Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

W ramach naszych badań opracowano zintegrowaną metodę jednoczesnego rejestrowania aktywności astrocytów i neuronów podczas udaru niedokrwiennego u myszy w trakcie zachowywania się. Poprzednie metody pozwalały na oddzielną rejestrację neuronów lub astrocytów. Nasz protokół umożliwia jednoczesne przechwytywanie sygnałów z astrocytów i neuronów już od pierwszych chwil wystąpienia udaru.

Na początek przenieś głęboko znieczuloną mysz szczepu C57BL/6J do aparatu stereotaksycznego wyposażonego w maskę do znieczulenia. Monitoruj głębokość znieczulenia co 10 minut, utrzymując temperaturę ciała myszy w zakresie od 36 do 37,5 °C za pomocą podgrzewanego podkładu z systemem sprzężenia zwrotnego. Po nałożeniu maści oftalmicznej do oczu przymocuj mysz do aparatu stereotaksycznego za pomocą uchwytów usznych i uchwytu do pyska.

Po symetrycznym unieruchomieniu głowy potwierdzić jej stabilność za pomocą delikatnego badania dotykowego. Po depilacji i antyseptycznym przygotowaniu skóry naciąć linię środkową za pomocą nożyczek chirurgicznych. Oczyścić okostną solą fizjologiczną i patyczkami bawełnianymi, aby odsłonić bregma i lambda.

Obniż szklaną mikropipetę, aby kolejno dotknąć punktu bregma i lambda. Po odczytaniu współrzędnej Z na cyfrowym pomiarowym suwmiarzu, dostosuj poprzeczkę ustną, aż różnica wyniesie mniej niż 0,04 milimetra. Obniż szklaną mikropipetę, aby dotknąć punktu bregma, a następnie zresetuj cyfrowy suwmiarz do zera.

Przesuń mikropipetę sukcesywnie o 2,3 milimetra w lewo i w prawo od bregmy. Po odnotowaniu współrzędnej Z, dostosuj pręty uszne tak, aby różnice bilateralne były mniejsze niż 0,04 milimetra. Po zresetowaniu cyfrowego suwmiarki do zera w punkcie bregmy, wyznacz obszar przedniego ramienia kory ruchowej w punkcie przednio-tylnym plus 1,5 milimetra i przyśrodkowo-bocznym plus 0,74 milimetra.

Używając mikrowiertarki i okrągłych wierteł o średnicy 0,5 mm, wykonaj mały otwór o średnicy około 0,5 mm w zaznaczonym miejscu. Przed podaniem, zmieszaj dwa wektory wirusowestkowane adeno-zależne (AAV) w równych objętościach i krótko odwiruj próbkę. Opuść szklaną mikropipetę podłączoną do pompy mikroinfuzyjnej do miejsca docelowego na głębokość grzbietowo-brzuszną minus 0,94 mm od powierzchni mózgu.

Wprowadzić 400 nanolitrów mieszaniny wirusowej zawierającej po 200 nanolitrów każdego wektora z prędkością 50 nanolitrów na minutę. Powoli wycofać pipetę 10 minut po zakończeniu infuzji. Założyć szew na skórze głowy, używając nici 4-0 o długości 20 milimetrów i igły 3/8 koła, a następnie umieścić mysz na podgrzewaczce do czasu pełnego wyzdrowienia.

Od trzech do czterech tygodni po iniekcji wirusa postępuj zgodnie z wcześniej opisaną procedurą aż do momentu nacięcia skóry głowy. Podczas nacięcia usuń fragment skóry głowy o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 centymetra, zachowując wystarczającą ilość skóry wokół oczu. Oczyść czaszkę nadtlenkiem wodoru oraz 0,9% solą fizjologiczną.

Po zlokalizowaniu punktu bregma wyzeruj cyfrowy suwak pomiarowy. Używając wiertła z okrągłą końcówką o średnicy 0,8 mm, lekko zmatowij powierzchnię czaszki. Wyznacz obszar przedniej kończyny w korze ruchowej.

W wymiarze przednio-tylnym 1,5 milimetra i boczno-przyśrodkowym 0,74 milimetra. Wykorzystując ten punkt jako środek, narysuj kwadrat o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów. Używając mikrowiertła przy prędkości około 10 000 obrotów na minutę, wykonaj nacięcie wzdłuż obrysu kwadratu.

Ciągle aplikuj lodowatą sól fizjologiczną wzdłuż toru wiercenia i natychmiast przerwij czynność, jeśli płatek kostny poluzuje się. Wywierć trzy małe otwory o średnicy 0,5 millimeter w obrębie przeciwległej półkuli i móżdżku. W otwory wprowadź wkręty do kranioplastyki.

Należy upewnić się, że każda śruba dosięga opony twardej, ale nie wnika głębiej, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej. Za pomocą pincety należy usunąć poluzowany płat kostny. Do usunięcia opony twardej w obrębie okna czaszkowego należy użyć pęsety ultrapowierzchniowej z końcówką o rozmiarach mniejszych niż 0,03 mm na 0,01 mm, unikając bezpośredniego kontaktu z tkanką mózgową.

Przymocuj optrodę do ramienia micromanipulatora w aparacie stereotaksycznym i przesuń ją nad okno czaszkowe. Solidnie splot srebrne przewody uziemiające i referencyjne optrody z trzema śrubami do kranioplastyki. Oczyść powierzchnię okna czaszkowego sterylną solą fizjologiczną.

Powoli opuść optrodę na pożądaną głębokość grzbietowo-brzuszną wynoszącą -0,94 mm w tempie 1 mm na 10 sekund. Po implantacji nałóż warstwę agarozy na okno czaszkowe. Nałóż od trzech do czterech warstw cementu dentystycznego.

Po stwardnieniu cementu dentystycznego należy podawać leki przeciwbólowe przez trzy do pięciu dni i pozostawić mysz do rekonwalescencji na okres od jednego do dwóch tygodni. Do wzbudzenia GCaMP6s należy użyć systemu fotometrii światłowodowej o dwóch lub trzech długościach fal. Kanał sygnałowy należy ustawić na 470 nanometrów, a kanał kontrolny na 410 nanometrów.

Ustaw częstotliwość próbkowania na 60 klatek na sekundę. Następnie należy odpowiednio uziemić wszystkie komponenty systemu rejestrującego. Podczas rejestracji stosuj wspólną referencję środkową.

Upewnij się, że w oprogramowaniu rejestrującym wybrano sygnały szerokopasmowe oraz lokalne potencjały polowe, monitorując obecność szumów przez cały czas trwania sesji nagraniowej. Po krótkim znieczuleniu myszy podłącz optrodę do linii rejestrującej za pomocą adaptera. Umieść mysz w środowisku przypominającym klatkę domową w celu przeprowadzenia pomiarów.

Po przebudzeniu należy odczekać 10 minut w celu aklimatyzacji. Należy zarejestrować mysz podczas wykonywania testu siły chwytu, wymagającego jednego pociągnięcia na minutę przez pięć minut. Testy behawioralne należy precyzyjnie oznaczyć znacznikami czasu zarówno w systemie wielokanałowym, jak i w systemie fotometrii włóknowej.

Podaj roztwór barwnika różowej bengali (Rose Bengal) w stężeniu 1,5% drogą dosytrawniczą w dawce od 10 do 20 mg/kg i odczekaj pięć minut. Po osiągnięciu i utrzymaniu głębokiej anestezji podłącz sondę optrodową do źródła lasera. Przez wszczepiony optrod skieruj wiązkę lasera o długości fali 530 nm i mocy 15 mW przez okres od pięciu do ośmiu minut, aby wywołać niedokrwienie ogniskowe.

Aby przeprowadzić stymulację optogenetyczną, podłącz stymulator laserowy do optrody. Włącz optogenetyczny stymulator laserowy o długości fali 488 nanometr i ustaw go na 10 milliwattów na pięć minut w przypadku Opto-vTrap. Na koniec umieść mysz na podgrzewanej podkładce w celu rekonwalescencji.

W porównaniu z wartościami wyjściowymi, przepływ krwi mózgowej spadł po fototrombazie i pozostał obniżony w pierwszej oraz siódmej dobie po udarze. Siła chwytu przedniej kończyny wykazala wysoce istotny spadek w pierwszej dobie i pozostała obniżona w siódmej dobie po udarze. Przejściowe zmiany poziomu wapnia w astrocytach rejestrowane za pomocą fotometrii włókiennej oraz impulsy neuronalne z elektrofizjologii zostały zsynchronizowane na podstawie znaczników czasu.

Po udarze fototromboticznym częstotliwość wyładowań była znacząco obniżona zarówno w neuronach piramidowych, jak i interneuronach w porównaniu z częstotliwością wyładowań bazowych podczas zadania chwytania przednią kończyną. W stanie bazowym przelotne wzrosty poziomu wapnia w astrocytach osiągały szczyt w ciągu od czterech do sześciu sekund od rozpoczęcia zadania. Jednakże amplituda ta była znacząco zredukowana po udarze fototromboticznym, co odzwierciedlało osłabioną aktywność wapniową.

Wykresy rasterowe oraz histogramy czasu okołobodziegczego (PSTH) wykazały zmiany w aktywności neuronalnej podczas stymulacji optycznej. Częstość wyładowań zarówno neuronów piramidalnych, jak i interneuronów uległa znacznemu zmniejszeniu po stymulacji optycznej w porównaniu z linią bazową sprzed bodźca, co potwierdza, że modulacja astrocytów wywiera mierzalny wpływ na pobudliwość lokalnego obwodu. Protokół ten umożliwia nieprzerwany zapis aktywności neuronalnej i przebiegu ćwiczeń w całym czasie od wystąpienia ostrego udaru aż do fazy przewlekłej.

Sukces w tym protokole zależy od precyzyjnego lub skoordynowanego wyrównania. Monokularna implantacja optrod oraz wystarczający czas ekspresji wirusa w trakcie zabiegów są kluczowe. W przyszłych badaniach można zastosować wiele implantów w celu monitorowania szerszych obszarów mózgu lub celowania w różne typy komórek przy użyciu zróżnicowanych testów behawioralnych.