Zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji
12 czerwca 2026
Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka żeńskiej moczowodu myszy do analiz wtórnych, w tym cytometrii przepływowej, immunobarwienia i hodowli organoidalnej. Metody dały wzbogacone, żywe komórki nabłonkowe cewki moczowej, co potwierdzono za pomocą analizy cytometrii przepływowej, pełnego obrazowania i wydajnego tworzenia organoidów.
Nasz zespół jest zainteresowany badaniem układu nabłonkowego w drogach moczowo-płciowych. Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka żeńskiej cewki moczowodu myszy w celu dalszej analizy molekularnej i komórkowej. Metody opisane w tym artykule pomogą w badaniach nad żeńskim wyściółkiem cewki moczowodo i jego rolą w obronie immunologicznej.
Na początek umieść eutanatyzowaną samicę myszy CD1 w wieku 6 do 12 tygodni w pozycji leżącej na plecach na stole sekccyjnym. Spryskaj brzuch 70% etanolem, aby zwilżyć sierść. Używając kleszczy, podnieś skórę na brzuchu.
Następnie za pomocą małych nożyczek wykonaj pionowy nacięcie w kierunku dolnej części ciała, kończąc na zewnętrznym otworze cewki moczowodo. Zidentyfikuj pęcherz i delikatnie podnieś go kleszczami, upewniając się, że jest pusty i wolny od moczu. Używając nożyczek, przytnij tłuszcz i tkankę łączną wokół pęcherza, aby odsłonić motylkową strukturę, gdzie dwie kości łonowe łączą się w symplazji łonowej.
Obserwuj przebieg cewki moczowodo pod symplazją łonową. Następnie podnieś symplazję łonową kleszczami i przetnij ją za pomocą nożyczek. Usuń fragmenty kości łonowej, aby odsłonić cienką cewkę moczową leżącą na brzusznej powierzchni ściany pochwy.
Używając drobnych kleszczy, delikatnie pociągnij pęcherz w górę z jamy brzusznej. Przetnij nożyczkami między cewką moczową a ścianą pochwy, aby oddzielić drogi moczowe i rozrodcze. Utrzymuj lekką naprężność na pęcherzu podczas cięcia wzdłuż tylnej strony cewki moczowodo, aby oddzielić ją od ściany pochwy.
Kontynuuj cięcie do dystalnego otwarcia cewki moczowodo, aby uzyskać pełną długość cewki moczowodo myszy, mierzącej 1,2 do 1,5 centymetra długości. Następnie oddziel cewkę moczową od pęcherza, wykonując pojedyncze cięcie w szyi pęcherza. Zbierz cztery do pięciu cewek moczowych w sterylnym pojemniku Petriego zawierającym świeże HBSS bez wapnia i magnezu.
Pod mikroskopem sekccyjnym przytnij tłuszcz i tkankę łączną otaczającą cewkę moczową za pomocą drobnych kleszczy i nożyczek. Następnie za pomocą nożyczek przetnij każdą cewkę moczową na krzyż na dwie równe części. Umieść kawałki tkanki na górze 100 mikronowej sita z nylonu.
Przemyj kawałki tkanki jednym mililitrą HBSS, a następnie przenieś je do 1,5 mililitrowego mikrocentryfugują zawierającego jeden mililitr 1% trypsyny przygotowanej w HBSS uzupełnionym o antybiotyki i antymykotyki. Następnie inkubatoruj próbkę na rotacji z 30 obrotów na minutę i cztery stopnie Celsjusza przez 15 do 30 minut. Po trawieniu dodaj 10 milimolarów chlorku magnezu przygotowanego w HBSS do probówki, a następnie 10 mikrogramów na mililitr DNAse I przygotowanego w PBS.
Inkubatoruj probówkę przez 15 do 30 minut na rotacji umieszczonej wewnątrz pieca hybrydyzacyjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zgasić trypsynę, przenieś tkanki cewki moczowodo do 1,5 mililitrowej mikrocentryfugują zawierającej 10% surowicy owczej w HBSS w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach przenieś tkanki cewki moczowodo do nowej probówki zawierającej lodowato zimne HBSS, a następnie do sterylnego pojemnika Petriego zawierającego lodowato zimne HBSS.
Podczas obserwacji próbki pod mikroskopem, przytrzymaj jednym końcem kawałka cewki moczowodo parą kleszczy. Używając innej pary kleszczy, przejdź wzdłuż całej długości kawałka cewki moczowodo, aby wypchnąć przezroczysty arkusz nabłonkowy. Przetwarzaj niektóre izolowane arkusze nabłonkowe cewki moczowodo bezpośrednio na całościową immunobarwienie w celu wizualizowania komórek nabłonkowych i makrofagów skojarzonych z nabłonkiem in situ.
Użyj małej plastikowej pipety, aby przenieść kawałki nabłonkowe w kropli HBSS izolowanych z czterech do pięciu zbiorczych cewek moczowodo myszy do sterylnego pojemnika Petriego. Użyj nożyczek, aby pokroić nabłonek na małe fragmenty. Przenieś pokrojowane fragmenty nabłonka do dwumililitrowej mikrocentryfugują zawierającej 1,5 mililitra roztworu trawiennego Accutase przygotowanego w 37 stopniach Celsjusza.
Inkubatoruj próbkę na rotacji w 37 stopniach przez jedną godzinę. Po inkubacji przenieś całą zawartość do pięciomililitrowej probówki wirówkowej zawierającej dwa mililitry buforu płukającego składającego się z wolnego od wapnia i magnezu 1X PBS i 1% BSA. Wiruj zawiesinę przy 600 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, używając wirówki z obrotowym koszem.
Następnie odsysaj nadstan przy użyciu łagodnego odsysania. Następnie użyj jednomililitrowej pipety z końcówką filtra, aby ponownie zawiesić pellet w jednym mililitru buforu płukającego. Rozbij pellet pipetowaniem w górę i w dół, aż grudki staną się mniejsze.
Przepuść zawiesinę przez igły 23,5 kalibru i 26,5 kalibru, każda zamocowania do jednomilitrowej strzykawki za pomocą czterech pociągnięć
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowane protokoły preparowania cewki moczowej samicy myszy oraz izolacji jej nabłonka, co umożliwia szczegółowe badanie populacji komórek nabłonkowych i immunologicznych. Opisane metody ułatwiają dalsze analizy, takie jak cytometria przepływowa, immunobarwienie, generowanie organoidów oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, w celu zbadania mechanizmów obronnych gospodarza w dolnych drogach moczowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Urologia
- Immunologia
- Biologia komórki
- Badania na modelach mysich
Wstęp
- Cewka moczowa jest wyścielona komórkami nabłonkowymi, które pełnią funkcję bariery oraz odgrywają rolę w obronie przeciwdrobnoustrojowej i immunologicznej.
- Różne typy komórek nabłonkowych oraz makrofagi rezydentne przyczyniają się do nadzoru immunologicznego i prezentacji antygenów.
- Patogeny układu moczowego mogą przemieszczać się w górę cewki moczowej, co czyni ją kluczowym miejscem badania oddziaływań między gospodarzem a patogenem.
- Zrozumienie składu komórkowego i funkcji immunologicznych wyściółki cewki moczowej jest niezbędne do uzyskania wiedzy na temat mechanizmów obronnych układu moczowego.
Cel badania
- Zapewnienie zoptymalizowanych metod preparowania i izolacji nabłonka cewki moczowej samic myszy.
- Umożliwienie przygotowania zawiesin pojedynczych komórek nabłonkowych i immunologicznych o wysokiej żywotności do dalszych analiz.
- Ułatwienie badań nad mechanizmami obronnymi gospodarza w dolnych drogach moczowych.
Zastosowane metody
- Disekcja cewki moczowej samicy myszy i izolacja nabłonka z wykorzystaniem łagodnej separacji enzymatycznej i mechanicznej.
- Trawienie enzymatyczne wyizolowanego nabłonka oraz powiązanych komórek odpornościowych w celu uzyskania zawiesin jednokomórkowych.
- Analiza populacji komórek nabłonkowych i odpornościowych przy użyciu cytometrii przepływowej.
- Generowanie wielowarstwowych 3D organoidów nabłonka cewki moczowej z wyizolowanych komórek.
- Immunobarwienie całych preparatów (whole-mount) płatów nabłonka cewki moczowej w celu obserwacji morfologii i struktur molekularnych.
Główne wyniki
- Zoptymalizowane protokoły pozwalają na uzyskanie zawiesin pojedynczych komórek o wysokiej żywotności z nabłonka cewki moczowej myszy.
- Zastosowane metody umożliwiają szczegółowe analizy cytometryczne i immunostaining komórek nabłonkowych oraz odpornościowych.
- Możliwe jest generowanie 3D organoidów z izolowanych komórek nabłonka.
- Immunostaining całych preparatów (whole-mount) pozwala na wizualizację morfologii oraz cech molekularnych komórek nabłonkowych i odpornościowych.
Wnioski
- Opisane protokoły stanowią niezawodne narzędzia do izolacji i analizy komórek nabłonkowych oraz immunologicznych cewki moczowej myszy.
- Metody te wspierają szereg dalszych zastosowań, w tym immunobarwienie, cytometrię przepływową, hodowlę organoidów oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.
- Podejście to rozwija badania nad mechanizmami obronnymi gospodarza w dolnych drogach moczowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zoptymalizowana izolacja nabłonka cewki moczowej samic myszy oraz powiązanych z nim komórek odpornościowych umożliwia wysokorozdzielcze analizy pojedynczych komórek oraz immunofluorescencję, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad interakcjami gospodarz-patogen. Możliwość ta wzmacnia wczesne etapy odkrywania i walidacji celów dla szlaków obrony dróg moczowych, zapewniając pewność prognostyczną dla późniejszych badań translacyjnych. Powtarzalność protokołu oraz ilościowe wyniki pozycjonują go jako wielokrotnie wykorzystywalne narzędzie do badań nad komórkami nabłonkowymi i odpornościowymi w całym portfolio projektów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę heterogeniczności komórek nabłonkowych i odpornościowych istotnych dla mechanizmów obrony gospodarza.
- Wspiera funkcjonalną walidację szlaków nadzoru immunologicznego w dolnych drogach moczowych.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez izolację transkrypcyjnie odrębnych podtypów makrofagów.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy rozwoju celów nabłonkowych w modelach infekcji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia wysoką żywotność zawiesin pojedynczych komórek, odpowiednich do ilościowej cytometrii przepływowej i testów immunobarwienia.
- Standaryzuje przygotowanie populacji komórek nabłonkowych i odpornościowych w celu zapewnienia powtarzalności w dalszych etapach analizy.
- Umożliwia generowanie warstwowych organoidów 3D do skalowalnej oceny związków i screeningu fenotypowego.
- Wspiera opracowywanie testów dzięki wiarygodnym odczytom morfologicznym i molekularnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami odpowiedzi immunologicznej i zakażeń dróg moczowych istotnymi z punktu widzenia choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację funkcji komórek nabłonkowych i odpornościowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe dane z poziomu pojedynczych komórek i organoidów.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych dzięki wynikom sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając płynne przejście od studiów mechanistycznych do walidacji translacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących roli komórek nabłonkowych i immunologicznych w obronie gospodarza.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne systemy jednokomórkowe i organoidowe do opracowywania ilościowych testów analitycznych.
- Analityka: Dostarcza wyników z cytometrii przepływowej, immunobarwienia oraz sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (single-cell RNA-seq) do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia dotyczące komórek nabłonkowych i immunologicznych z modelami dróg moczowych istotnymi dla przebiegu chorób.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany schemat postępowania w zakresie izolacji komórek nabłonkowych i immunologicznych w ramach programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad komórkami nabłonkowymi i odpornościowymi.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność przepływów pracy w badaniach pojedynczych komórek i organoidów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej walidacji celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów terapeutycznych związanych z obroną dróg moczowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcji myszy, trawieniu enzymatycznym oraz pracy z pojedynczymi komórkami.
- Wymaga dostępu do cytometrii przepływowej, mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz infrastruktury do hodowli organoidów.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności izolacji i analizy komórek.
- Metoda możliwa do adaptacji do innych modeli komórek nabłonkowych i odpornościowych po optymalizacji protokołu.
- Wysoka żywotność komórek dla dalszych zastosowań zależy od delikatnego obchodzenia się z materiałem.
