Name: Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji substratów wiążących białko SPIN4 przy użyciu matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów. Protokół umożliwia badanie specyficzności wiązania histonów H3K4me.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim byłym i obecnym członkom Yu and Jee Lab za wsparcie techniczne. J.-R.Y. otrzymał wsparcie od NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. YH. J był wspierany przez Children's National Hospital oraz Children's Research Institute.

<ol><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+variant+in+SPIN4+causes+an+X-linked+overgrowth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome.</a> JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).</li>
<li>Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+observation+of+a+rare+Binder+phenotype+with+fetal+overgrowth+due+to+a+SPIN4+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Matern+Fetal+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation.</a> Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).</li>
<li>Lu, R., Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor%3A+a+versatile+family+of+histone+methylation+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Tudor: a versatile family of histone methylation readers.</a> Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).</li>
<li>Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+engagement+of+chromatin+modifications+by+linked+binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).</li>
<li>Mauser, R., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+histone+peptide+arrays+in+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Application of modified histone peptide arrays in chromatin research.</a> Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).</li>
<li>Hsu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraspeckle+protein+NONO+regulates+active+chromatin+by+allosterically+stimulating+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1.</a> Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).</li>
<li>Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+enzymatic+activities+for+ultra-large+histone+methyltransferases+NSD1+and+SETD2+using+a+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Fuhrmann, J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+and+citrullination+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation.</a> ACS Chem Biol. 11, 654(2015).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+histone+H3+%E2%80%9CK4me3-K9me3%2F2%E2%80%9D+methylation+pattern+readout+by+Spindlin1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1.</a> J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).</li>
<li>Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+H3K9-methylated+heterochromatin+and+its+functions+in+tissue+differentiation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).</li>
<li>Greschik, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+code+reader+Spin1+controls+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development.</a> Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiono efektywną w czasie i kosztowo metodę biochemicznego określenia specyficznych histonowych PTM jako celów słabo scharakteryzowanego białka oraz ocenę, jak jego mutacja związana z chorobą wpływa na powinowactwa wiązania celu. Zaletą tej metody jest to, że nie wymaga kosztownej ani czasochłonnej rekonstrukcji syntetycznych nukleosomów. Podejście to wykorzystywało wygodę komercjalizowanych matryc peptydowych histonowych PTM, jednocześnie zapewniając, że SPIN4 jest prawdziwym czytelnikiem H3K4me, wykorzystując na...

Członek rodziny Spindlin 4 (SPIN4) jest epigenetycznym czytelnikiem i ostatnio został powiązany z zespołem przerostu, prezentując się z konstelacją przed- i poporodowej przerostu oraz wzrostem 1,2. Myszy Spin4 knockout (KO) powtórzyły dokładny fenotyp człowieka, potwierdzając przyczynowość. Do tej pory SPIN4 jest jedynym zidentyfikowanym wyłącznym czytelnikiem epigenetycznym, który negatywnie reguluje wzrost kości. Jednak właściwości biochemiczne SPIN4, kluczowego epigenetycznego czytelnika wzrostu, nie zostały scharakteryzowane, co pozostawia istotną lukę w wiedzy w zrozumieniu fundamentalnych, chorobotwórczych mechanizmów tego nowego zaburzenia rozwojowego. SPIN4 zawiera trzy tandemowe powtórzenia domen Tudora, które są zazwyczaj uważane za metylowaną argininę lub lizynę jako domeny czytające histony3. Niedawno zidentyfikowano wariant missenseSPIN4 D82H u pacjenta z zespołem przerostu kości prenatalnej i poporodowej. Ta mutacja dotyczy pierwszej domeny Tudorów SPIN4; jednak odpowiednie substraty wiążące tych domen Tudorów pozostają niejasne, co ogranicza funkcjonalną rozbiórkę regulacji chromatyny zależnej od SPIN4 oraz ekspresji genów podczas rozwoju kości.
Identyfikacja nowych substratów wiążących histony w czytniczych domenach białkowych nie opiera się na jednym, standaryzowanym podejściu. Modyfikacje posttranslacyjne (PTM) histonów występują głównie w ogonach histonowych, które wystają na zewnątrz z cząstek jądra jądrowego. Rozpoznawanie PTM na ogonach histonowych przez domeny białkowe czytające jest bardzo zmienne i często wymaga wielowartościowych, elektrostatycznych interakcji z DNA nukleosomalnym, DNA linkera i/lub innych domen histonowych, aby wspólnie ustabilizować interakcję czytnik-cel4. Obecnie PTM peptydów z ogonem histonów zostały skonstruowane w formie mikromacierzy i skomercjalizowane przez kilku dostawców5. Chociaż przesiewowe PTM oparte na peptydach histonowych na cele wiązania domen czytniczych jest wysokoprzepustowe, często daje fałszywie pozytywne wyniki bez obecności nukleosomów. Ponadto warunki eksperymentalne dla takich badań są wysoce empiryczne i różnią się w zależności od białka, co czyni je technicznie trudnymi do rozwiązania. Syntetyczne badanie PTM oparte na nukleosomach (pulldown) zapewnia znacznie bardziej solidny odczyt, ale jest znacznie droższe i o niskiej przepustowości, ponieważ retworzenie nukleosomów noszących zmienne kombinacje PTM jest z natury wyzwaniem.
Protokół ten opisuje szybkie podejście do identyfikacji histonowych PTM w nukleosomach jako celów wiążących SPIN4. Rekombinowany SPIN4 został zrekonstytuowany i przesiewany na komercyjnej matrycy peptydów histonowych PTM w celu identyfikacji potencjalnych celów wiązania. Natywne mononukleosomy zawierające różnorodne endogenne histonowe PTM zostały następnie wygenerowane z żywych komórek. Pulldown SPIN4 mononukleosomów umożliwił ukierunkowaną walidację histonów PTM opartą na przeciwciałach po wstępnym badaniu. Ta zintegrowana strategia biochemiczna demonstruje podejście proof-of-princip do efektywnego w czasie i kosztowo wykrywaniu celów i może być łatwo stosowana do identyfikacji substratów wiążących innych słabo scharakteryzowanych białek czytających epigenetycznie.

<table><tbody><tr><td>Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>Eksperymenty ogólne</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkanek o średnicy 15 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903.300</td><td>Eksperymenty ogólne</td></tr><tr><td>Stożkowe rurki do wirówek o pojemności 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.101</td><td>Eksperymenty ogólne</td></tr><tr><td>Stożkowe rurki wirówkowe 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004</td><td>Eksperymenty ogólne</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera 500 mL</td><td>Stellar Scientific</td><td>CT229809</td><td>Hodowla komórek Sf9</td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 CCD Imager</td><td>Cytiva</td><td>IMQ800</td><td>System obrazowania CCD</td></tr><tr><td>Żel powiązań anty-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>Biochemiczny pulldown</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0017</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Array Analysis Sofrware</td><td>Motyw aktywny</td><td>https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip</td><td>Analiza danych matryc peptydowych MODified</td></tr><tr><td>ASI Agarose LE</td><td>Alkali Scientific</td><td>A7700</td><td>Żel DNA</td></tr><tr><td>System ekspresji bac-to-bac baculowirusa</td><td>Thermo Scientific</td><td>10359016</td><td>Ekspresja bakulowirusowa</td></tr><tr><td>Benzamidyna chlorowodorek</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-W018781</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Standard ilościowej ilościowania białek</td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>A18469.08</td><td>Bufor Lammeli</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Scientific</td><td>20278</td><td>Barwienie żelem proteinowym</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5545</td><td>Bufor lizy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Produkty badawcze RPI</td><td>E58100</td><td>Bufor lizy</td></tr><tr><td>Podłoże o zwiększonej chemiluminescencji (ECL)</td><td>Cytiva</td><td>RPN2232</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>ESF 921 Medium do hodowli komórek owadów</td><td>Systemy ekspresji</td><td>96-001</td><td>Hodowla komórek Sf9</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>ET107</td><td>Wytrącanie DNA</td></tr><tr><td>System obrazowania EVOS M5000</td><td>Invitrogen</td><td>M5000</td><td>Obrazowanie ogólne</td></tr><tr><td>Peptyd FLAG</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7006</td><td>Elucia pulldown</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G77893</td><td>Bufor pamięci</td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K4me1 & nbsp;</td><td>Motyw aktywny</td><td>39300</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K4me2 & nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9725T</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K4me3&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9751T</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>HEK293FT komórki</td><td>Thermo Scientific</td><td>R70007</td><td>Ludzka embrionalna linia fibroblastkomórkowa nerki</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Bufor lizy</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td>&nbsp; Program do przetwarzania obrazów oparty na Javie</td></tr><tr><td>Hemisiarczan Leupeptyny</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-18234A</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokowa (MNaza)</td><td>NEB&nbsp;</td><td>M0247S</td><td>Endonukleaza do trawienia chromatyny</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Disembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Sonication</td></tr><tr><td>Matryca peptydów histonowych MODified</td><td>Motyw aktywny</td><td>13005</td><td>Badanie wiązania białek</td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0018</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Frakcja Peroksydazy IgG Monoklonalny anty-myszy kozi IgG, specyficzny dla łańcucha lekkiego</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-174</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10360014</td><td>Wektor ekspresji bakulowiratowej</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H</td><td>Thermo Scientific</td><td>10360014</td><td>Wektor ekspresji bakulowiratowej</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do testowania białka BCA Pierce Rapid Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>PIA53226</td><td>Kwantyfikacja białek</td></tr><tr><td>Zestaw do plamy Pierce Silver</td><td>Thermo Scientific</td><td>24612</td><td>Detekcja białek</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Żel poliakrylamidowy</td><td>Wykonane we własności</td><td>Nie ma</td><td>Żel białkowy</td></tr><tr><td>Komórki owadów Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td>Linia komórkowa owadów do ekspresji baculowirusa</td></tr><tr><td>Urządzenie do dializ Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>69572</td><td>Dializa białkowa</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Wytrącanie DNA</td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Fischer &nbsp;</td><td>BP358-1</td><td>Bufory ogólne</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L3771</td><td>Bufory ogólne</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution (0,4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td>Barwienie jąder</td></tr></tbody></table>

identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (spin4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

Identification of Modified Histones as Binding Substrates of Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) by Peptide Arrays and Native Nucleosome Pulldown

Członek rodziny Human Spindlin 4 (SPIN4) właśnie pojawił się jako nowy regulator wzrostu kości. Warianty utraty funkcji w SPIN4 zidentyfikowano u pacjentów wykazujących zespół przerostu przed- i ponatalnego, który dziedziczy się w sposób dominujący związany z chromosomem X. SPIN4 zawiera trzy powtarzające się tandem domen Tudorów, z których każda tworzy indywidualną klatkę aromatyczną. Te domeny Tudorów są uważane za epigenetyczne domeny czytelników metylowanej argininy i lizyny histonów na podstawie homologii sekwencji. Jednak dokładne substraty wiązania SPIN4 pozostają niejasne. Human SPIN4, zarówno w formie dzikiej, jak i chorobotwórczej, został pomyślnie wygenerowany za pomocą systemu ekspresji komórek owadów. Dzięki układowi peptydów modyfikacji histonów określono różnice wiążących między dzikim typem a mutantem SPIN4. Funkcjonalne weryfikacje wykazały również, że SPIN4 jest prawdziwym czytelnikiem metylacji histonu H3 Lizyny 4 (H3K4me), co potwierdza biochemiczne wycofanie natywnych mononukleosomów. To zintegrowane podejście ułatwia szybkie zidentyfikowanie celów związanych z białkami czytającymi epigenetycznie.

Aby zbadać substraty wiążące ludzki SPIN4, dziki typ SPIN4 oraz mutant pochodzący od pacjenta związany z zespołem przerostu zostały rekonstytuowane przy użyciu systemu ekspresji komórek owadów Sf9. Konkretnie, jest to mutacja niewłaściwa kwasu asparcynowego (D) do histydyny (H) w pozostałości 82 (D82H), która znajduje się w pierwszej domenie Tudorów SPIN4, co sugeruje jego rolę w regulacji wiązania substratu SPIN4. Do ekspresji białek w komórkach Sf9 zastosowano wektor bakulowiratowy kodujący pojedynczy FLAG-tagowany SPI...

Warianty genetyczne u członka rodziny Spindlin 4 (SPIN4) zostały niedawno zidentyfikowane u pacjentów z przerostem kości, co jest nowym zaburzeniem rozwojowym. Przedstawiono protokół oraz nowe wyniki opisujące biochemiczną identyfikację zmodyfikowanych histonów w kontekście nukleosomów jako substratów wiążących SPIN4.

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) has just emerged as a novel regulator of bone growth. Loss-of-function variants in SPIN4 were identified in ...

SPIN4 to czytnik histonów regulujący rozwój kości. Mutacje SPIN4 powodują nadmierny rozrost, ale jego rola patogenna pozostaje niejasna. Protokół ten można dostosować i zastosować do badania substratów wiążących histony białek we wszystkich przestrzeniach.Na początek przygotuj bufor blokujący, ważąc pięć gramów surowicy bydłej albuminy (BSA) i rozpuszczając go w 100 mililitrach buforu magazynującego białko BC-150. Następnie użyj hydrofobowego długopisu, aby wyznaczyć obszar reakcji na tablicy peptydów, aby zachować odczynniki. Następnie włóż papiery filtracyjne do 15-centymetrowej misy Petriego i zwilż je wodą.Umieść matryce na nawilżonych papierach filtracyjnych i ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów buforu blokującego do każdego obszaru matrycy. Przykryj i inkubuj szalkę Petriego w temperaturze pokojowej przez jedną do trzech godzin. Przygotuj jeden mikromolar rekombinowanego białka FLAG oznaczonego Spindlin-4, czyli FLAG SPIN4, oraz 1X kontroli peptydów FLAG, każdy w buforze blokującym.Przenieś odczynniki i antenę matrycyjną do chłodni, aby zmniejszyć tło i poprawić stosunek sygnału do szumu. Usuń nadmiar bufora blokującego z tablic. Dodaj białko FLAG SPIN4, czyli kontrolę peptydów FLAG, do każdego bloku.Przykryj szalkę Petriego do nocnej inkubacji w chłodni. Dodaj 50 mililitrów buforu do mycia z matrycą peptydową do myjki. Usuń roztwór białkowy z matryc i przenieś go do bufora płukania stroną reakcji do góry.Przemyj matryce pięć razy. Wykonaj pierwsze dwa mycia po jednej minutie każde, a następnie trzy kolejne mycia po pięć minut. Następnie płucz z buforem blokującym, żeby usunąć resztki detergentów.Umieść matryce z powrotem w szalce Petriego. Dodaj 300 mikrolitrów przeciwciał anty-FLAG do każdego bloku i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór przeciwciał, przenieś matryce do bufora płukania i powtórz płukania zgodnie z wcześniejszymi wykazami.Dodaj 300 mikrolitrów wtórnego przeciwciała przeciw myszom IgG z HRP do każdego bloku i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór przeciwciał i przepłucz matrycę pięć razy, jak pokazano wcześniej. Umieść matryce wewnątrz przezroczystej folii ochronnej i dodaj jeden mililitr podłoża o zwiększonej chemiluminescencji, czyli ECL, zapewniając równomierne pokrycie.Usuń uwięzione pęcherzyki powietrza. Rejestruj chemiluminescencję na obrazach jasnego pola za pomocą cyfrowego obrazowania. Po przesłaniu pliku surowych danych do oprogramowania MODified Histone Peptide Array Analysis, w zakładce Spot Alignment potwierdź, że każda siatka jest wyśrodkowana względem swojego miejsca peptydu.W Spot Statistics sprawdź korelację duplikatów spotów i upewnij się, że błąd jest mniejszy niż 5%. Użyj zakładki Reaktywności, aby ocenić wiązanie różnych modyfikacji histonów. Następnie użyj zakładki Specyficzność, aby określić względną preferencję wiązania peptydu docelowego wśród różnych modyfikacji histonów. Aby przygotować bufor blokujący kulki 2X, dodaj jeden gram BSA do 10 mililitrów buforu lizyzowego BC-150 i wiru do rozpuszczenia.Przenieś dziki typ FLAG SPIN4 oraz mutantowe kulki FLAG SPIN4 D82H zawierające stężenia równomolarne do oddzielnych rurek o pojemności 1,5 mililitra. Do próbki typu dzikiego dodaj równą objętość 100 milimolowych kulek peptydowych 1X FLAG o negatywnej kontroli. Dostosuj wszystkie próbki do jednolitych objętości, używając odpowiedniej ilości buforu lizyzowego BC-150.Dodaj równą objętość bufora blokującego kulki 2X do każdej rurki, aby uzyskać końcową objętość do jednego mililitra. Inkubuj przez noc na rotatorze rurkowym ustawionym na cztery stopnie Celsjusza i 20 obr./min. Aby rozpocząć wiązanie nukleosomów, rozmrażaj mononukleosomy 1X wyekstrahowane z HEK293FT komórek na lodzie.Do początkowej optymalizacji oblicz stosunek molowy 1X nukleosomu do białka SPIN4. Wymieszaj 1X nukleosom z równą objętością buforu blokującego kulki 2X. Następnie połącz mieszankę z wcześniej zablokowanymi kulkami w probówce o pojemności 15 mililitrów i inkubuj przez cztery godziny na rotatorze rurkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 obr./min, aby uzyskać kompleks.Wiruj mieszankę w 3000G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu należy ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu lizyzowego BC-150 i przenieść do rurek o pojemności 1,5 mililitra. Aby wymýć koraliki trzy razy, wiruj w wirówce z częstotliwością 3000G przez minutę.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesij granulkę w jednym mililitrze buforu lizycznego BC-150. Okazjonalnie mieszaj tubę, aby równomiernie rozłożyć kulki między powtarzanymi płukaniami. Następnie wykonaj dwa dodatkowe płukania, włączając 10-minutowy krok inkubacji na rotatorze o prędkości 20 obr./min i czterech stopniach Celsjusza pomiędzy etapami ponownej zawieszenia a wirowania.Po końcowym myciu ponownie zawiesij kulki w dziewięciokolumnowych objętościach buforu lizyzowego BC-150. Wymieszaj 160 mikrolitrów kulek z każdej próbki z 40 mikrolitrami buforu Laemmli 5X. Ogrzej temperaturę 95 stopni Celsjusza przez pięć minut dla denaturacji.Opcjonalnie, aby uzyskać czystsze wyniki z mniejszą iluzią tła, wykonaj iluzję peptydów FLAG kompleksu nukleosomów białkowych. Wiruj w 3000G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wykonaj barwienie srebrem i western blotting, aby zweryfikować i wykryć zmodyfikowane wiązanie histonów SPIN4.SPIN4 znacząco wiąże się z histonem H3 lizyną 4, czyli H3K4, monometylowymi, dimetylowymi i trimetyloowymi peptydami. Z kolei mutant utraty funkcji SPIN4 D82H wykazał zmniejszone wiązanie ze wszystkimi celami, co potwierdza, że domena Tudora 1 jest niezbędna do wiązania substratu. Powinowactwo wiązania SPIN4 jest negatywnie wpływane przez inne modyfikacje potranslacyjne, które wymagają potwierdzenia, takie jak H3R2me2 i H3R2me2a.Na podstawie spójnych obserwacji matryc peptydowych, SPIN4 D82H wykazał ogólne zmniejszenie wiązania nukleosomów w porównaniu do dzikiego typu SPIN4. Analiza Western blot porównująca próbki pulldown SPIN4 i SPIN4 D82H wykazała dalsze nieobliczalne wiązanie SPIN4 D82H z peptydami monometylowym, dimetylowym ani trimetyloowym H3K4, co potwierdza te podwójne podejścia do szybkiej identyfikacji względnych substratów modyfikacji histonów po translacji. Szybka i ukierunkowana walidacja substratów wiążących białka wiążące histony.Warunki wymagane do ekspresji i oczyszczania białek wiążących histony każdego kandydata mogą się różnić. Spektrometria mas histonów po natywnym pulldownie mononukleosomu pozwoli obejrzeć pełny zakres PTM histonów.

identification-modified-histones-as-binding-substrates-human-spindlin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek i modyfikacji histonów związanych z nowo zsyntetyzowanym lub powstającym DNA.

Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Ten manuskrypt opisuje metody zastosowania technologii mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających histony i ich potranslacyjne modyfikacje.

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje zestaw metod, które obejmują analityczną chromatografię wykluczającą wielkość do badania oligomeryzacji i stabilności histonów opiekuńczych, test pull-down do rozwikłania interakcji chaperon-histon histon, AUC do analizy stechiometrii kompleksów białkowych oraz test opiekuńczy histonów do funkcjonalnego scharakteryzowania domniemanego chaperonu histonów in vitro.

In vitro Charakterystyka białek opiekuńczych histonów za pomocą testów analitycznych, pull-down i chaperoningowych

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Poznaj metodę identyfikacji substratów wiążących białko SPIN4 przy użyciu matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów. Protokół umożliwia badanie specyficzności wiązania histonów H3K4me.

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

Przeglądaj więcej filmów