Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości
23 czerwca 2026
Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.
Nasze badania koncentrują się na izolowaniu małych zewnątrzkomórkowych wezykuł z mysiej tkanki mięśniowej i rdzenia kostnego, aby zrozumieć, jak tkanki wymieniają sygnały. Ten protokół może być zastosowany w badaniach dotyczących starzenia, regeneracji mięśni, fizjologii ćwiczeń oraz badań patofizjologicznych rdzenia kostnego w modelach mysich. Aby rozpocząć, umieść próbki kości udowej i piszczelowej myszy w szafie biobezpieczeństwa.
Waż i oznacz 1,5-mililitowe probówki do wirówki. Następnie przekłuj dno probówki 0,2-mililitrowej sterylną igłą 16-kalibrową prostopadle do podstawy, tworząc pojedyncze jednolite otwory. Włóż przekłutą probówkę do ważonej wcześniej probówki 1,5-mililitrowej z dopasowanym ściśle zamknięciem, aby przygotować ustawienie przekłutej probówki.
Umieść kości z nóg w sterylnym naczyniu Petriego. Oddziel kości udowe i piszczelowe, przecinając przez przestrzeń stawową. Odetnij oba końce kości udowej i piszczelowej, aby odsłonić czerwony rdzeń kostny.
Umieść kości w przekłutej probówce PCR, która znajduje się wewnątrz probówki 1,5-mililitrowej i uszczelń probówkę parafilmem. Wiruj próbkę przez 10 sekund w mikrowirówce stołowej przy około 8 000 g w temperaturze pokojowej. Zweryfikuj pomyślne wydobycie rdzenia przez obecność widocznie białych kości, pozbawionych pozostałości czerwonego rdzenia w górnej probówce i ciemnoczerwonego i zagęszczonego osiadku na dnie dolnej probówki.
Następnie zmierzyć masę probówki 1,5-mililitrowej ponownie, aby określić masę wydobytego rdzenia i upewnić się, że znajduje się w przewidywanym zakresie około 15 do 30 miligramów na mysz. Dodaj 250 mikrolitrów RPMI 1640 do każdej probówki zawierającej rdzeń kostny i umieść próbki na lodzie. Resuspenduj rdzeń delikatnym pipetowaniem w górę i w dół 10 do 15 razy za pomocą pipety P1000, aż uzyskany zostanie jednorodny zawiesina bez pozostałości kęsów lub fragmentów tkanki.
Wiruj próbkę przy 300 g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby osiadł się niestrawny osad, całe komórki i pozostałości fragmentów tkanki. Ostrożnie przenieś nadkład do nowej sterylnej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki, nie zaburzając osiadku. Wiruj przeniesiony nadkład przy 2 000 g przez 15 minut, aby usunąć duże zanieczyszczenia.
Zbierz nadkład do nowej probówki i wiruj ponownie przy 10 000 g przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie zebrać co najmniej 200 mikrolitrów końcowego nadkładu do świeżej probówki. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej rozmiar, przepłukując ją sześcioma mililitrami przefiltrowanego PBS, utrzymując kolumnę i PBS w temperaturze pokojowej.
Pozwól, aby cały objętość przepłynął przez kolumnę siłą grawitacji. Następnie załaduj 150 mikrolitrów przefiltrowanego nadkładu na kolumnę i pozwól, aby próbka wchodziła do żywicy całkowicie. Punkt końcowy osiąga się, gdy meniscus płynu osiąga powierzchnię łożyska żywicy bez widocznego pozostałego płynu nad mokrą żywicą.
Natychmiast dodaj 550 mikrolitrów PBS, aby rozpocząć elucję i zebrać objętość wyłączną 700 mikrolitrów. Wyrzuć objętość wyłączną lub zachowaj ją jako frakcję niebędącą zewnątrzkomórkową wezykułą. Rozpocznij zbieranie frakcji wzbogaconej w zewnątrzkomórkowe wezykuły natychmiast po wypłynięciu 700-mikrolitrowej objętości wyłącznej.
Upewnij się, że zebrano 850 mikrolitrów wzbogaconej w zewnątrzkomórkowe wezykuły elucjatu. Aby skoncentrować zewnątrzkomórkową wezykułę, załaduj próbkę do wstępnie przepłukanego filtru wirującego o ciężarze molekularnym 100 kilodalton. Wiruj próbkę przy 4 000 g w czterech stopniach Celsjusza, sprawdzając co dwie do trzech minut, aż osiągnięta zostanie żądana końcowa objętość.
Następnie odzyskaj retentat przez delikatne pipetowanie. Przechowuj frakcje wzbogacone w zewnątrzkomórkowe wezykuły na lodzie do natychmiastowych badań, takich jak mikroskopowe badania elektronowe transmisyjne. Analiza Western blot wykazała obecność małych zewnątrzkomórkowych wezykuł, czyli SEV markerów we wczesnych frakcjach.
Fracji od jednego do pięciu zostało połączonych w celu kolejnej charakteryzacji małych zewnątrzkomórkowych wezykuł. Brak sygnałów kalneksyny i białka wiązania immunoglobuliny w tych frakcjach wykluczył zanieczyszczenie przez błony wewnątrzkomórkowe i składniki siateczki endoplazmatycznej. Mikroskopia elektronowa frakcji wzbogaconych w SEV F1 do F5 ujawniła całe okrągłe wezykuły z jasno zdefiniowanymi warstwami dwubiwałowymi i średnicami poniżej 200 nanometrów.
Analiza śledzenia nanocząstek połączonej próbki wykazała jednomodalny rozkład wielkości skupiony poniżej 200 nanometrów z średnim średnicą cząstek 147,8 nanometrów. Stężenie cząstek znormalizowane do masy tkanki było najwyższe w frakcjach wzbogaconych w SEV F1 do F5 przy 3,
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje powtarzalny schemat izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs) z tkanek mięśni szkieletowych (SkM) oraz szpiku kostnego (BM) myszy. Mięśnie SkM poddawane są trawieniu enzymatycznemu, natomiast szpik BM jest przetwarzany bezpośrednio, po czym następuje różnicowe wirowanie i chromatografia wykluczania cząsteczkowego (SEC) w celu uzyskania frakcji wzbogaconych w EV. Metoda ta umożliwia izolację sEV o wysokiej czystości z minimalnej ilości materiału tkankowego, co pozwala na przeprowadzenie dalszych analiz molekularnych i funkcjonalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
- Izolacja pęcherzyków specyficznych dla tkanki
- Charakterystyka nanocząsteczek
Wstęp
- sEVy pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transfer białek, lipidów i RNA.
- Izolacja sEVs z tkanek litych, takich jak SkM i BM, jest trudna ze względu na niską wydajność i zanieczyszczenia.
- Istniejące metody często wymagają dużych ilości materiału tkankowego i charakteryzują się brakiem powtarzalności.
- SEC jest skuteczną metodą oddzielania EV od zanieczyszczeń na podstawie wielkości.
- Walidacja czystości EV wymaga zastosowania wielu technik ortogonalnych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji sEV z mysich mięśni szkieletowych (SkM) i szpiku kostnego (BM).
- Minimalizacja wymagań dotyczących ilości tkanki przy jednoczesnej maksymalizacji wydajności i czystości.
- Zapewnienie standaryzowanego protokołu z wykorzystaniem wirowania różnicowego i SEC.
- Umożliwienie późniejszych analiz molekularnych i funkcjonalnych sEV pochodzących z tkanek.
- Wsparcie badań nad komunikacją międzykomórkową w układach mięśniowo-szkieletowym i krwiotwórczym.
Zastosowane metody
- Trawienie enzymatyczne tkanki mięśni szkieletowych.
- Bezpośrednia obróbka szpiku kostnego bez traktowania enzymatycznego.
- Centryfugowanie różnicowe w celu usunięcia komórek i resztek komórkowych.
- Chromatografia żelowa (SEC) w celu wzbogacenia w EV.
- Odrzucenie objętości martwej (SkM: ~2.5 mL; BM: 700 µL), a następnie pobranie frakcji wzbogaconych w EV.
- Subfrakcjonowanie na kolejne alikwoty (SkM: F1–F4; BM: F1–F5).
- Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) w celu oceny morfologii.
- Analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA) w celu określenia rozmiaru i stężenia.
- Western blotting dla kanonicznych markerów EV (np. tetraspanin).
- Interferometryczna detekcja pojedynczych cząstek (SPID) w celu kwantyfikacji subpopulacji zdefiniowanych przez tetraspaniny.
Główne wyniki
- sEV wyizolowane z ~500 µL mięśnia czworogłowego oraz ~150 µL połączonego szpiku kostnego (BM) z kości udowej i piszczelowej.
- Wydajność na poziomie ~10⁸ cząstek·mL⁻¹·mg⁻¹ tkanki.
- Średnice cząstek przeważnie <200 nm.
- Frakcje wzbogacone w EV zwalidowane za pomocą TEM, NTA oraz Western blottingu.
- Metoda SPID umożliwiła kwantyfikację subpopulacji sEV dodatnich pod kątem tetraspanin.
- Metoda pozwala na uzyskanie wysokiej czystości sEV odpowiednich do dalszych analiz omicznych i testów funkcjonalnych.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia powtarzalną izolację sEV o wysokiej czystości z tkanek o złożonej strukturze.
- Minimalne objętości tkanek wejściowych są wystarczające do uzyskania wysokiej wydajności EV.
- Połączenie wirowania różnicowego i SEC ogranicza zanieczyszczenia.
- Walidacja ortogonalna potwierdza integralność i czystość pęcherzyków.
- Podejście to wspiera zaawansowane badania funkcji tkankowo-specyficznych sEV w zdrowiu i chorobie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Izolowanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs) z tkanek stałych, takich jak mięśnie szkieletowe i szpik kostny, pozostaje wąskim gardłem w odkrywaniu biomarkerów i badaniach mechanistycznych ze względu na niską wydajność i zanieczyszczenia. Niniejszy protokół umożliwia powtarzalną izolację sEVs o wysokiej czystości z minimalnej ilości materiału tkankowego, co wspiera walidację celów oraz screening fenotypowy w modelach chorób mięśniowo-szkieletowych i hematologicznych. Poprzez redukcję szumu biologicznego i poprawę czystości pęcherzyków, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w dalszych analizach omicznych i testach funkcjonalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie tkankowo specyficznych szlaków komunikacji międzykomórkowej poprzez transfer białek, lipidów i RNA za pośrednictwem sEV.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny schemat izolacji sEV z mięśni szkieletowych i szpiku kostnego myszy przy użyciu wirowania różnicowego i chromatografii wykluczania cząsteczek.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez walidację wzbogacenia EV za pomocą metod ortogonalnych, w tym TEM, NTA, Western blotting oraz interferometrycznej detekcji pojedynczych cząstek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie frakcji wzbogaconych w EV z średnicą cząstek przeważnie <200 nm i wydajnością rzędu ~10⁸ cząstek·mL⁻¹·mg⁻¹ tkanki, co zapewnia powtarzalność materiału wejściowego dla kampanii przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację sEV poprzez określone usuwanie objętości martwej i sekwencyjne frakcjonowanie (SkM: F1–F4; BM: F1–F5), co poprawia odtwarzalność testów między laboratoriami.
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych analiz molekularnych, takich jak proteomika i profilowanie RNA pęcherzyków pochodzenia tkankowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera badania systemów istotnych dla chorób poprzez umożliwienie izolacji sEV z mięśni szkieletowych i szpiku kostnego, które są tkankami kluczowymi dla patofizjologii układu mięśniowo-szkieletowego i układu krwiotwórczego.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje minimalną ilość materiału wyjściowego (~500 µL mięśnia czworogłowego, ~150 µL połączonego szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej), co pozwala na skalowalne przetwarzanie ograniczonych próbek przedklinicznych.
- Wartość naukowa: Poprawia dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez izolację subpopulacji sEV zdefiniowanych przez tetraspaniny, które można ilościowo określić za pomocą interferometrycznej detekcji pojedynczych cząstek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnej walidacji celu po przedkliniczne badania mechanistyczne – umożliwiając niezawodną izolację sEV pochodzących z tkanek w celu weryfikacji hipotez i wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację sEV, które pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej w mikrośrodowiskach mięśni szkieletowych i szpiku kostnego.
- Przesiewanie: Dostarcza frakcji EV wyodrębnionych metodą wykluczania wielkości, gotowych do analizy i o zredukowanym poziomie zanieczyszczeń, co zwiększa niezawodność oceny odpowiedzi na związki lub bodźce.
- Analityka: Generuje dane ilościowe, w tym stężenie cząstek, rozkład wielkości (<200 nm) oraz dane dotyczące subpopulacji tetraspanin, umożliwiając analizę porównawczą w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z ciągłością przedkliniczną, dostarczając oczyszczone sEV odpowiednie do testów funkcjonalnego poboru i sygnalizacji w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zestandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę izolacyjną, którą można zastosować w programach badawczych nad układem mięśniowo-szkieletowym i układem krwiotwórczym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki izolacji sEV o wysokiej czystości, zwalidowanej za pomocą wielu technik ortogonalnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanemu frakcjonowaniu SEC oraz protokołom usuwania objętości martwej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wiarygodną ocenę zawartości pęcherzyków specyficznych dla danej tkanki we wczesnej fazie odkryć.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, zapewniając spójne wejścia sEV dla badań walidacyjnych biomarkerów i celów terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu tkanek, trawieniu enzymatycznym (w przypadku mięśni szkieletowych) oraz technikach wirowania.
- Zależne od dostępu do kolumn do chromatografii wykluczania cząsteczkowego, analizy śledzenia nanocząstek (NTA) oraz infrastruktury do Western blottingu.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie zbierania frakcji i kryteriów ich łączenia w oparciu o wzbogacenie w markery EV.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy zastosowaniu w innych tkankach stałych ze względu na różnice w gęstości macierzy zewnątrzkomórkowej i komórkowości.
- Ograniczenie praktyczne: niska bezwzględna wydajność przy niewielkich ilościach tkanki wejściowej wymaga zastosowania czułych metod detekcji w dalszych analizach omicznych.
