Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis
8 maja 2026
Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.
Moje badania koncentrują się na edycji epigenomu i wizualizacji organizacji chromatyny w jądrach Arabidopsis za pomocą mikroskopii super rozdzielczej. Istniejące metody nie są przystosowane do obrazowania STORM. Ten protokół poprawia czystość jąder, spójność oznaczeń, montaż próbki i stabilność obrazu.
Dotyczy Arabidopsis thaliana i innych systemów roślinnych do badania organizacji jądra, struktury chromatyny i epigenetyki z wysoką rozdzielczością. Na początek umieść sześcio-dołkową płytkę hodowlaną na lodzie pod kapturą chemiczną. Wymieszaj roztwór fiksujący zawierający 4% objętościowo metanol, stabilizowane formaldehyd 0,1% Triton X100 i PBS.
Dodaj około cztery mililitry lodowatego roztworu fiksującego do każdego dołka pod kapturą chemiczną. Za pomocą czystych kleszczy usuń sadzonki Arabidopsis, które mają od ośmiu do 15 dni po kiełkowaniu z pół-silnego pożywki Murashige i Skoog, lub pożywki MS. Natychmiast zanurz sadzonki w roztworze fiksującym i umieść około 20 sadzonek na dołek.
Użyj trzech dołków, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału na próbkę. Umieść płytkę w komorze próżniowej wypełnionej lodem i zamknij ją. Zastosuj próżnię oscylującą między minus 0,6 bara a minus 0,8 bara przez 15 minut, aby usunąć uwięzione powietrze i pozwolić na głębokie wnikanie utwardzacza do tkanek roślinnych.
Następnie powoli zwolnij próżnię. Wymieszaj próbkę i zastosuj próżnię przez kolejne 15 minut. Pod kapturą chemiczną usuń roztwór fiksujący pipetą.
Przepłucz każdy dołek trzy razy po 10 minut każdy pod delikatnym agitowaniem za pomocą pięciu mililitrów lodowego PBS. Po przepłukaniu usuń PBS. Za pomocą kleszczy przenieś fiksowaną tkankę do 120 na 120 milimetrowej kryształki Petriego i dodaj 50 mikrolitrów buforu izolację jąder do fiksowanych sadzonek.
Za pomocą ostrza pokroić fiksowaną tkankę. Za pomocą tego samego ostrza zeskrobać pokrojoną tkankę na jedną krawędź kryształki Petriego. Dodać 600 mikrolitrów buforu izolacji jąder i przepłukać ewentualne tkanki przywierające do ostrza.
Przenieść zawiesinę tkankową do dwumilimetrowej tubki homogenizatora Dounce i przetrzyj pięć do dziesięciu razy mniejszym tłączkiem. Następnie przetrzyj większym tłączkiem, aż się gładko porusza wewnątrz tubki, zazwyczaj wymagając pięciu do dziesięciu ruchów. Przefiltruj homogenizowaną próbkę przez filtr o oczku 30 mikrometrów do 50-mililitrowej tubki.
Przenieś filtrate do nowej 1,5-mililitrowej tubki. Wiruj zawiesinę przez 10 minut przy 800G przy najniższym rampie zarówno do przyspieszenia, jak i spowolnienia. Po wirowaniu zauważ, że mała biała bryła jest widoczna wśród zielonych resztek tkanki.
Odłóż nadstan i ponownie zawieś bryłę w 600 mikrolitrach buforu izolacji jąder. Wiruj ponownie przez 10 minut przy 800G i odłóż nadstan. Po całkowitym usunięciu zielonych resztek przechowuj zawiesinę izolowanych jąder w czterech stopniach Celsjusza przez maksymalnie jeden tydzień i przeprowadź immunobarwienie jąder za pomocą pożądanych przeciwciał.
Podgrzej 1,5% roztwór żelatyny o niskiej temperaturze topnienia w 90 stopniach Celsjusza przez jedną minutę, aby rozpuścić proszek i uzyskać klarowny roztwór. Skręć krótko, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Schłodź roztwór i utrzymuj go w 37 stopniach Celsjusza przed przystąpieniem do dalszych czynności, aby uniknąć denaturacji termicznej bufora oksydazy glukozy.
Gdy roztwór żelatyny o niskiej temperaturze topnienia osiągnie 37 stopni Celsjusza, przygotuj bufor STORM, dodając 100 milimolarów merkaptоетиламина i bufora oksydazy glukozy do żelatyny o niskiej temperaturze topnienia, aby osiągnąć końcową stężoną 1X i delikatnie wymieszać roztwór. Zdeponuj 10 mikrolitrów mieszanki jąder na 1,5H pokrywce traktowanej ozonem, która została traktowana przez 20 minut w systemie czyszczenia ozonowego ultrafioletowym. Poczekaj trzy minuty, aby jądra osiadły na pokrywce.
Następnie usuń nadmiar płynu i poczekaj dwie minuty. Dodaj 10 mikrolitrów przygotowanej żelatyny o niskiej temperaturze topnienia do pokrowca i natychmiast przykryj szklanym slajdkiem. Uszczelń pokrowca używając uszczelki silikonowej.
Wymieszaj równe ilości roztworu A i roztworu B w małej kryształce Petriego za pomocą końcówki mikropipety. Nałóż mieszaninę na krawędzie pokrowca, aby uszczelnić próbkę. Pozostaw uszczelnić silikonowe przez pięć minut.
Zamontuj slajd próbki na mikroskopie i znajdź ostrość. Znajdź i skup się na jądrze. Aktywuj moduł utrzymujący ostrość, jeśli jest dostępny, aby zapewnić stabilność podczas długiego nabywania.
Wybierz obszar, w którym jedno lub kilka nanodiamentów są usytuowane w pobliżu jądra, aby poprawić korekcję dryftu podczas rekonstrukcji. W przypadku dwukolorowego obrazu zacznij nabywanie z dłuższej fali kanału, a następnie prze
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This article introduces a streamlined and reproducible protocol for Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), specifically direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), to visualize chromatin architecture in nuclei isolated from Arabidopsis thaliana. The workflow addresses technical challenges in plant sample preparation, enabling nanoscale imaging of chromatin domains, histone modifications, and nuclear organization with enhanced clarity and reproducibility.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Super-resolution microscopy
- Chromatin organization
Background
- Confocal fluorescence microscopy is limited by diffraction, restricting resolution in chromatin studies.
- Super-resolution techniques like SMLM overcome these limitations, providing nanoscale insights.
- dSTORM is widely used in mammalian systems but less so in plants due to sample preparation challenges.
- Improved protocols are needed to facilitate SMLM in plant nuclei.
Purpose of Study
- To develop a reproducible workflow for SMLM imaging of plant nuclei.
- To enable high-resolution visualization of chromatin modifications and nuclear architecture in Arabidopsis thaliana.
- To lower technical barriers for applying super-resolution microscopy in plant biology.
Methods Used
- Fixation of Arabidopsis seedlings to preserve nuclear morphology.
- Gentle tissue chopping and centrifugation to enrich for intact nuclei.
- Fluorophore labeling of isolated nuclei in liquid medium.
- Immobilization of nuclei on low-melting agarose pads for imaging stability.
Main Results
- The protocol minimizes background fluorescence and improves labeling consistency.
- Enhanced reproducibility is achieved across biological replicates.
- Preparations allow clear visualization of chromatin modifications and nuclear architecture at the nanoscale.
- The workflow facilitates studies of epigenetic regulation and nuclear topology in plants.
Conclusions
- This protocol establishes a methodological foundation for SMLM imaging in plant systems.
- It bridges the gap between plant and mammalian cell biology in super-resolution imaging.
- The approach opens new opportunities to study genome regulation and nuclear architecture in response to developmental and environmental cues in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of chromatin architecture in plant nuclei addresses a critical gap in understanding epigenetic regulation and nuclear organization at the nanoscale. This streamlined SMLM protocol for Arabidopsis nuclei enables reproducible, high-resolution visualization, supporting predictive confidence in chromatin state analysis. The approach enhances early discovery and mechanistic de-risking for plant-based R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables nanoscale interrogation of chromatin domains and histone modifications in plant nuclei.
- Supports functional validation of epigenetic targets by visualizing nuclear architecture changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of chromatin organization.
- Improves predictive confidence in linking nuclear structure to gene regulation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible super-resolution imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-clarity readouts of chromatin modifications for assay development.
- Enables consistent labeling and imaging across biological replicates, supporting screening scalability.
- Prepares validated plant nuclear systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin imaging outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying nuclear topological changes under different conditions.
- Provides mechanistic insights relevant to environmental and developmental response studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early chromatin hypothesis testing to preclinical validation of epigenetic mechanisms in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of chromatin organization and nuclear architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of chromatin modifications and nuclear features for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling biomarker alignment in plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse plant research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in chromatin state analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for epigenetic target programs in plant R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and plant nuclear isolation.
- Needs access to dSTORM-capable imaging platforms and fluorophore labeling reagents.
- Demands cross-team standardization of fixation, labeling, and immobilization protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Sample stability and background minimization are critical for reproducible outputs.
