Name: Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-23T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę izolacji małych zewnątrzkomórkowych wezykuł z mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przy użyciu chromatografii wykluczającej na podstawie wielkości. Protokół zapewnia wysoką czystość i powtarzalność wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jennie Yang, Dariuszowi Żurawekowi i Wołodymyrowi Yerko za pomoc techniczną i pomocne dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Centrum Zastosowań Nanomedycyny, w szczególności Nadimowi Tawil i Laurze Montermini, za wsparcie w charakterystyce pęcherzyków pozakomórkowych i pozyskiwaniu danych. Dziękujemy również pracownikom obiektu dla zwierząt, Guylaine Gadoury i Tarze Thomson, za pomoc w obsłudze myszy.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill (DOUG10029) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Protokół izolacji sEV pochodzących ze SkM (SkM-sEV)
<ol>
	<li>Pobieranie próbek i dysocjacja tkanki
	<ol>
		<li>Zbiór tkanki i jej zachowanie
		<ol>
			<li>Nastawić tkankę SkM natychmiast po wycięciu poprzez zanurzenie jej w wstępnie schłodzonym metylbutanie. 
			UWAGA:   Aby przygotować schłodzone metylbutan, umieść pojemnik z metylbutanem w kąpieli z suchego lodu i stopniowo dodaj małe kawałki suchego lodu bezpośrednio do płynu. Pozostaw roztwór do schłodzenia, temperatura wynosi zazwyczaj od −70°C do −80°C. Utrzymuj metylbutan w kąpieli z suchym lodem podczas użytkowania, aby zachować temperaturę. Zanurz tkankę na około 3–4 s, aż do pełnego zamrożenia, co wynika z całkowitego stwardnienia tkanki i utraty elastyczności.</li>
			<li>Przenieś tkankę do cryoviali.</li>
			<li>Umieść próbki na suchym lodzie. 
			UWAGA: Przechowuj próbki w temperaturze −80°C do dalszego przetwarzania. Unikaj wielokrotnego mrożenia i rozmrażania. Szybkie zamrażanie natychmiastowe skutecznie zachowuje EV, gdy próbki są odpowiednio uszczelnione. Może nastąpić odwodnienie lub uszkodzenie wezyku, jeśli tkanki pozostają odsłonięte lub przejdą wiele cykli mrożenia i rozmrażania13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dysocjacja tkanki 
		​UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w skafandrze biobezpieczeństwa przy użyciu sterylnych narzędzi i rękawic, aby zapobiec zanieczyszczeniu, które może w inny sposób naruszyć czystość EV.
		<ol>
			<li>Ważenie tkanki
			<ol>
				<li>Wysterylizuj szczypce z 70% etanolu i pozostaw je do osuszenia na powietrzu.</li>
				<li>Przenieś zamrożoną tkankę na wstępniezważoną miseczkę do hodowli zawiesinowej.</li>
				<li>Waż tkankę za pomocą wagi miligramowej (zazwyczaj ~80–120 mg na próbkę, w zależności od wieku i płci myszy). 
				UWAGA: Protokół jest zweryfikowany dla mas początkowych tkanki w zakresie ~80–120 mg. Dla próbek w tym zakresie stosuj objętości reagentów określone w Krokach 1.2.3.1, 1.3.1.3 i 1.3.2.1 bez zmian. Dla próbek spoza tego zakresu skaluj wszystkie objętości reagentów proporcjonalnie do masy tkanki, zachowując zweryfikowany stosunek RPMI-1640, kolagenazy D i DNAzy I (1000:40:4 µL na 100 mg tkanki). To odpowiada około 10 µL RPMI-1640, 0,4 µL kolagenazy D (100 mg/mL pojemność) i 0,04 µL DNAzy I (20 000 U/mL pojemność) na mg tkanki. Zachowaj te proporcje, aby zachować końcowe stężenia enzymów w reakcji. Skuteczność trawienia i wydajność EV powinny być empirycznie zweryfikowane, gdy pracuje się znacznie poza zakresem 80–120 mg.</li>
				<li>Przenieś próbkę do wstępnie schłodzonej epruwetki i trzymaj ją na lodzie.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przygotowanie enzymów
			<ol>
				<li>Odtaw alikwoty kolagenazy D (100 mg/mL pojemność) i DNAzy I (20 000 U/mL pojemność) na lodzie (patrz Plik uzupełniający 1, Krok 1.4 w celu przygotowania pojemności enzymów). Te enzymy są dodawane w Kroku 1.3.2.1, aby osiągnąć końcowe stężenia w reakcji 3,8 mg/mL kolagenazy D i 77 U/mL DNAzy I. Końcowa objętość trawienia wynosi 1,044mL.</li>
				<li>Delikatnie wymieszaj DNAzę I przez inwersję. Nie mieszaj wirtualnie.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przygotowanie tkanki do trawienia
			<ol>
				<li>Dodaj 800 µL RPMI-1640 do sterylnej miseczki do hodowli zawiesinowej umieszczonej na lodzie.</li>
				<li>Przenieś tkankę do miseczki.</li>
				<li>Przeciąć tkankę na 6–8 kawałków o mniej więcej jednolitej wielkości (2–3 mm na stronę) za pomocą sterylnej jednorazowej sztyletu. Ustabilizuj tkankę sterylnymi kleszczami podczas cięcia, aby zapewnić równomierne rozdrobnienie. Zakończ ten krok w ciągu 1 min/próbki, aby zachować spójność między próbkami.</li>
				<li>Przez cały proces trzymaj miseczkę na lodzie, aby zminimalizować degradację.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenoszenie tkanki i trawienie enzymatyczne
		<ol>
			<li>Przenoszenie tkanki
			<ol>
				<li>Przytnij koniec sterylnej końcówki pipety P1000 za pomocą sterylnej ostrza, aby uzyskać otwór o średnicy 2–3 mm, wystarczający do swobodnego przej

<ol>
	<li>Whitham, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+provide+a+means+for+tissue+crosstalk+during+exercise.">Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise.</a> Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).</li><li>Kumar, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+tools+and+targets+in+therapy+for+diseases.">Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 27 (2024).</li><li>Fonseka, P., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+biogenesis,+cargo+sorting+and+implications+in+disease+conditions.">Extracellular vesicles biogenesis, cargo sorting and implications in disease conditions.</a> Cells. 12 (2), (2023).</li><li>Taraboletti, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioavailability+of+VEGF+in+tumor-shed+vesicles+depends+on+vesicle+burst+induced+by+acidic+pH.">Bioavailability of VEGF in tumor-shed vesicles depends on vesicle burst induced by acidic pH.</a> Neoplasia. 8 (2), 96-103 (2006).</li><li>Dakup, P. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+state-of-the-art+proteomics+analysis+for+biomarker+development+from+plasma+extracellular+vesicles.">Challenges and opportunities in state-of-the-art proteomics analysis for biomarker development from plasma extracellular vesicles.</a> Proteomics. , (2025).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-origin:+Enumerating+the+tissue-cellular+origin+of+circulating+extracellular+vesicles+using+exLR+profile.">EV-origin: Enumerating the tissue-cellular origin of circulating extracellular vesicles using exLR profile.</a> Comput Struct Biotechnol J. 18, 2851-2859 (2020).</li><li>Shero, J. A., Lindholm, M. E., Sandri, M., Stanford, K. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+a+mediator+of+interorgan+crosstalk+during+exercise:+Implications+for+aging+and+obesity.">Skeletal muscle as a mediator of interorgan crosstalk during exercise: Implications for aging and obesity.</a> Circ Res. 136 (11), 1407-1432 (2025).</li><li>Vanhie, J. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exercise-+and+high-fat+diet-induced+bone+marrow+extracellular+vesicles+in+stress+hematopoiesis.">The role of exercise- and high-fat diet-induced bone marrow extracellular vesicles in stress hematopoiesis.</a> Front Physiol. 13, 1054463 (2022).</li><li>Pinto, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+therapeutic+potential+of+contracting+skeletal+muscle-released+extracellular+vesicles+in+cancer:+Current+insights+and+future+directions.">Exploiting the therapeutic potential of contracting skeletal muscle-released extracellular vesicles in cancer: Current insights and future directions.</a> J Mol Med (Berl). 102 (5), 617-628 (2024).</li><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+(MISEV2023):+From+basic+to+advanced+approaches.">Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).</li><li>De Sousa, K. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+future+directions+in+diagnosis+and+therapy.">Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy.</a> Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835 (2023).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications.">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145 (2021).</li><li>Ahmadian, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+storage+and+freezing+protocols+for+extracellular+vesicles:+A+systematic+review.">Different storage and freezing protocols for extracellular vesicles: A systematic review.</a> Stem Cell Res Ther. 15 (1), 453 (2024).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+releases+extracellular+vesicles+with+distinct+protein+and+microRNA+signatures+that+function+in+the+muscle+microenvironment.">Skeletal muscle releases extracellular vesicles with distinct protein and microRNA signatures that function in the muscle microenvironment.</a> PNAS Nexus. 1 (4), pgac173 (2022).</li><li>Magalhaes-Gama, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+cell-derived+extracellular+vesicles+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+pediatric+patients:+Proof-of-concept+study.">Exploring cell-derived extracellular vesicles in peripheral blood and bone marrow of B-cell acute lymphoblastic leukemia pediatric patients: Proof-of-concept study.</a> Front Immunol. 15, 1421036 (2024).</li><li>Potter, D. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+attenuate+pulmonary+vascular+permeability+and+lung+injury+induced+by+hemorrhagic+shock+and+trauma.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate pulmonary vascular permeability and lung injury induced by hemorrhagic shock and trauma.</a> J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 245-256 (2018).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Org Biomol Chem. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Kim, T., Hong, J. W., Lee, L. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+methods+of+isolation+and+purification+of+extracellular+vesicles.">Efficient methods of isolation and purification of extracellular vesicles.</a> Nano Converg. 12 (1), 45 (2025).</li><li>Bracht, J. W. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+size-exclusion+chromatography+column+affects+recovery,+purity,+and+miRNA+cargo+analysis+of+extracellular+vesicles+from+human+plasma.">Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma.</a> Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).</li><li>Mo, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-mediated+bidirectional+communication+between+the+liver+and+other+organs:+Mechanistic+exploration+and+prospects+for+clinical+applications.">Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications.</a> J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).</li></ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ten protokół opisuje solidne i możliwe do powtórzenia podejście do izolowywania preparatów wzbogaconych w sEV bezpośrednio z SkM i BM, dwóch tkanek o niskiej wydajności i wysokiej heterogeniczności. Podczas gdy izolowanie EV jest dobrze ustalone dla płynów biologicznych i układów hodowli komórkowych, standaryzowane metody do izolowania EV pochodzących z tkanek są ograniczone z powodu wyzwań związanych z dysocjacją tkanki, zanieczyszczeniem materiałem wewnątrzkomórkowym i zmiennością wydajności. Przedstawiamy tu kluczowe ...

Małe pęcherzyki pozakomórkowe (sEV) to nanoskopowe, związane z lipidami cząstki, które pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez przenoszenie białek, lipidów i kwasów nukleinowych1. Są uwalniane przez wszystkie typy komórek i występują praktycznie we wszystkich płynach biologicznych, gdzie pełnią funkcję kluczowych nośników aktywnych biologicznie ładunków, w tym peptydów i mikro rybonukleinowych kwasów nukleinowych (RNA)2. Ich ładunek jest selektywnie sortowany, umożliwiając precyzyjne dostarczanie określonych sygnałów3, a ich pęcherzykowa struktura pozwala im omijać typowe gradienty i ograniczenia rozcieńczania czynników wydzielania swobodnego, dostarczając skoncentrowane ładunki molekularne na duże odległości4. Chociaż pęcherzyki pozakomórkowe z płynów biologicznych (np. osocza, surowicy i śliny) zapewniają wygodny przekrój układowej sygnalizacji, reprezentują wysoce mieszaną populację pochodzącą z wielu tkanek5. Powoduje to trudności w określeniu, która tkanka produkuje określony sygnał biologiczny lub jak komunikacja pęcherzyków pozakomórkowych jest regulowana na poziomie tkankowym. Ponieważ krążące pęcherzyki są łączone razem, zmiany specyficzne dla tkanki mogą być rozcieńczane lub maskowane, ograniczając zdolność do zidentyfikowania prawdziwego źródła sygnałów6.
Mięśnie szkieletowe (SkM) i szpik kostny (BM) to główne metabolicznie i funkcjonalnie aktywne tkanki o odrębnych składach komórkowym i rolach sygnalizacyjnych7,8. Obie tkanki mogą wydzielać populacje pęcherzyków pozakomórkowych wzbogacone o unikalne, specyficzne dla tkanki ładunki; jednak te sygnały mogą być łatwo przytłumione w osoczu przez pęcherzyki z tkanek o wysokim obrocie, takich jak komórki układu odpornościowego8,9. Bezpośrednie izolacja pęcherzyków pozakomórkowych z mięśni lub szpiku kostnego zwiększa czułość i umożliwia wykrycie subtelnych, specyficznych dla tkanki adaptacji, które mogą nie być obserwowalne w krążeniu. Pęcherzyki pozakomórkowe pochodzące z tkanek dostarczają zatem istotnych uzupełniających informacji, ujawniając, kiedy określony narząd uwalnia pęcherzyki pozakomórkowe, jak długo te sygnały utrzymują się i jakie adaptacje są ostre w porównaniu z przewlekłymi. Pomimo rosnącego zainteresowania pęcherzykami pozakomórkowymi, większość uznanych metod izolacją została opracowana dla płynów biologicznych (np. osocza i surowicy) lub systemów hodowlany komórek. W tych kontekstach pęcherzyki pozakomórkowe można uzyskać z stosunkowo wysoką wydajnością i minimalnymi zaburzeniami strukturalnymi. Jednak izolowanie pęcherzyków pozakomórkowych bezpośrednio z tkanek stałych, takich jak SkM i BM, stanowi znaczne wyzwania techniczne. Te tkanki są strukturalnie złożone i heterogeniczne, wymagając mechanicznych lub enzymatycznych etapów dysocjacji, które mogą wprowadzać artefakty, w tym wysokie poziomy białek rozpuszczalnych, fragmentów organelli i niepęcherzykowych nanocząstek, utrudniając osiągnięcie wysokiej czystości przygotowania pęcherzyków pozakomórkowych.
Kolejnym dużym wyzwaniem w izolowaniu pęcherzyków pozakomórkowych pochodzących z tkanek jest brak znormalizowanych procesów pracy dla definicji i separacji frakcji10. Samo różnicowe wirowanie często prowadzi do współizolowania agregatów białek i dużych pęcherzyków, podczas gdy metody oparte na ultrawirowaniu, choć szeroko stosowane, mogą prowadzić do agregacji, deformacji pęcherzyków i zmiennej wydajności w zależności od typu wirnika i warunków eksperymentalnych. Podejścia oparte na gradiencie gęstości poprawiają czystość, ale są czasochłonne, o niskiej wydajności i trudne do standaryzacji między laboratoriami11. W związku z tym obecnie nie ma powszechnie przyjętej, powtarzalnej metody zoptymalizowanej do izolowywania małych pęcherzyków pozakomórkowych z tkanek stałych o wysokiej czystości i spójnej wydajności10.
Chromatografia wykluczania rozmiarowego (SEC) stała się obiecującą alternatywą dla izolowywania pęcherzyków pozakomórkowych, ponieważ oddziela cząstki na podstawie wielkości bez poddawania pęcherzyków wysokim siłom odśrodkowym. SEC umożliwia efektywne oddzielenie małych pęcherzyków pozakomórkowych od białek rozpuszczalnych i zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej, zachowując integralność i funkcję biologiczną pęcherzyków. Co ważne, SEC umożliwia jasne zdefiniowanie frakcji elucji, umożliwiając powtarzalne identyfikowanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki pozakomórkowe i poprawioną spójność w eksperymentach12. Jednak procesy SEC wymagają starannej optymalizacji dla próbek pochodzących z tkanek, szczególnie w odniesieniu do wstępnego przetwarzania tkanek, usuwania zanieczyszczeń i zbierania frakcji. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, opracowałeśmy zoptymalizowany i znormalizowany protok

<table><tbody><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>Ogólnowykorzystywany rurek mikrowirówkowy w protokole</td></tr><tr><td>1.5 mL low-protein-binding tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td>Stosowany do manipulacji EV, pobierania frakcji SEC i przechowywania</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-262</td><td>Stosowany w setupie do pobierania szpiku kostnego</td></tr><tr><td>16 G needle</td><td>BD</td><td>305197</td><td>Stosowany do przekłuwania 0.2 mL PCR tube</td></tr><tr><td>30 &micro;m cell strainer</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-458</td><td>Stosowany do filtracji próbek mięśni szkieletowych</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.11727</td><td>Stosowany do sterylizacji szczypiec</td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stosowany do bezpiecznego pobierania tkanek</td></tr><tr><td>Bone cutting instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-001-976</td><td>Stosowany do oddzielania kości udowej i piszczelowej i ekspozycji szpiku</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>Stosowany do blokowania w blotowaniu Western i rozcieńczania przeciwciał</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&middot;2H2O)</td><td>BioShop</td><td>CCL302</td><td>Stosowany do przygotowania bufora HEPES</td></tr><tr><td>Carbon-coated copper grid, 200-mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>930342</td><td>Stosowany do przygotowania próbek TEM</td></tr><tr><td>Centrifugal filter, 100 kDa MWCO</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC810096</td><td>Stosowany do koncentracji EV</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td>Stosowany do enzymatycznej digestii mięśni szkieletowych</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>Stosowany do przechowywania tkanek i kości</td></tr><tr><td>Deionized water (ultrapure)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stosowany do przygotowywania buforów i kroków mycia TEM</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>Stosowany do enzymatycznej digestii mięśni szkieletowych</td></tr><tr><td>Dry ice</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stosowany do chłodzenia i transportu próbek</td></tr><tr><td>Enhanced chemiluminescence substrate</td><td>Biorad</td><td>1705061</td><td>Stosowany do detekcji blotów Western</td></tr><tr><td>Filter unit, 0.22 &micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.3941.501</td><td>Stosowany do filtrowania PBS, gdy ma to zastosowanie</td></tr><tr><td>Forceps / tweezers</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3892</td><td>Stosowany do pobierania tkanek</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stosowany do fiksacji TEM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stosowany w krokach mycia siatki TEM</td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>Stosowany do przygotowywania stocku DNase I</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500</td><td>Stosowany do przygotowania bufora HEPES-NaOH</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>S911</td><td>Stosowany do detekcji blotów Western</td></tr><tr><td>Imaging system for chemiluminescence</td><td>Biorad</td><td>12003153</td><td>Stosowany do wykonywania obrazów membran blotów Western</td></tr><tr><td>KCl</td><td>BioShop</td><td>POC308</td><td>Stosowany do przygotowania bufora HEPES</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl2)</td><td>BioShop</td><td>MAG510.500</td><td>Stosowany do przygotowania bufora HEPES</td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Thermo Fisher</td><td>78-78-4</td><td>Stosowany do nagłego zamrażania mięśni szkieletowych</td></tr><tr><td>Milligram balance</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z741359</td><td>Stosowany do ważenia tkanek i szpiku</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD004.1</td><td>Stosowany do przygotowania bufora HEPES</td></tr><tr><td>Nano-particle tracking analysis instrument</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td>NanoSight NS300 stosowany do wyznaczania rozmiarów i liczenia cząstek</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY500.500</td><td>Stosowany do regulacji pH</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>BioRad</td><td>1704271</td><td>Stosowany do transferu blotów Western</td></tr><tr><td>Nutating mixer</td><td>Labnet</td><td>&nbsp;S0500</td><td>Stosowany podczas digestii enzymatycznej</td></tr><tr><td>P1000 pipette</td><td>MilliporeSigma</td><td>FA10006M-1EA</td><td>Stosowany do przenoszenia tkanek</td></tr><tr><td>Pipette tip, 1 mL</td><td>Sarstedt</td><td>70.3050.275</td><td>Końcówka została przycięta, aby poszerzyć otwór do przenoszenia fragmentów tkanek</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Wisent</td><td>INC 811.012-FL</td><td>Stosowany w całym protokole; również używany do równoważenia i elucji SEC</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor</td><td>MilliporeSigma</td><td>4906845001</td><td>Stosowany do przygotowania lizatów do blotów Western</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS351146</td><td>Stosowany do przygotowania szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Polyacrylamide gel, 4&ndash;20% gradient stain-free</td><td>BioRad</td><td>4561094</td><td>Stosowany do separacji blotów Western</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>MilliporeSigma</td><td>11697498001</td><td>Stosowany do przygotowania lizatów do blotów Western</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388-500ML</td><td>Nie suplementowany; bez FBS ani antybiotyków</td></tr><tr><td>RIPA buffer, 10&times;</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td>Stosowany do ekstrakcji białek do blotów Western</td></tr><tr><td>Scalpel, sterile disposable</td><td>Ultident Paragon</td><td>02-90000-10</td><td>Stosowany do krojenia tkanki mięśni szkieletowych</td></tr><tr><td>SEC column, original 70 nm</td><td>IZON</td><td>ICO70P</td><td>Stosowany do SEC mięśni szkieletowych</td></tr><tr><td>SEC column, single 70 nm</td><td>IZON</td><td>ICS70P</td><td>Stosowany do SEC sz

izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Isolation of Small Extracellular Vesicles from Murine Skeletal Muscle and Bone Marrow by Size-Exclusion Chromatography

Małe zewnątrzkomórkowe wezykuły (sEVs) to nanoskalowe, związane z lipidami cząstki, które pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transfer białek, lipidów i kwasów rybonukleinowych (RNA). Izolowanie sEVs z tkanek stałych, takich jak mięsień szkieletowy (SkM) i szpik kostny (BM), pozostaje wyzwaniem ze względu na niski wydajność i skażenie niewezykularnymi składnikami. Ten protokół opisuje reprodukowalny proces izolacji sEVs z mysiego SkM i BM. SkM jest trawiony enzymatycznie, podczas gdy BM jest przetwarzany bezpośrednio, a następnie poddawany różnicowemu wirowaniu i chromatografii wykluczającej wielkość (SEC). W przypadku SkM, objętość próżni (~2,5 mL) jest odrzucana, a następnie zbiera się kolejne ~1,6 mL jako frakcje wzbogacone w EV, zazwyczaj podzielone na sekwencyjne frakcje po 400 µL (F1–F4). W przypadku BM, odrzucana jest objętość próżni 700 µL, a następnie zbiera się frakcję wzbogaconą w EV o objętości ~850 µL, którą można podzielić na sekwencyjne frakcje po ~170 µL (F1–F5) i zespolić w oparciu o wzbogacenie markerem EV. Stosując tę metodę, sEVs można odizolować z małych objętości tkanki (około 500 µL z pojedynczego czworogłowego uda i 150 µL z zespolonego szpiku BM z kości udowej i piszczelowej), uzyskując około 108 cząstek·mL−1·mg−1 tkanki, przy średnicy cząstek przeważnie mniejszej niż 200 nm. Integralność wezykuł i ich czystość są walidowany za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, analizy nanocząstek oraz techniki Western blot do wykrycia kanonicznych markerów EV, z dodatkową charakteryzacją poprzez wykrywanie interferencyjne pojedynczych cząstek w celu ilościowego określenia podpopulacji wezykuł zdefiniowanych przez tetraspaniny. Ta metoda umożliwia reprodukowalne izolację wysokiej czystości sEVs ze skomplikowanej strukturalnie tkanki przy minimalnym materiale wejściowym, wspierając dalsze molekularne i funkcjonalne analizy wezykuł pochodzenia tkankowego.

Aby ocenić skuteczność niniejszego protokołu izolacji sEV pochodzących z tkanek, przedstawiono reprezentatywne wyniki z próbek SkM i BM. Pomyślną izolację zdefiniowano poprzez (i) wzbogacenie o kanoniczne markery EV (TSG101, CD63, CD81 i CD9) we wczesnych frakcjach SEC, (ii) minimalną detekcję zanieczyszczeń wewnątrzkomórkowych (np. Calnexin i BiP), (iii) unimodalny rozkład wielkości cząstek, w którym większość cząstek ma rozmiar &lt;200 nm, (iv) wizualizację nienaruszonych pęcherzyków ograniczonych błoną za pomocą TEM o...

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Small extracellular vesicles (sEVs) are nanosized, lipid-bound particles that mediate intercellular communication through the transfer of proteins, ...

Nasze badania koncentrują się na izolowaniu małych zewnątrzkomórkowych wezykuł z mysiej tkanki mięśniowej i rdzenia kostnego, aby zrozumieć, jak tkanki wymieniają sygnały. Ten protokół może być zastosowany w badaniach dotyczących starzenia, regeneracji mięśni, fizjologii ćwiczeń oraz badań patofizjologicznych rdzenia kostnego w modelach mysich. Aby rozpocząć, umieść próbki kości udowej i piszczelowej myszy w szafie biobezpieczeństwa.Waż i oznacz 1,5-mililitowe probówki do wirówki. Następnie przekłuj dno probówki 0,2-mililitrowej sterylną igłą 16-kalibrową prostopadle do podstawy, tworząc pojedyncze jednolite otwory. Włóż przekłutą probówkę do ważonej wcześniej probówki 1,5-mililitrowej z dopasowanym ściśle zamknięciem, aby przygotować ustawienie przekłutej probówki.Umieść kości z nóg w sterylnym naczyniu Petriego. Oddziel kości udowe i piszczelowe, przecinając przez przestrzeń stawową. Odetnij oba końce kości udowej i piszczelowej, aby odsłonić czerwony rdzeń kostny.Umieść kości w przekłutej probówce PCR, która znajduje się wewnątrz probówki 1,5-mililitrowej i uszczelń probówkę parafilmem. Wiruj próbkę przez 10 sekund w mikrowirówce stołowej przy około 8 000 g w temperaturze pokojowej. Zweryfikuj pomyślne wydobycie rdzenia przez obecność widocznie białych kości, pozbawionych pozostałości czerwonego rdzenia w górnej probówce i ciemnoczerwonego i zagęszczonego osiadku na dnie dolnej probówki.Następnie zmierzyć masę probówki 1,5-mililitrowej ponownie, aby określić masę wydobytego rdzenia i upewnić się, że znajduje się w przewidywanym zakresie około 15 do 30 miligramów na mysz. Dodaj 250 mikrolitrów RPMI 1640 do każdej probówki zawierającej rdzeń kostny i umieść próbki na lodzie. Resuspenduj rdzeń delikatnym pipetowaniem w górę i w dół 10 do 15 razy za pomocą pipety P1000, aż uzyskany zostanie jednorodny zawiesina bez pozostałości kęsów lub fragmentów tkanki.Wiruj próbkę przy 300 g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby osiadł się niestrawny osad, całe komórki i pozostałości fragmentów tkanki. Ostrożnie przenieś nadkład do nowej sterylnej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki, nie zaburzając osiadku. Wiruj przeniesiony nadkład przy 2 000 g przez 15 minut, aby usunąć duże zanieczyszczenia.Zbierz nadkład do nowej probówki i wiruj ponownie przy 10 000 g przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie zebrać co najmniej 200 mikrolitrów końcowego nadkładu do świeżej probówki. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej rozmiar, przepłukując ją sześcioma mililitrami przefiltrowanego PBS, utrzymując kolumnę i PBS w temperaturze pokojowej.Pozwól, aby cały objętość przepłynął przez kolumnę siłą grawitacji. Następnie załaduj 150 mikrolitrów przefiltrowanego nadkładu na kolumnę i pozwól, aby próbka wchodziła do żywicy całkowicie. Punkt końcowy osiąga się, gdy meniscus płynu osiąga powierzchnię łożyska żywicy bez widocznego pozostałego płynu nad mokrą żywicą.Natychmiast dodaj 550 mikrolitrów PBS, aby rozpocząć elucję i zebrać objętość wyłączną 700 mikrolitrów. Wyrzuć objętość wyłączną lub zachowaj ją jako frakcję niebędącą zewnątrzkomórkową wezykułą. Rozpocznij zbieranie frakcji wzbogaconej w zewnątrzkomórkowe wezykuły natychmiast po wypłynięciu 700-mikrolitrowej objętości wyłącznej.Upewnij się, że zebrano 850 mikrolitrów wzbogaconej w zewnątrzkomórkowe wezykuły elucjatu. Aby skoncentrować zewnątrzkomórkową wezykułę, załaduj próbkę do wstępnie przepłukanego filtru wirującego o ciężarze molekularnym 100 kilodalton. Wiruj próbkę przy 4 000 g w czterech stopniach Celsjusza, sprawdzając co dwie do trzech minut, aż osiągnięta zostanie żądana końcowa objętość.Następnie odzyskaj retentat przez delikatne pipetowanie. Przechowuj frakcje wzbogacone w zewnątrzkomórkowe wezykuły na lodzie do natychmiastowych badań, takich jak mikroskopowe badania elektronowe transmisyjne. Analiza Western blot wykazała obecność małych zewnątrzkomórkowych wezykuł, czyli SEV markerów we wczesnych frakcjach.Fracji od jednego do pięciu zostało połączonych w celu kolejnej charakteryzacji małych zewnątrzkomórkowych wezykuł. Brak sygnałów kalneksyny i białka wiązania immunoglobuliny w tych frakcjach wykluczył zanieczyszczenie przez błony wewnątrzkomórkowe i składniki siateczki endoplazmatycznej. Mikroskopia elektronowa frakcji wzbogaconych w SEV F1 do F5 ujawniła całe okrągłe wezykuły z jasno zdefiniowanymi warstwami dwubiwałowymi i średnicami poniżej 200 nanometrów.Analiza śledzenia nanocząstek połączonej próbki wykazała jednomodalny rozkład wielkości skupiony poniżej 200 nanometrów z średnim średnicą cząstek 147,8 nanometrów. Stężenie cząstek znormalizowane do masy tkanki było najwyższe w frakcjach wzbogaconych w SEV F1 do F5 przy 3,

isolation-small-extracellular-vesicles-from-murine-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

W tym filmie demonstrujemy technikę - chromatografię wykluczania wielkości - do oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV pochodzących od bakterii. Pęcherzyki te są sferycznymi strukturami o rozmiarach nano i są dzielone na duże i małe subpopulacje na podstawie ich wielkości za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół ma na celu izolację i oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) z tkanek mięśni gryzoni poprzez mechaniczne oderwanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Świadczy o spójności i niezawodności. Wyizolowane SkM-EV dostarczają informacji na temat homeostazy i chorób mięśni, z potencjalnymi zastosowaniami jako biomarkery diagnostyczne lub nośniki terapeutyczne.

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Poznaj metodę izolacji małych zewnątrzkomórkowych wezykuł z mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przy użyciu chromatografii wykluczającej na podstawie wielkości. Protokół zapewnia wysoką czystość i powtarzalność wyników.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Przeglądaj więcej filmów