6423 (2024).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+&#8211;+Applications+in+plant+cell+research.">Super-resolution microscopy &#8211; Applications in plant cell research.</a> Front Plant Sci. 8, 531 (2017).</li><li>Carles, C. C., Ha, C. M., Jun, J. H., Fiume, E., Fletcher, J. C., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Shoot+Apical+Meristem+Development.">Analyzing Shoot Apical Meristem Development.</a> Plant Developmental Biology: Methods and Protocols. , 105-129 (2010).</li><li>Chincinska, I. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+infiltration+in+plant+science:+old+method,+new+possibilities.">Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities.</a> Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).</li><li>Tse-Kang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+immunity+in+C.+elegans+is+activated+by+pathogen+effector-triggered+aggregation+of+the+guard+protein+TIR-1+on+lysosome-related+organelles.">Intestinal immunity in C. elegans is activated by pathogen effector-triggered aggregation of the guard protein TIR-1 on lysosome-related organelles.</a> Immunity. 57 (10), 2280-2295.e6 (2024).</li><li>Lim, D., Ford, T. N., Chu, K. K., Mertz, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+sectioned+in+vivo+imaging+with+speckle+illumination+HiLo+microscopy.">Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy.</a> J Biomed Opt. 16 (1), 016014 (2011).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mapping+and+minimization+of+super-resolution+optical+imaging+artifacts.">Quantitative mapping and minimization of super-resolution optical imaging artifacts.</a> Nat Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+mutations+in+histone+H3.3+illuminate+the+functional+significance+of+H3K4+methylation+in+plants.">Single amino acid mutations in histone H3.3 illuminate the functional significance of H3K4 methylation in plants.</a> Nat Commun. 16 (1), 4408 (2025).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plugin+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plugin for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Van Heel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+measures+between+images.">Similarity measures between images.</a> Ultramicroscopy. 21 (1), 95-100 (1987).</li><li>Loureiro, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+plant+nuclei+for+estimation+of+nuclear+DNA+content:+Overview+and+best+practices.">Isolation of plant nuclei for estimation of nuclear DNA content: Overview and best practices.</a> Cytometry Part A. 99 (4), 318-327 (2021).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li><li>Duncan, S., Olsson, T. S. G., Hartley, M., Dean, C., Rosa, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detecting+single+mRNA+molecules+in+Arabidopsis+thaliana.">A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12, 13 (2016).</li><li>Gutzat, R., Mittelsten Scheid, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+chromatin+and+RNA+from+rare+cell+types+with+fluorescence-activated+nuclear+sorting+(FANS).">Preparing chromatin and RNA from rare cell types with fluorescence-activated nuclear sorting (FANS).</a> Methods Mol Biol. 2093, 95-105 (2020).</li></ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przygotowanie jąder Arabidopsis thaliana do mikroskopii lokalizowania pojedynczych cząstek (SMLM) wymaga kilku kluczowych kroków, które wpływają na jakość końcowej próbki. Jak opisano wcześniej19,35, dokładne i spójne krojenie tkanki jest niezbędne do maksymalizacji odzysku całych jąder. Użycie ostrza mikrotomowego zamiast standardowych ostrzałek daje czystsze i bardziej jednolite rozdrobnienie tkanki, co poprawia uwalnianie jąder. Kolejne kroki płukania...

Mikroskopia od dawna jest filaretem badań nad organizacją chromatyny i architekturą jądra komórkowego, ujawniając sposób, w jaki DNA oraz białka związane z histonami układają się w przestrzeni jądrowej 3D i wpływają na regulację genów1,2. Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna dostarczyła cenny wgląd w duże domeny chromatyny, takie jak terytoria chromosomowe, chromocentry i ciała jądrowe3,4, wykonalne in situ, w szczególności w tkankach korzeniowych roślin3,5,6. Jednakże techniki te są zasadniczo ograniczone przez barierę dyfrakcyjną światła, ograniczając rozdzielczość przestrzenną do około 200 nm wzdłużnie i 500 nm wzdłuż osi7. To ograniczenie kryje szczegóły w skali nanometrów fałdowania chromatyny, wzorców modyfikacji histonów i kompartmentalizacji transkrypcyjnej, które leżą u podstaw regulacji epigenetycznej. Aby pokonać tę barierę, opracowano podejścia mikroskopii superrozdzielczej (SRM), takie jak mikroskopię z ulepszonym oświetleniem (SIM)8, deplecję emisji stymulowanej (STED)9,10 oraz mikroskopię lokalizowania pojedynczych cząsteczek (SMLM)11,12, aby osiągnąć rozdzielczość od 100 nm do kilku nm13.
Wśród technik SRM, SMLM – w tym Fotoaktywowana Mikroskopia Lokalizacji (PALM)13 oraz bezpośrednia Mikroskopia Rekonstrukcji Optycznej Stochastycznej (dSTORM) – oferuje wyjątkową rozdzielczość przestrzenną w połączeniu ze specyficznością molekularną14. Wykrywając pozycje pojedynczych fluoroforów w czasie, SMLM rekonstruuje precyzyjne obrazy w skali nanometrów domen chromatyny, znaków histonowych i struktur jądrowych w pojedynczych komórkach15,16. Ta zdolność zmieniła badania nad chromatyną w systemach ssaków, gdzie SMLM zostało zastosowane do wizualizacji skupiania nukleosomów, zagęszczania chromatyny i wzorców modyfikacji histonów z niespotykanym dotychczas szczegółem15,16,17. Natomiast zastosowanie SMLM do jąder roślinnych pozostaje ograniczone, głównie z powodu wyzwań technicznych związanych z właściwościami tkanki roślinnej – takimi jak wysoka autofluorescencja, sztywność ściany komórkowej oraz obecność związków rozpraszających światło, jak skrobia i chlorofil18. Co więcej, delikatna natura jąder podczas izolacji i oznakowania wymaga zoptymalizowanych przepływów pracy, aby zachować integralność strukturalną i zminimalizować fluorescencje tła podczas długotrwałych sesji obrażowania.
Opisany tu protokół został pierwotnie opracowany przez Elizabeth Kracik-Dyer i Célię Baroux do mikroskopi deplecji emisji stymulowanej (STED)19. Następnie został zoptymalizowany i dostosowany, aby spełnić konkretne wymagania obrażowania STORM z integracją wiedzy pochodzącej z opublikowanych zastosowań w mikrobologii20,21,22. Ogólnym celem jest zapewnienie usprawnionego i powtarzalnego przepływu pracy dla obrażowania SMLM izolowanych jąder Arabidopsis thaliana. Poprzez integrację zoptymalizowanej fiksacji, łagodnego rozerwania mechanicznego i oznakowania fluoroforem w zawiesinie, ta metoda zachowuje morfologię jądra, jednocześnie efektywnie usuwając zanieczyszczenia cytoplazmatyczne, które często kompromitowały jakość obrażowania. Unieruchomienie oznaczonych jąder na poduszkach z agarozy o niskiej temperaturze topnienia zapewnia stabilność mechaniczną podczas akwizycji, umożliwiając długotrwałe obrażowanie jednocząsteczkowe z precyzją w skali nanometrów. W porównaniu z wcześniej opisanymi protokołami SRM dla jąder roślinnych – szczególnie tymi opartymi na mikroskopii STED19,23 – ten przepływ pracy wykorzystuje fluorofory fotoprzełączalne (np. AF647, JF549) i zmniejsza fluorescencje tła dzięki krokom płukania, które usuwają chlorofil i zanieczyszczenia tkankowe, poprawiając jednorodność oznakowania poprzez bezpośrednie dodanie cząsteczki oznakowania do fiksowanych i permeabilizowanych jąder. W rezultacie umożliwia konsekwentną wizualizację modyfikacji chromatyny, przedziałów jądrowych i wzorców epigenetycznych w pojedynczych jądrach. Obniżając bariery techniczne dla implementacji SMLM w roślinach, ta metoda poszerza dostępność obrażowania w skali nanometrów i zapewnia podstawę do badania, jak organizacja chromatyny i architektura jądra przyczyniają się do regulacji genów w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

<table><tbody><tr><td>Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody</td><td>Abcam</td><td>ab5095</td><td>Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Abbelight</td><td>NEO LiveImaging v2.18</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Certyfikowany żel agarose o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Bio-Rad</td><td>1613111</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywy szklane grubość 1.5H okrągłe</td><td>Marienfeld</td><td>117640</td><td>&Oslash;: 24 mm</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza, bezwodna, 99%</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16828-36&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zwierciadło dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>Di03-R405/488/561/635-t1</td><td>Zwierciadło dichroiczne do separacji pobudzenia/emisji</td></tr><tr><td>Puffer fosforanowy Dulbecco 10&acute;</td><td>biowest</td><td>X0515 - 500&nbsp;</td><td>Praca w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Ostrza do mikrotomów jednorazowego użytku Epredia Ultra</td><td>FisherScientific</td><td>12191830</td><td>Niski profil, jednorazowe</td></tr><tr><td>Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid</td><td>&nbsp;Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 37%</td><td>Carl Roth</td><td>7398</td><td>Praca pod osłoną dymną</td></tr><tr><td>Glukoza oksydaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Kozłowiecki przeciw-Króliczy IgG (H+L) Wysoce Adsorbowany Przeciwciało Wtórne, Alexa Fluor Plus 647</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32733TR</td><td>Używane w 1/200 jako przeciwciało wtórne sprzężone z AF647</td></tr><tr><td>Roztwór Hoescht 33258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94403</td><td>Używane w 1/500 do kontrastowania DNA, dodane do podłoża agarose</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego</td><td>Chem-Lab</td><td>CL05.0311.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>JF549-Hoechst</td><td>Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)</td><td>JF549-Hoechst</td><td>Używane do kontrastowania DNA, dodane do podłoża agarose w ostatecznej stężeniu 1,5 nM</td></tr><tr><td>Zestaw rozdrabniaczy tkankowych KIMBLE Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>2 mL rurka z tłokami o dużej (0,0030-0,0050 cala) i małej (0,0005-0,0025 cala) luzie</td></tr><tr><td>Jednostka laserowa</td><td>Oxxius</td><td>L6Cc</td><td>Wyposażone w sześć laserów: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW i 730 nm - 30 mW</td></tr><tr><td>Chlorku magnezu sześciowodorku</td><td>Carl Roth</td><td>HN03</td><td></td></tr><tr><td>Merkaptoetyloamina (MEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>MOPS sodium salt 98%</td><td>Fisher Scientific SAS</td><td>352590010</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny wielozakresowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/523/600/677</td><td>Filtracja emisyjna wielozakresowa do blokowania światła rozproszonego przez laser</td></tr><tr><td>Nanodiamancy</td><td>Adamas Nanotechnologies</td><td>NDNV100nmHiWGA2ml</td><td>Zapas 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CMOS ORCA-Fusion</td><td>Hamamatsu</td><td>C14440-20UP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Miszka Petri, 100/20 mm, PS, przezroczysta, z otworami wentylacyjnymi, sterylna</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td>Używane do uprawy roślin na połowie pożywki MS</td></tr><tr><td>Miszka Petri, kwadratowa, PS, przezroczysta, 120/120/17 mm, sterylna</td><td>Greiner Bio-One</td><td>688161</td><td>Używane podczas krojenia sadzonek roślin</td></tr><tr><td>pluriStrainer Mini sitko komórkowe</td><td>pluriSelect</td><td>43-10030-50</td><td>Rozmiar siatki 30 &micro;m, odpowiednie dla 1,5 mL rurek Eppendorf</td></tr><tr><td>Chlorku potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny jednozakrośnikowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-698/70</td><td>Specyficzny filtr emisyjny dla kanału AF647</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny jednozakrośnikowy</td><td>Chroma</td><td>ET600/50m</td><td>Specyficzny filtr emisyjny dla kanału JF549</td></tr><tr><td>Chlorku sodu (99,5%)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>Star-Frost slides 76 x 26 mm</td><td>Knittel</td><td>&nbsp;VS112711FKB.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filter&oslash; 33 mm porosity 0.2 &micro;m Luer Lock cone</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td></td></tr><tr><td>System superrozdzielczości</td><td>Abbelight</td><td>SAFe360</td><td>Olympus IX83 wyposażony w obiektyw o 100x NA1.5 z zanurzeniem w oleju</td></tr><tr><td>Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole</td><td>Prolabo</td><td>PRO-33615.268</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Molecular Biology Grade</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-karbokietylo)fosfiny chlorowodorek (TCEP)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Euromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-B</td><td></td></tr><tr><td>Twinsil Speed</td><td>Picodent</td><td>13001002</td><td>Uszczelka silikonowa</td></tr><tr><td>Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven</td><td>UVOCS Inc.</td><td>T10X10</td><td>20 min ekspozycji na czyszczenie pokryw szkła&nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Vacuubrand</td><td>

stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach arabidopsis

A Streamlined Protocol for Single-Molecule Localization Microscopy in Arabidopsis Nuclei

Chociaż konfokalna mikroskopia fluorescencyjna dostarczyła cennych informacji na temat organizacji chromatyny w jądrach roślin, jej rozdzielczość ograniczona dyfrakcją ogranicza badania nad architekturą chromatyny, motywując stosowanie technik superrezoluccji, takich jak Mikroskopia Lokalizacji Pojedynczych Cząstek (SMLM). Wśród tych podejść, bezpośrednia stochastyczna optyczna rekonstrukcja mikroskopia (dSTORM) zapewnia rozdzielczość na skalę nanometrów w pojedynczych komórkach, umożliwiając precyzyjne wizualizowanie domen chromatyny, modyfikacji histonów i organizacji jądrowej. Chociaż takie metody są coraz częściej stosowane w systemach ssaków, ich zastosowanie w biologii roślin pozostaje ograniczone, głównie z powodu wyzwań technicznych w przygotowaniu próbek.
Przedstawiamy tutaj uproszczony i powtarzalny przepływ pracy dla obrazowania SMLM jąder izolowanych z Arabidopsis thaliana. Ten protokół rozpoczyna się od fiksacji sadzonek, aby zachować morfologię jąder, a następnie delikatnego krojenia tkanek i wirowania, aby wzbogacić nienaruszone jądra. Izolowane jądra są następnie oznakowane fluoroforami w płynnym podłożu i unieruchamiane na niskotopliwych podkładkach agarozy, co poprawia stabilność podczas przedłużonych sesji obrazowania pojedynczych cząstek. Te kroki łącznie minimalizują tło fluorescencyjne, poprawiają spójność znakowaniu i zwiększają powtarzalność w różnych replikowanych warunkach biologicznych.
Powstałe preparaty zapewniają lepszą czytelność wizualizowania modyfikacji chromatyny i architektury jądra u roślin. Poprzez obniżenie barier technicznych w implementacji obrazowania SMLM w Arabidopsis, ten protokół zapewnia wszechstronne środki do badania regulacji epigenetycznej, organizacji chromatyny i wariacje topologiczne jądra na skalę nanometrów. Ta praca ustanawia metodologiczną podstawę dla stosowania SMLM w roślinach, nadążając za biologią komórki ssaków i otwierając nowe możliwości do badania, jak architektura jądra przyczynia się do regulacji genomu w odpowiedzi na bodźce rozwojowe i środowiskowe w systemach roślinnych.

Opisany powyżej protokół umożliwia przygotowanie wysokiej jakości jąder Arabidopsis thaliana odpowiednich do SMLM. Przeprowadzono kilka rund optymalizacji w celu poprawy integralności jąder oraz ograniczenia ilości zanieczyszczeń cytoplazmatycznych i komórkowych, które obniżają jakość obrazu. Po każdym etapie optymalizacji jakość preparatów jąder była oceniana za pomocą obrazowania konfokalnego z użyciem mikroskopu z dyskiem obrotowym Olympus IX81 przed przystąpieniem do akwizycji w superrozdzielczości.
<p c...

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

While confocal fluorescence microscopy has provided valuable insights into chromatin organization in plant nuclei, its diffraction-limited resolution ...

Moje badania koncentrują się na edycji epigenomu i wizualizacji organizacji chromatyny w jądrach Arabidopsis za pomocą mikroskopii super rozdzielczej. Istniejące metody nie są przystosowane do obrazowania STORM. Ten protokół poprawia czystość jąder, spójność oznaczeń, montaż próbki i stabilność obrazu.Dotyczy Arabidopsis thaliana i innych systemów roślinnych do badania organizacji jądra, struktury chromatyny i epigenetyki z wysoką rozdzielczością. Na początek umieść sześcio-dołkową płytkę hodowlaną na lodzie pod kapturą chemiczną. Wymieszaj roztwór fiksujący zawierający 4% objętościowo metanol, stabilizowane formaldehyd 0,1% Triton X100 i PBS.Dodaj około cztery mililitry lodowatego roztworu fiksującego do każdego dołka pod kapturą chemiczną. Za pomocą czystych kleszczy usuń sadzonki Arabidopsis, które mają od ośmiu do 15 dni po kiełkowaniu z pół-silnego pożywki Murashige i Skoog, lub pożywki MS. Natychmiast zanurz sadzonki w roztworze fiksującym i umieść około 20 sadzonek na dołek.Użyj trzech dołków, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału na próbkę. Umieść płytkę w komorze próżniowej wypełnionej lodem i zamknij ją. Zastosuj próżnię oscylującą między minus 0,6 bara a minus 0,8 bara przez 15 minut, aby usunąć uwięzione powietrze i pozwolić na głębokie wnikanie utwardzacza do tkanek roślinnych.Następnie powoli zwolnij próżnię. Wymieszaj próbkę i zastosuj próżnię przez kolejne 15 minut. Pod kapturą chemiczną usuń roztwór fiksujący pipetą.Przepłucz każdy dołek trzy razy po 10 minut każdy pod delikatnym agitowaniem za pomocą pięciu mililitrów lodowego PBS. Po przepłukaniu usuń PBS. Za pomocą kleszczy przenieś fiksowaną tkankę do 120 na 120 milimetrowej kryształki Petriego i dodaj 50 mikrolitrów buforu izolację jąder do fiksowanych sadzonek.Za pomocą ostrza pokroić fiksowaną tkankę. Za pomocą tego samego ostrza zeskrobać pokrojoną tkankę na jedną krawędź kryształki Petriego. Dodać 600 mikrolitrów buforu izolacji jąder i przepłukać ewentualne tkanki przywierające do ostrza.Przenieść zawiesinę tkankową do dwumilimetrowej tubki homogenizatora Dounce i przetrzyj pięć do dziesięciu razy mniejszym tłączkiem. Następnie przetrzyj większym tłączkiem, aż się gładko porusza wewnątrz tubki, zazwyczaj wymagając pięciu do dziesięciu ruchów. Przefiltruj homogenizowaną próbkę przez filtr o oczku 30 mikrometrów do 50-mililitrowej tubki.Przenieś filtrate do nowej 1,5-mililitrowej tubki. Wiruj zawiesinę przez 10 minut przy 800G przy najniższym rampie zarówno do przyspieszenia, jak i spowolnienia. Po wirowaniu zauważ, że mała biała bryła jest widoczna wśród zielonych resztek tkanki.Odłóż nadstan i ponownie zawieś bryłę w 600 mikrolitrach buforu izolacji jąder. Wiruj ponownie przez 10 minut przy 800G i odłóż nadstan. Po całkowitym usunięciu zielonych resztek przechowuj zawiesinę izolowanych jąder w czterech stopniach Celsjusza przez maksymalnie jeden tydzień i przeprowadź immunobarwienie jąder za pomocą pożądanych przeciwciał.Podgrzej 1,5% roztwór żelatyny o niskiej temperaturze topnienia w 90 stopniach Celsjusza przez jedną minutę, aby rozpuścić proszek i uzyskać klarowny roztwór. Skręć krótko, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Schłodź roztwór i utrzymuj go w 37 stopniach Celsjusza przed przystąpieniem do dalszych czynności, aby uniknąć denaturacji termicznej bufora oksydazy glukozy.Gdy roztwór żelatyny o niskiej temperaturze topnienia osiągnie 37 stopni Celsjusza, przygotuj bufor STORM, dodając 100 milimolarów merkaptоетиламина i bufora oksydazy glukozy do żelatyny o niskiej temperaturze topnienia, aby osiągnąć końcową stężoną 1X i delikatnie wymieszać roztwór. Zdeponuj 10 mikrolitrów mieszanki jąder na 1,5H pokrywce traktowanej ozonem, która została traktowana przez 20 minut w systemie czyszczenia ozonowego ultrafioletowym. Poczekaj trzy minuty, aby jądra osiadły na pokrywce.Następnie usuń nadmiar płynu i poczekaj dwie minuty. Dodaj 10 mikrolitrów przygotowanej żelatyny o niskiej temperaturze topnienia do pokrowca i natychmiast przykryj szklanym slajdkiem. Uszczelń pokrowca używając uszczelki silikonowej.Wymieszaj równe ilości roztworu A i roztworu B w małej kryształce Petriego za pomocą końcówki mikropipety. Nałóż mieszaninę na krawędzie pokrowca, aby uszczelnić próbkę. Pozostaw uszczelnić silikonowe przez pięć minut.Zamontuj slajd próbki na mikroskopie i znajdź ostrość. Znajdź i skup się na jądrze. Aktywuj moduł utrzymujący ostrość, jeśli jest dostępny, aby zapewnić stabilność podczas długiego nabywania.Wybierz obszar, w którym jedno lub kilka nanodiamentów są usytuowane w pobliżu jądra, aby poprawić korekcję dryftu podczas rekonstrukcji. W przypadku dwukolorowego obrazu zacznij nabywanie z dłuższej fali kanału, a następnie prze

a-streamlined-protocol-for-single-molecule-localization-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oszczędny protokół mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Ten protokół immunolokalizacji w męskich mejocytach kukurydzy zachowuje trójwymiarową integralność komórek podczas mejozy. Umożliwia dynamiczne śledzenie lokalizacji wewnątrzkomórkowej do trzech niezależnych przeciwciał w zachowanym materiale utrwalonym paraformaldehydem, oprócz DAPI, które barwi DNA.

Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj uproszczony protokół mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek dSTORM w jądrach Arabidopsis thaliana. Ta metoda umożliwia nanorozdzielcze wizualizowanie organizacji chromatyny i epigenetyki.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Przeglądaj więcej filmów