Name: Zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka cewki moczowej myszy do analizy pojedynczych komórek, immunofluorescencji i hodowli organoidów. Technika umożliwia badanie mechanizmów obrony gospodarza w dolnym odcinku układu moczowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy uznanie dla Animal Care and Resource Centre w National Centre for Biological Sciences (NCBS), Bangalore Life Sciences Cluster (BLiSC) za ich usługi. Wyrażamy wdzięczność Yousuf Khan i Działowi Komunikacji w BRIC-inStem za wykonanie fotografii. Dziękujemy dr. Sudarshan Gadadhar za dostęp do mikroskopu AxioObserver i Apotome. Praca ta była wspierana przez DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Fellowship (Ref: IA/E/21/1/506274) dla D.B.J. oraz Department of Biotechnology (DBT), Government of India, dzięki funduszom instytucjonalnym przekazanym inStem.

Wszystkie badania na myszach przeprowadzono za zgodą Komisji Etycznej ds. Zwierząt Instytucjonalnych (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) oraz Komisji Biobezpieczeństwa Instytucjonalnego (inStem/G-141(3)-22/DBJ) w BRIC-Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine w Bengaluru. Do badania wykorzystano myszy CD-1 lub C57BL6/J płci żeńskiej, w wieku 6-12 tygodni, przetrzymywanych w Animal Care and Resource Centre (ACRC) w National Centre for Biological Sciences (NCBS), Bangalore Life Sciences Cluster (BLiSC). Myszy przetrzymywano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, w cyklu 12-godzinnej jasności i ciemności, z dostępem ad libitum do pokarmu i wody.
Wszystkie użyte materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Sekcja i pobranie cewki moczowej dorosłej myszy samicy
<ol>
	<li>Wykonaj eutanazję na myszy za pomocą CO2. Przeprowadź dyslokację szyjną jako sposób drugorzędowej eutanazji.</li>
	<li>Przełóż mysz w pozycji na plecach i spryskaj 70% etanolem, aby zmoczyć sierść na brzuchu (Rysunek 1A).</li>
	<li>Podnieś skórę na brzuchu za pomocą kleszczy i wykonaj pionowy nacięcie w kierunku dolnej części ciała, kończąc na zewnętrznym otworze cewki moczowej (Rysunek 1B i 1C).</li>
	<li>Zidentyfikuj pęcherz i delikatnie podnieś go za pomocą kleszczy. W niektórych przypadkach może być on wypełniony moczem. Delikatnie ściśnij pęcherz pomiędzy kleszczami, aby go opróżnić. 
	UWAGA: Pęcherz będzie wyglądał jak bulwiasta struktura.</li>
	<li>Przytnij tłuszcz i tkankę łączną wokół pęcherza za pomocą małych sprężynowych nożyczek, aby odsłonić motylkowatą strukturę, gdzie dwie kości łonowe łączą się w pobliżu łącza łonowego (Rysunek 1D). Cewka moczową biegnie pod łączem łonowym.</li>
	<li>Przeciąć w miejscu łącza łonowego, podnosząc je kleszczami i przecinając za pomocą małych sprężynowych nożyczek (Rysunek 1E). Usuń fragmenty kości łonowych, aby cewka moczową była widoczna biegnąca w dół od pęcherza (Rysunek 1F). 
	UWAGA: Cewka moczową będzie wyglądać jak cienki czerwony kanał, który leży na brzusznej powierzchni ściany pochwy (Rysunek 1G).</li>
	<li>Delikatnie wyciągnij pęcherz z jamy brzusznej za pomocą drobnych kleszczy i przesuń małe sprężynowe nożyczki pomiędzy cewką moczową a ścianą pochwy, aby oddzielić układ moczowy od układu rozrodczego.</li>
	<li>Zachowaj lekką napiętość na pęcherzu, podczas cięcia wzdłuż tylnej strony cewki moczową, aby oddzielić ją od ściany pochwy (Rysunek 1H–J). Przetnij do końca, aby uzyskać pełną długość mysiej cewki moczową (1,2–1,5 cm długości) (Rysunek 1K i 1L).</li>
	<li>Oddziel cewkę moczową od pęcherza, wykonując pojedyncze nacięcie w szyi pęcherza.</li>
</ol>
2. Izolacja tkanki nabłonkowej cewki moczowej
UWAGA: Protokół do izolowania arkuszy nabłonkowych z cewki moczowej został zmodyfikowany i zoptymalizowany z protokołu do izolowania nabłonka macicy14. Rysunek 2 przedstawia kroki do izolowania arkuszy nabłonkowych cewki moczowej z otaczającego ją stromy (Rysunek 2A).
<ol>
	<li>Przenieś wycięte cewki moczową do sterylnej płytki Petriego zawierającej świeże 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, bez Ca i Mg, szczegóły w Tabeli uzupełniającej 1). 
	UWAGA: Zaleca się zbieranie 4–5 cewek moczową na tym etapie, aby oddzielić nabłonek i przeprowadzić trawienie pojedynczych komórek.</li>
	<li>Pod mikroskopem przecinaj tkankę tłuszczową i łączną wokół cewki moczowej za pomocą drobnych kleszczy i małych sprężynowych nożyczek (Rysunek 2B).</li>
	<li>Przecinaj każdą cewkę moczową na dwie równe części wzdłuż i ułóż na wierzchu sita z nylonu o grubości 100 mikrometrów (Rysunek 2C–G).</li>
	<li>Przepłucz tkanki, przepuszczając 1 mL 1x HBSS (bez Ca i Mg) przez tkanki.</li>
	<li>Przenieś kawałki tkanki do 1,5 mL mikrocentrfużerki (Rysunek 2H) zawierającej 1 mL 1% trypsyny (1% trypsyny, w/v na 1x sHBSSa, szczegóły w Tabeli uzupełniającej 2).</li>
	<li>Trawiaj tkankę przez inkubację przez 15–30 min na obrotówce próbek (30 rpm) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po inkuba

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów. W artykule nie wykorzystano żadnych narzędzi AI.

Bariery nabłonkowe w organizmie są krytycznie ważne dla obrony organizmu. Są to wyspecjalizowane przedziały z wieloma typami komórek nabłonkowych i skojarzonymi rezydentnymi komórkami odpornościowymi. Bariery nabłonkowe zmieniają się w czasie rozwoju, nabywając ekspresję genów obrony organizmu często w odpowiedzi na mikrobiotę lub ekspozycję na środowisko. Wady integralności nabłonka lub ekspresji genów mogą wpływać na obronę organizmu15. Istotne jest badanie tkanki nabłonkowej w izolacji, aby zrozumieć sygnały transkryptomiczne, jak również badanie kontaktów międzykomórkowych i integralności nabłonka. Obecnie nie opisano szczegółowo metod zoptymalizowanych dla izolacji tkanki nabłonkowej cewki moczowej u samic myszy. Podczas gdy nabłonek pęcherza można odizolować tylko poprzez separację mechaniczną16, nabłonek cewki znajduje się wewnątrz stromalnej rury cewki i wymaga kombinacji separacji enzymatycznej i mechanicznej, aby odizolować tkankę nabłonkową.
Tutaj autorzy przedstawiają zoptymalizowaną metodę izolacji arkuszy nabłonkowych z jamy cewki moczowej samic myszy. Metoda ta może być wykorzystana do generowania pojedynczych zawiesin komórek nabłonkowych cewki moczowej o wysokiej żywotności dla zastosowań sekwencyjnych, takich jak cytometria przepływowa, kultura organoidalna i immunobarwienie. Kompatybilność tej metody z przepływami sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek została wcześniej wykazana przez tę samą grupę5. Dzięki modyfikacjom i dalszej optymalizacji, protokół przedstawiony tutaj może być dostosowany do ekstrakcji tkanek nabłonkowych z innych narządów przewodowych dla zastosowań sekwencyjnych.
Kluczowe kroki w protokole obejmują staranne sekcjonowanie pełnej długości dorosłej żeńskiej cewki moczowej myszy, umożliwiające badanie różnic regionalnych wzdłuż osi proksymalno-dystalnej. Następnie protokół wykorzystuje delikatne trawienie enzymatyczne, aby złuczenie nabłonka ścianki cewki moczowej od otaczającego stromy. Enzymatyczne trawienie złucza nabłonek, umożliwiając mechaniczne oddzielenie poprzez delikatne ściskanie rurki cewki między kleszczami, aby uwolnić tkankę nabłonkową. Badacze starannie zoptymalizowali czas trawienia trypsyną, aby umożliwić izolację nabłonka cewki z wysoką żywotnością (> 80%) jako arkusze do immunobarwienia lub do dalszej izolacji pojedynczych komórek (Rysunek 3, Plik uzupełniający 1). Jednokomórkowe trawienie nabłonka cewki moczowej ujawniło 80–90% komórek nabłonkowych w izolatach nabłonka cewki moczowej. Z poprzedniego badania autorzy zidentyfikowali, że komórki nie-nabłonkowe w tej preparacji składają się głównie z komórek odpornościowych związanych z nabłonkiem i śródbłonka naczyniowego5. Obecna metoda izolacji pojedynczych komórek daje wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek dla zastosowań sekwencyjnych, takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek poprzez eliminację skupień komórek poprzez mechaniczne rozerwanie za pomocą aspirycji igłą o małej średnicy i usunięcie RBC przez łagodne lizys.
Wyniki pokazują, że ta metoda może być wykorzystana do wzbogacenia komórek odpornościowych specyficznych dla komórt (Rysunek 3). Nabłonek izolowany z proksymalnej i dystalnej części cewki moczowej może być również badany oddzielnie. Ponadto autorzy wykazali, że izolowany nabłonek może być wykorzystany do generacji organoidów cewki moczowej, które nie zostały wcześniej opisane (Rysunek 4). Te wyniki pokazują również regionalną zmienność zdolności do generacji organoidów w żeńskiej cewce moczowej. Podczas gdy ostatnie badania autora wykazały proksymalno-dystalne różnice w ekspresji genów nabłonkowych i organizacji komórek odpornościowych w żeńskiej cewce moczowej myszy5, obecne badanie pokazuje, że proksymalne komórki nabłonka cewki moczowej tworzą mniej organoidów niż nabłonek izolowany z dystalnej części cewki moczowej (Rysunek 4). Jedną z ograniczeń tego podziału przestrzennego na proksymalną i dystalną część cewki moczowej jest to, że nie ma anatomicznego punktu odniesienia, który można wykorzystać w czasie sekcji, aby odróżnić te dwie obszary. W niniejszym badaniu autorzy podzielili długość cewki moczowej na połowę, aby uzyskać proksymalne i dystalne komory. Opisana tutaj metoda izolacji nabłonka może być wykorzystana do dalszego charakteryzowania różnic w ekspresji genów i składzie komórkowym między proksymalnym a dystalnym nabłonkiem cewki moczowej.
Chociaż zoptymalizowany protokół przedstawiony tutaj jest dostępny i powtarzalny, niektóre kroki wymagają praktyki i starannej kalibracji. W szczególności, metoda sekcji przedstawiona tutaj wymaga starannego ekstrakcji rurki cewki moczowej spod łączenia łonowego, zachowując całą długość cewki moczowej. Ponadto należy zachować ostrożność, aby usunąć wszelkie tkanki pochwowe przyczepione do grzbietowej ściany cewki moczowej po

Dolny układ moczowy (LUT) myszy składa się z dwóch części: pęcherza i cewki moczowej. Podczas stadiów embrionalnych struktury LUT rozwijają się z kloaki, przejściowej struktury pochodzenia endodermy zlokalizowanych w tylnej części jelita. Przednia część kloaki, zadziwne przewód moczowy, tworzy przednio pęcherz, a tylna część cewkę moczową1. Wyściółka pęcherza jest dobrze zbadana. Tworzy szczelną barierę przed składnikami moczu poprzez szczytowe płytki krystaliczne złożone z białek uroplakin2,3,4. Podczas gdy wyściółka pęcherza jest nabłonkiem przejściowym, cewka moczowa wykazuje różnice w architekturze nabłonka od szyi pęcherza do dystalnego otwarcia cewki moczowej. Dodatkowo, cewka moczowa wykazuje dymorfizm płciowy w strukturach nabłonkowych i architekturze komórkowej. Męska mysza cewka moczowa składa się z nabłonka przejściowego w szyi pęcherza, za którą następuje nabłonek kolumnowy i wielowarstwowy. Żeńska mysza cewka moczowa jest wyłożona nabłonkiem przejściowym w szyi pęcherza i wielowarstwowym nabłonkiem niełuseczkowym, kropkowanym małymi przewodami kończącymi się gruczołami wydzielniczymi w kierunku dalszym końcu5.
Samice są bardziej podatne na infekcje dróg moczowych (UTI), głównie wywołane przez patogenne bakterie uropatogenne, które unoszą się z jelit przez cewkę moczową, aby zainfekować pęcherz6. Cewka moczowa jest pierwszą powierzchnią w LUT, która wchodzi w kontakt z patogenami moczowymi. Funkcja komórek nabłonka cewki moczowej, szczególnie ich rola jako aktywnej bariery immunologicznej, była słabo zbadana. Ostatnie prace tej samej grupy dostarczyły przestrzennej mapy z jedno-komórkową rozdzielczością dorosłej żeńskiej myszej cewki moczowej5. Identyfikuje ona potrójną warstwę wyściółki cewki moczowej z komórkami podstawowymi, pośrednimi i wierzchołkowymi. Rozproszone w wyściółce nabłonkowej są rzadkie komórki neuroendokrynne5,7. W środkowej części cewki moczowej małe przewody odgałęziają się od głównego pnia cewki moczowej, kończąc się w klastrach gruczołów wydzielniczych, osadzone w słupowej części cewki moczowej. Dane transkryptomowe ujawniają, że komórki nabłonka w cewce moczową wyrażają geny immunomodulujące i przeciwdrobnoustrojowe, które mogą kształtować obronę żywiciela5. Badanie właściwości i atrybutów komórek nabłonka cewki moczowej związanych z ich potencjałem obronnym i funkcjami immunomodulującymi może dostarczyć nowych strategii zwalczania UTI.
Wykorzystanie myszy do badania nabłonka cewki moczowej umożliwia przeprowadzenie badań czasowych i badanie dymorfizmu płciowego. Biorąc pod uwagę podobieństwa myszy do człowieka pod względem architektury komórkowej pęcherza i cewki moczowej1, mysz była szeroko wykorzystywana do badania embrionalnego rozwoju dolnego układu moczowego1,8,9. Myszy były również wykorzystywane w modelach przezcewkowego wlewu do badania UTI wywołanych przez patogeny moczowe10,11,12. Tkanka dolnego układu moczowego jest trudna do uzyskania u pacjentów, chyba że poddają się resekcji z powodu raka lub innych chorób. Źródło konsekwentnej, zdrowej ludzkiej tkanki jest trudne do uzyskania, a mysz zapewnia przydatny model do badania tkanek w dolnym układzie moczowym w badaniach nad homeostazą tkankową, naprawą i reakcją na zaburzenia zapalne. Zarówno żeńska mysza, jak i żeńska ludzka wyściółka cewki moczowej składa się z nabłonka przejściowego w szyi pęcherza i wielowarstwowym nabłonkiem niełuseczkowym, nierogowaciałym w kierunku dalszym końca. Nabłonek łuseczkowy obserwuje się na dalszym końcu żeńskiej ludzkiej cewki moczowej, chociaż zmienność obserwuje się w żeńskiej ludzkiej wyściółce cewki moczowej wraz z wiekiem5,13. Chociaż porównania wyściółki cewki moczowej na poziomie transkryptomu nie zostały przeprowadzone między ludzką a myszą cewką moczową, mysz stanowi przydatny model do uchwycenia wzorcowania nabłonka, interakcji nabłonkowo-immunologicznych i odpowiedzi na infekcje w cewce moczową.
W niniejszym badaniu autorzy opisują metody do rozcięcia pełnej długości żeńskiej myszej cewki moczowej, izolację nabłonka cewki moczowej i delikatne trawienie enzymatyczne w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych. Jest to pierwszy szczegółowy protokół dotyczący izolację i trawienia żeńskiego myszego nabłonka cewki moczowej. Zoptymalizowany protokół daje wzbogaconą populację komórek nabłonkowych, które mogą być wykorzystane do różnych analiz poniżej. Jak przedstawiono w badaniu, autorzy wykonali cytometrię prze

<table><tbody><tr><td>#5 fine forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% neutral buffered formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>30-micron pre-separation filter&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>Aby stworzyć panele rysunków</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Aby stworzyć panele rysunków</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/antimycotic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD326 (EpCAM)</td><td>Invitrogen</td><td>17-5791-82</td><td>1:20 rozcieńczenie, do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-CD45</td><td>Tonbo</td><td>35-0451-U100</td><td>1:20 rozcieńczenie, do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-CDH1 (Rabbit)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>3195S</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-F4/80</td><td>Tonbo</td><td>50-4801-U100</td><td>1:20 rozcieńczenie, do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Rat)</td><td>Invitrogen</td><td>14-4801-82</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 13 (Rabbit)</td><td>Abcam</td><td>ab92551</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 4 (Mouse)</td><td>Abcam</td><td>ab9004</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 5 (Chicken)</td><td>Biolegend</td><td>905904</td><td>1:800 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 5 (Rabbit)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>71536</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-p63 (Mouse)</td><td>Biocare medical</td><td>CM163A</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Axioobserver 7</td><td>Zeiss</td><td>431007-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td><td>Genetix</td><td>PG-2330</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 Mice</td><td>Charles River, USA</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex BME</td><td>R&amp;D systems</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI solution&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Qualigens</td><td>Q15405</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Himedia</td><td>MB058</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)</td><td>Qualigens</td><td>Q15825</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>703-545-155</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>715-545-151</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-585-151</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-585-152</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>711-605-152</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>712-605-153</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>712-585-153</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-315-09</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Himedia</td><td>GRM938</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Supelco</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt mounting media&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>PeproTech</td><td>450-61</td><td></td></tr><tr><td>Filter cap sorting tubes</td><td>&nbsp;Falcon/Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye&trade; Violet 450</td><td>Tonbo biosciences</td><td>13-0863-T100</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol anhydrous</td><td>Merck</td><td>DA1P692899</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Polysciences</td><td>24243</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza Analysis</td><td>Beckman Coulter</td><td>Kaluza Analysis 2.4</td><td>Analiza danych cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl2)</td><td>Qualigens</td><td>Q15535</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Noggin&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>AF-250-38</td><td></td></tr><tr><td>n-Propyl gallate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax&nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>Q19215</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q13305</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)</td><td>Qualigens</td><td>19465</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>TNB-4300-L100</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Rock

zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji

An Optimized Method To Isolate Female Mouse Urethral Epithelium For Single-Cell And Immunofluorescence Analysis

Cewka moczowa, wysłana komórkami nabłonka, służy jako przewód do odpływu moczu z organizmu. Nabłonek cewki moczowej składa się z różnych typów komórek, których sygnatura genów wskazuje na role w obronie przeciwdrobnoustrojowej i odpornościowej. Makrofagi osadzone w warstwie nabłonka cewki moczowej reprezentują transkrypcjonalnie odrębny podtyp o rzekomej roli w nadzorze immunologicznym i prezentacji antygenu. Patogeny moczowi wypływają do góry cewki moczowej, aby dotrzeć do pęcherza. Badanie nabłonka cewki moczowej i powiązanych komórek odpornościowych pozwoli na lepsze zrozumienie mechanizmów obrony gospodarza w dolnym układzie moczowym. Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie zoptymalizowanych metod do rozpinania cewki moczowej żeńskiej myszy i izolowaniu nabłonka do dalszych analiz. Protokół opisuje zoptymalizowaną metodę izolacji tkanki nabłonkowej z cewki moczowej żeńskiej myszy przez delikatne enzymatyczne i mechaniczne oddzielenie. Po izolacji nabłonka opisano metody delikatnego enzymatycznego trawienia izolowanego nabłonka cewki moczowej i powiązanych komórek odpornościowych w celu uzyskania jednokomórkowych zawiesin o wysokiej żywotności. Protokół opisuje również metody analizy cytometrii przepływowej izolowanych komórek nabłonkowych cewki moczowej myszy i powiązanych komórek odpornościowych. Ponadto przedstawiono metody generowania wielowarstwowym 3D organoidalnych komórek nabłonkowych cewki moczowej z izolowanych komórek nabłonkowych. Protokół opisuje również zoptymalizowaną metodę całkowitego immunobarwienia arkuszy nabłonka cewki moczowej, które można wykorzystać do obserwacji morfologii i struktur molekularnych nabłonka cewki moczowej myszy i powiązanych komórek odpornościowych. Ogólnie rzecz biorąc, metody opisane tutaj do izolacji i pojedynczej enzymatycznej trawienia komórek nabłonkowych cewki moczowej myszy umożliwiają dalsze analizy, w tym immunobarwienie, cytometrię przepływową, generowanie organoidalne i sekwencjonowanie RNA z pojedynczych komórek.

Dysekcja i pobieranie cewki moczowej dorosłej samicy myszy
W pierwszej części tego badania autorzy przedstawiają szczegółowy protokół dotyczący dysekcji cewki moczowej samicy myszy. Biorąc pod uwagę jej przyczepienie do brzusznej ściany pochwy i położenie pod spojeniem łonowym, metoda przedstawiona tutaj pozwala na czyste wydzielanie pełnej długości cewki moczowej samicy (Rycina 1).
Izolacja tkanki nabłonkowej cewki moczowej i analiza cytometrii przepływowej dla pojedynczych izolatów
Trawienie trypsyną prowadzi do łatwego oddzielenia wyściółki nabłonkowej cewki moczowej od otaczającej tkanki łącznej. Po oddzieleniu można zaobserwować arkusze nabłonkowe o większej przezroczystości niż tkanki łącznej (Rycina 2). Oddzielone arkusze nabłonkowe dały pojedyncze zawiesiny komórkowe po trawieniu enzymatycznym. Pojedyncze komórki izolowane z nabłonka cewki moczowej wykazują stałą wysoką żywotność (>80%) przez wykluczenie trypanowego niebieskiego na liczniku hemocytometrowym (Rycina 2L) i cytometrię przepływową z zastosowaniem barwników żywotności do wyłączania martwych komórek (Rycina 3, Plik uzupełniający 1).
Autorzy przeprowadzili cytometrię przepływową w celu oceny wzbogacenia komórek nabłonkowych z pojedynczych zawiesin komórkowych nabłonka cewki moczowej. Aby sprawdzić żywotność komórek, zawiesinę komórek oznakowano żywym/martwym markerem, aminowym reaktywnym barwnikiem ghostowym V450. Autorzy konsekwentnie obserwowali żywotność komórek >80% poprzez marker żywy/martwy. Marker żywy/martwy umożliwił wyłączenie zanieczyszczeń i martwych komórek podczas analizy przepływowej. Próbki oznakowano markerem komórek nabłonkowych (CD326/EPCAM), markerem makrofagów (F4/80) i markerem komórek odpornościowych (CD45), aby zarejestrować skład komórek izolowanych za pomocą tej metody. Wyniki cytometrii przepływowej wykazały, że autorzy izolowali wzbogaconą populację komórek nabłonkowych z nabłonka cewki moczowej samicy myszy. Dla obu niezależnych eksperymentów osiągnięto 80–90% komórek nabłonkowych EPCAM-dodatnich po wyłączeniu żywych komórek. Autorzy obserwowali również ~1,30% komórek odpornościowych CD45+ w przygotowaniu nabłonka. Makrofagi związane z wyściółką nabłonkową stanowiły ~1,18% żywych komórek z komórtego nabłonka. Analiza cytometrii przepływowej pojedynczych zawiesin komórkowych z arkuszy nabłonkowych wykazała minimalne zanieczyszczenie stromalne (5–6%), co w większości przypisuje się endotelowi naczyniowemu zgodnie z ich poprzednim badaniem5. Plik uzupełniający 1 przedstawia wyniki cytometrii przepływowej dla preparatów pojedynczych komórek z przegród nabłonkowych i stromalnych. W porównaniu z 80–90% wzbogaceniem komórek nabłonkowych izolowanych z przegród nabłonkowych, przegród stromalnych również wykazywały 40–50% komórek nabłonkowych, które pochodzą z krótkich przewodów i nabłonka gruczołowego rozciągającego się od światła cewki moczowej do otaczającej tkanki łącznej (Rycina 3, Plik uzupełniający 1).
Hodowla organoidalna nabłonka cewki moczowej, histologia i immunuobarwienie
Autorzy pokazują również, jak pojedyncze komórki nabłonkowe izolowane z cewki moczowej są żywotne i mogą tworzyć organoidy w macierzy 3D oraz obserwowali wzrost organoidalny z pojedynczych komórek nabłonkowych cewki moczowej do 6 dnia w hodowli (Rycina 4B–G). Przeprowadzili barwienie hematoksyliną-eozyną (H&E), aby obserwować histologię organoidalną (Rycina 4H–J). Autorzy zaobserwowali dwie różne morfologie organoidalnych komórek nabłonkowych cewki moczowej, jedną dużą i pustą, a drugą mniejszą i sztywną. W obu przypadkach organoidy były warstwowe i naśladowały markery wyrażane w wyściółce nabłonkowej żeńskiej cewki moczowej, w tym KRT5 i P63 oznaczające warstwę podstawową oraz KRT4 i KRT13 oznaczające warstwy komórek suprabazalnych/pośrednich (Rycina 4K–N), Rycina uzupełniająca 1). Zbadano różnice w zdolności formowania organoidalnych między proksymalną a dystalną częścią cewki moczowej. Organoidy wygenerowane z proksymalnej części cewki moczowej miały większy udział pustych organoidalnych, podczas gdy organoidy z dystalnej części cewki moczowej tworzyły sztywne sfery (Rycina 4O–P). Ponadto zaobserwowali różnice w wydajności tworzenia organoidalnych w komórkach nabłonkowych izolowanych z proksymalnej i dystalnej części cewki moczowej. Dystalny nabłonek cewki moczowej tworzył organoidy z większą wydajnością niż proksymalny nabłonek cewki moczowej przy tej samej początkowej gęstości siewu (50

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka żeńskiej moczowodu myszy do analiz wtórnych, w tym cytometrii przepływowej, immunobarwienia i hodowli organoidalnej. Metody dały wzbogacone, żywe komórki nabłonkowe cewki moczowej, co potwierdzono za pomocą analizy cytometrii przepływowej, pełnego obrazowania i wydajnego tworzenia organoidów.

Zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji

The urethra, lined by epithelial cells, serves as the conduit for urine outflow from the body. The epithelial lining of the urethra comprises distinct ...

Nasz zespół jest zainteresowany badaniem układu nabłonkowego w drogach moczowo-płciowych. Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka żeńskiej cewki moczowodu myszy w celu dalszej analizy molekularnej i komórkowej. Metody opisane w tym artykule pomogą w badaniach nad żeńskim wyściółkiem cewki moczowodo i jego rolą w obronie immunologicznej.Na początek umieść eutanatyzowaną samicę myszy CD1 w wieku 6 do 12 tygodni w pozycji leżącej na plecach na stole sekccyjnym. Spryskaj brzuch 70% etanolem, aby zwilżyć sierść. Używając kleszczy, podnieś skórę na brzuchu.Następnie za pomocą małych nożyczek wykonaj pionowy nacięcie w kierunku dolnej części ciała, kończąc na zewnętrznym otworze cewki moczowodo. Zidentyfikuj pęcherz i delikatnie podnieś go kleszczami, upewniając się, że jest pusty i wolny od moczu. Używając nożyczek, przytnij tłuszcz i tkankę łączną wokół pęcherza, aby odsłonić motylkową strukturę, gdzie dwie kości łonowe łączą się w symplazji łonowej.Obserwuj przebieg cewki moczowodo pod symplazją łonową. Następnie podnieś symplazję łonową kleszczami i przetnij ją za pomocą nożyczek. Usuń fragmenty kości łonowej, aby odsłonić cienką cewkę moczową leżącą na brzusznej powierzchni ściany pochwy.Używając drobnych kleszczy, delikatnie pociągnij pęcherz w górę z jamy brzusznej. Przetnij nożyczkami między cewką moczową a ścianą pochwy, aby oddzielić drogi moczowe i rozrodcze. Utrzymuj lekką naprężność na pęcherzu podczas cięcia wzdłuż tylnej strony cewki moczowodo, aby oddzielić ją od ściany pochwy.Kontynuuj cięcie do dystalnego otwarcia cewki moczowodo, aby uzyskać pełną długość cewki moczowodo myszy, mierzącej 1,2 do 1,5 centymetra długości. Następnie oddziel cewkę moczową od pęcherza, wykonując pojedyncze cięcie w szyi pęcherza. Zbierz cztery do pięciu cewek moczowych w sterylnym pojemniku Petriego zawierającym świeże HBSS bez wapnia i magnezu.Pod mikroskopem sekccyjnym przytnij tłuszcz i tkankę łączną otaczającą cewkę moczową za pomocą drobnych kleszczy i nożyczek. Następnie za pomocą nożyczek przetnij każdą cewkę moczową na krzyż na dwie równe części. Umieść kawałki tkanki na górze 100 mikronowej sita z nylonu.Przemyj kawałki tkanki jednym mililitrą HBSS, a następnie przenieś je do 1,5 mililitrowego mikrocentryfugują zawierającego jeden mililitr 1% trypsyny przygotowanej w HBSS uzupełnionym o antybiotyki i antymykotyki. Następnie inkubatoruj próbkę na rotacji z 30 obrotów na minutę i cztery stopnie Celsjusza przez 15 do 30 minut. Po trawieniu dodaj 10 milimolarów chlorku magnezu przygotowanego w HBSS do probówki, a następnie 10 mikrogramów na mililitr DNAse I przygotowanego w PBS.Inkubatoruj probówkę przez 15 do 30 minut na rotacji umieszczonej wewnątrz pieca hybrydyzacyjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zgasić trypsynę, przenieś tkanki cewki moczowodo do 1,5 mililitrowej mikrocentryfugują zawierającej 10% surowicy owczej w HBSS w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach przenieś tkanki cewki moczowodo do nowej probówki zawierającej lodowato zimne HBSS, a następnie do sterylnego pojemnika Petriego zawierającego lodowato zimne HBSS.Podczas obserwacji próbki pod mikroskopem, przytrzymaj jednym końcem kawałka cewki moczowodo parą kleszczy. Używając innej pary kleszczy, przejdź wzdłuż całej długości kawałka cewki moczowodo, aby wypchnąć przezroczysty arkusz nabłonkowy. Przetwarzaj niektóre izolowane arkusze nabłonkowe cewki moczowodo bezpośrednio na całościową immunobarwienie w celu wizualizowania komórek nabłonkowych i makrofagów skojarzonych z nabłonkiem in situ.Użyj małej plastikowej pipety, aby przenieść kawałki nabłonkowe w kropli HBSS izolowanych z czterech do pięciu zbiorczych cewek moczowodo myszy do sterylnego pojemnika Petriego. Użyj nożyczek, aby pokroić nabłonek na małe fragmenty. Przenieś pokrojowane fragmenty nabłonka do dwumililitrowej mikrocentryfugują zawierającej 1,5 mililitra roztworu trawiennego Accutase przygotowanego w 37 stopniach Celsjusza.Inkubatoruj próbkę na rotacji w 37 stopniach przez jedną godzinę. Po inkubacji przenieś całą zawartość do pięciomililitrowej probówki wirówkowej zawierającej dwa mililitry buforu płukającego składającego się z wolnego od wapnia i magnezu 1X PBS i 1% BSA. Wiruj zawiesinę przy 600 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, używając wirówki z obrotowym koszem.Następnie odsysaj nadstan przy użyciu łagodnego odsysania. Następnie użyj jednomililitrowej pipety z końcówką filtra, aby ponownie zawiesić pellet w jednym mililitru buforu płukającego. Rozbij pellet pipetowaniem w górę i w dół, aż grudki staną się mniejsze.Przepuść zawiesinę przez igły 23,5 kalibru i 26,5 kalibru, każda zamocowania do jednomilitrowej strzykawki za pomocą czterech pociągnięć

an-optimized-method-to-isolate-female-mouse-urethral-epithelium-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie zostaną zaprezentowane metody transuretralnego indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy oraz sposoby ilościowego określania zakresu powstałych infekcji.

Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Źródło: Yang, E. i inni. Izolacja pojedynczych społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych uzyskanych na podstawie modelu myszego zakażenia dróg moczowych do analizy pojedynczych komórek w dalszej fazie. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje ręczną izolację pojedynczych komórek nabłonkowych zawierających wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne z zakażonego pęcherza mysiego za pomocą mikropipetowania w jamie ustnej, umożliwiając dalszą analizę pojedynczych komórek populacji E. coli...

Izolacja komórek nabłonkowych pęcherza myszy zawierających wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne

W tym filmie opisujemy procedurę sekcji układu moczowo-płciowego lub UGS od męskiego modelu myszy. Ten UGS jest dalej analizowany ex vivo w celu wyizolowania gruczołu krokowego i zbadania jego roli w rozwoju raka prostaty.

Ekstrakcja prostaty z układu moczowo-płciowego myszy: technika oddzielania gruczołu krokowego od innych narządów moczowych i płciowych u samców myszy

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Ten protokół opisuje jednodniową metodę izolacji komórek nabłonka ludzkiego jajowodu. Izolowane komórki nabłonkowe można siać w hodowli dwuwymiarowej (2D) lub dysocjować do zawiesin jednokomórkowych i wykorzystywać w dalszych eksperymentach, w tym cytometrii przepływowej i sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki.

Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka cewki moczowej myszy do analizy pojedynczych komórek, immunofluorescencji i hodowli organoidów. Technika umożliwia badanie mechanizmów obrony gospodarza w dolnym odcinku układu moczowego.

Zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów