ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było wspierane przez następujące granty: AI26170; The Evelyn-Lipper Family Foundation i Gruss Lipper Biophotonics Center. Wyrażamy wdzięczność za wsparcie ze strony Analytical Imaging Facility, wspierane przez grant NCI Cancer Center P30 CA013330.

Wszystkie procedury przeprowadzano zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i opieki nad zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Stosowania Ich w Albert Einstein College of Medicine (IACUC). Szczep mc28471 jest transformantem pYUB1169 szczepu mc27902, tripl-auxotroficznego szczepu Mtb zatwierdzonego do użytku na poziomie BSL-2. Wszystkie prace z żywymi bakteriami były wykonywane z zachowaniem standardowych środków ostrożności przy obsłudze prącików.
1. Konstruowanie szczepu Mtb mc28471 zatwierdzonego na poziomie BSL-2, ekspresującego tdTomato
<ol>
	<li>Generowanie szczepu mc28471 ekspresującego tdTomato i bezpiecznego na poziomie BSL-2 przez transformację plasmidową
	<ol>
		<li>Transformować szczep mc27902 zatwierdzony na poziomie BSL-2, tripl-auxotroficzny, z episomalnym plasmidem prątków pYUB1169, który zawiera gen tdTomato ekspresowany z promotora G13, aby wygenerować fluorescencyjnego potomka mc28471.</li>
		<li>Zaszczepić 100 µL mc27902 (gęstość optyczna przy 600 nm (OD600 nm) 0,7-1,0) w 10 mL sterylnego Middlebrook 7H9 uzupełnionego wzbogaceniem OADC (10% (v/v)), glicerolem (0,2% (v/v)), D-pantotenianem (24 mg/L), L-leucyną (50 mg/L), L-argininę (200 mg/L), propionianem sodu (0,1 mM) i tyloksapolem (0,05% (v/v)) w 30 mL butelce z atramentu.</li>
		<li>Inkubacja kultury, powoli wstrząsając (100 rpm) w 37 °C do osiągnięcia OD600 nm 0,7-1,0.</li>
		<li>Przeniesienie komórek do 15 mL stożkowego śrubkowego probówki i wirowanie przez 10 min przy 3 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucenie nadstanu i ponowne zawieszenie komórek w 10 mL sterylnego 10% glicerolu zawierającego 0,05% (v/v) tyloksapolu (pranienie #1). Powtórzenie wirowania i pranień 2x. Ponowne zawieszenie pelletu komórkowego w 0,175 mL 10% glicerolu zawierającego 0,05% (v/v) tyloksapolu i dodanie 2 µL DNA pYUB1169 (100-200 ng DNA).</li>
		<li>Przeniesienie mc27902 i pYUB1169 do elektroporacyjnej kubeczki o średnicy 0,2 cm. Poczekać 10 min. Dotknąć kubeczki 2x do 3x, aby usunąć bąbelki powietrza i wykonać elektroporację przy 2 500 mV, 1 000 Ω, 25 µF, stała czasu 20 ms, w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodanie 1 mL sterylnego Middlebrook 7H9 uzupełnionego wzbogaceniem OADC (10% (v/v)), glicerolem (0,2% (v/v)), D-pantotenianem (24 mg/L), L-leucyną (50 mg/L), L-argininę (200 mg/L), propionianem sodu (0,1 mM) i tyloksapolem (0,05% (v/v)) do kubeczka i przeniesienie zawartości kubeczka do 15 mL stożkowego śrubkowego probówki. Inkubacja probówki z wstrząsaniem w 37 °C przez noc.</li>
		<li>Wykonanie 0,1 mL mieszaniny transformacyjnej na płytce agarowej Middlebrook 7H10 uzupełnionej wzbogaceniem OADC (10% (v/v)), glicerolem (0,2% (v/v)), D‑pantotenianem (24 mg/L), L‑leucyną (50 mg/L), L‑argininę (200 mg/L), propionianem sodu (0,1 mM) i kanamacyną (20 mg/L). Wirowanie pozostałej mieszaniny transformacyjnej, odrzucenie 0,9 mL nadstanu i ponowne zawieszenie pelletu komórkowego w pozostałym nadstanie. Wykonanie wykonanie płytki z ponownie zawieszonymi komórkami na drugiej płytce agarowej Middlebrook 7H10 zawierającej te same suplementy i antybiotyki. Inkubacja płytek w 37 °C przez 3-4 tygodnie. Różowe kolonie wskazują na pomyślne transformanty.</li>
		<li>Wybranie jednej izolowanej różowej kolonii i jej uprawa w 37 °C, powoli wstrząsając, w 5 mL sterylnego Middlebrook 7H9 uzupełnionego wzbogaceniem OADC (10% (v/v)), glicerolem (0,2% (v/v)), D-pantotenianem (24 mg/L), L-leucyną (50 mg/L), L-argininę (200 mg/L), propionianem sodu (0,1 mM), tyloksapolem (0,05% (v/v)) i 20 mg/L kanamacyny w 30 mL butelce z atramentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mc28471 do infekcji dożylnej
	<ol>
		<li>Uprawa 10 mL mc28471 w 37 °C, powoli wstrząsając, w sterylnym Middlebrook 7H9 uzupełnionym wzbogaceniem OADC (10% (v/v)), glicerolem (0,2% (v/v)), D-pantotenianem (24 mg/L), L-leucyną (50 mg/L), L-argininę (200 mg/

<ol><li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+intravital+microscopy+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Multiphoton intravital microscopy of rodents.</a> Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).</li>
<li>Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+Through+a+Lens%3A+Technological+Development+and+Applications+in+Intravital+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy.</a> Cytometry A. 97 (5), 445-447 (2020).</li>
<li>Perrin, L., Bayarmagnai, B., Gligorijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontiers+in+Intravital+Multiphoton+Microscopy+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Rep+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Frontiers in Intravital Multiphoton Microscopy of Cancer.</a> Cancer Rep (Hoboken). 3 (1), e1192(2020).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Permanent+Window+for+Investigating+Cancer+Metastasis+to+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung.</a> J Vis Exp. (173), e62761(2021).</li>
<li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+High-Resolution+Intravital+Microscopy+in+the+Lung+with+a+Vacuum+Stabilized+Imaging+Window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window.</a> J Vis Exp. (116), e62761(2016).</li>
<li>Presson, R. G. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+within+the+murine+thorax+without+respiratory+and+cardiac+motion+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact.</a> Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging%3A+General+overview+and+technical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), e29917(2014).</li>
<li>Prunier, C., Chen, N., Ritsma, L., Vrisekoop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+and+applications+of+long-term+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Procedures and applications of long-term intravital microscopy.</a> Methods. 128, 52-64 (2017).</li>
<li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li>
<li>Magnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+myeloid+depot+for+SARS-CoV-2+in+the+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Immediate myeloid depot for SARS-CoV-2 in the human lung.</a> Sci Adv. 10 (31), eadm8836(2024).</li>
<li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+Alveolar+Macrophages+Conceal+Bacteria+from+the+Immune+System+to+Maintain+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patrolling Alveolar Macrophages Conceal Bacteria from the Immune System to Maintain Homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125.e11 (2020).</li>
<li>Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+two-photon+imaging+of+in+vivo+cellular+pathophysiology+upon+influenza+virus+infection+using+the+two-photon+IMPRESS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS.</a> Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).</li>
<li>van de Wall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+landscapes+and+protective+immunity+coordinated+by+influenza-specific+lung-resident+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+revealed+by+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic landscapes and protective immunity coordinated by influenza-specific lung-resident memory CD8(+) T cells revealed by intravital imaging.</a> Immunity. 57 (8), 1878-1892.e5 (2024).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+excitation+increases+detection+sensitivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+beta-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Intravital excitation increases detection sensitivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with beta-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. 10 (6-7), 821-829 (2017).</li>
<li>Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mycobacterium+tuberculosis+in+Mice+with+Reporter+Enzyme+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence.</a> J Vis Exp. (132), e56801(2018).</li>
<li>Sommer, R., Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Tuberculosis+Drug+Activity+in+Live+Animals+by+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Monitoring Tuberculosis Drug Activity in Live Animals by Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01280-19(2019).</li>
<li>Castanheira, F. V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+three+different+microvascular+beds+in+SARS-CoV-2-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of three different microvascular beds in SARS-CoV-2-infected mice.</a> Blood Adv. 7 (15), 4170-4181 (2023).</li>
<li>Barlerin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Level+3+setup+for+multiphoton+microscopy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Biosafety Level 3 setup for multiphoton microscopy in vivo.</a> Sci Rep. 7 (1), 571(2017).</li>
<li>Vilcheze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Design+of+Biosafety+Level+2-Approved%2C+Multidrug-Resistant+Strains+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+Nutrient+Auxotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rational Design of Biosafety Level 2-Approved, Multidrug-Resistant Strains of Mycobacterium tuberculosis through Nutrient Auxotrophy.</a> mBio. 9 (3), e00938-18(2018).</li>
<li>Shinkai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-2-deficient+mice+lack+mature+lymphocytes+owing+to+inability+to+initiate+V%28D%29J+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement.</a> Cell. 68 (5), 855-867 (1992).</li>
<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).</li>
<li>Cohen, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophages+Provide+an+Early+Mycobacterium+tuberculosis+Niche+and+Initiate+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophages Provide an Early Mycobacterium tuberculosis Niche and Initiate Dissemination.</a> Cell Host Microbe. 24 (3), 439-446.e4 (2018).</li>
<li>Pandey, A. K., Sassetti, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+persistence+requires+the+utilization+of+host+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (11), 4376-4380 (2008).</li>
<li>Bhatt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+kasB+in+Mycobacterium+tuberculosis+causes+loss+of+acid-fastness+and+subclinical+latent+tuberculosis+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deletion of kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5157-5162 (2007).</li>
<li>Hsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+mechanism+of+attenuation+of+bacillus+Calmette-Guerin+is+a+loss+of+secreted+lytic+function+required+for+invasion+of+lung+interstitial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12420-12425 (2003).</li>
<li>Vilcheze, C., Porcelli, S. A., Chan, J., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+by+Adaptive+Immunity+of+a+Conditionally+Persistent+Mutant+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Sterilization by Adaptive Immunity of a Conditionally Persistent Mutant of Mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 12 (1), e02391-20(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Ta platforma zamyka prawdziwą lukę w badaniach nad gruźlicą, umożliwiając bezpośrednią wizualizację prątków i interakcji z komórkami żywiciela w całym płucu ssaków w warunkach BSL-2. Wcześniejsze strategie obrazowania in vivo, w tym pełne wykrywanie optyczne za pomocą światłowodowej mikroskopii endoskopowej20, obrazowanie fluorescencyjne enzymów reporterowych21 oraz wykrywanie Mtb zbliżonej do podczerwieni ekspresującej białko fluorescencyjne22</s...

Wysokorozdzielczowa mikroskopika intravitalna zmieniła badania dynamicznego zachowania komórek w całych tkankach, umożliwiając bezpośrednie obserwowanie migracji komórek, interakcji naczyniowych i nadzoru immunologicznego z rozdzielczością pojedynczych komórek1,2,3,4. Chociaż podejścia te są szeroko stosowane w badaniach nad rakiem3,5, ich zastosowanie w zakażeniach płuc było ograniczone przez ruch oddechowy, delikatność tkanek i ograniczenia biobezpieczeństwa. Ostatnie osiągnięcia w platformach obrazowania klatki piersiowej, w tym stabilizowane próżniowo i trwale zaimplantowane okna optyczne, pozwoliły na przezwyciężenie wielu z tych trudności technicznych, zapewniając stabilne, wolne od ruchu obrazy mikrośrodowiska płuc w dłuższym czasie6,7,8,9,10. Szczególnie trwale zaimplantowane okna są potężnymi narzędziami, ponieważ umożliwiają wielokrotne obrazowanie przepływu naczyniowego, dynamiki komórek immunologicznych i zachowania pojedynczych komórek przez wiele godzin do tygodni i były istotne w definiowaniu mechanizmów przerzutów nowotworowych, przepuszczalności naczyń i nadzoru immunologicznego11,12.
Mimo tych osiągnięć, obrazowanie intravitalne nie było dotąd stosowane do zakażenia Mycobacterium tuberculosis (Mtb) w ssaczym płucu in vivo z rozdzielczością pojedynczych komórek. Najbliższe precedensy pochodzą z obrazowania intravitalnego zakażeń mykobakteryjnych w innych ustawieniach. Obrazowanie w czasie rzeczywistym zakażenia Mycobacterium marinum  w zarodkach rybki zwanej danio pręgowanym13 ujawniło wczesne interakcje makrofagów i inicjację stwierdzenia, podczas gdy dwufotonowe obrazowanie stwierdzeń wywołanych przez BCG w wątrobie myszy14,15 ujawniło dynamikę makrofagów i komórek T podczas rozwoju stwierdzenia i wykazało ograniczone prezentowanie antygenów i funkcję efektorów komórek T w obrębie zmian stwierdzennych. Te badania dały podstawowe wglądy w interakcje między gospodarzem a patogenem mykobakteryjnym, ale nie miały dostępu do całej ssaczej płuca8,16.
Podejścia do obrazowania intravitalnego zostały również zastosowane w płucach w innych kontekstach zakaźnych i biologicznych, w tym ogólne obrazowanie płuc8, badania wykazujące, że patrolujące makrofagi pęcherzykowe mogą ukrywać bakterie przed układem odpornościowym17 i charakteryzujące natychmiastową odpowiedź mieloidów na infekcję SARS-CoV-2 w ludzkim płucu16. Obrazowanie intravitalne zostało również zastosowane do zakażonych grypą płuc, umożliwiając bezpośrednie obrazowanie dynamicznego zachowania komórek odpornościowych w zakażonym tkance płucnej18,19.
Podejścia do obrazowania optycznego całego ciała z wykorzystaniem mikroskopii światłowodowej z wzbudzeniem przez światłowód20 i technologii fluorescencji enzymów reporterowych21,22 umożliwiły czułe wykrywanie Mtb w płucach myszy, ale nie mogą wykrywać pojedynczych lub małych skupień pręcików, śledzić dynamiki agregacji bakterii ani wizualizować bezpośrednich interakcji między mykobakteriami a komórkami gospodarza w całej tkance płucnej. Podejścia do obrazowania intravitalnego z wysokiej zawartości zostały zaimplementowane dla zakażonych płuc w ustawieniach BSL-3, w tym infekcji SARS-CoV-223 i platformy wielofotonowego obrazowania skoncentrowanego na Mtb24. Te badania pokazują wykonalność obrazowania zakażonych płuc pod zabezpieczeniami, ale takie ustawienia pozostają technicznie wymagające i nie są szeroko dostępne. Praca z wirulentnym Mtb wymaga zabezpieczeń BSL-3, co stanowi znaczne wyzwania inżynieryjne i dotyczące biobezpieczeństwa dla obrazowania intravitalnego23,24. W rezultacie większość badań nad wczesnym zakażeniem Mtb opiera się na statycznych testach końcowych, które nie mogą uchwycić przestrzennej i czasowej dynamiki zachowania bakterii w płucach.
Rozwój genetycznie zdefiniowanych, zatwierdzonych przez BSL-2, potrójnie auxotroficznych szczepów Mtb daje unikalną możliwość pokonania tych ograniczeń. Szczep mc27902, pochodna auxotroficzna Mtb pantothenate-leucine-arginine od H37Rv, jest w pełni osłabiona, nie replikuje się u myszy z osłabionym układem odpornościowym, zachowuje klasyczne barwienie kwasooporne, wykazuje normalną podatność na fag i może być bezpiecznie obsługiwana poza zabezpieczeniami BSL-3

<table><tbody><tr><td>15 ml conical tube</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie&nbsp;</td><td>Ethicon, Inc</td><td>LA55G</td><td></td></tr><tr><td>5 mm coverslip</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72296-05</td><td></td></tr><tr><td>5 mm disposable biopsy punch</td><td>Integra</td><td>33-35-SH</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk purse-string suture&nbsp;</td><td>Ethicon, Inc</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>Blunt micro-dissecting scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Hospira</td><td>0409-2012-32</td><td>Injection of 10 &mu;L buprenorphine (0.3 mg/mL stock solution) diluted in 90 &mu;L of sterile PBS (final dose = 0.1 mg/kg)&nbsp;</td></tr><tr><td>Compressed air canister</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate adhesive</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td></td></tr><tr><td>D-calcium pantothenate</td><td>Acros</td><td>243305000</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety stand</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0051</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB102</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD150S-1G</td><td>150 kDa</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td>To grasp and elevate the rib during the lung window implantation procedure</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>&nbsp;Pivetal</td><td>78949580</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer</td><td>SurgiVet</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Goldbio.com</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine monohydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5131-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue mice</td><td>Jackson Labs</td><td>Strain #: 026051</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>Difco</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC Enrichment</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Murine ventilator</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02</td><td>PhysioSuite</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church &amp; Dwight Co., Inc.</td><td>40002957</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PETG media inkwell bottle</td><td>Thermo Scientific</td><td>342020</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-5623</td><td>To monitor the mouse&rsquo;s tidal volume via intubation during surgery</td></tr><tr><td>Plasmid pYUB1169</td><td>Custom made plasmid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rag2 KO mice</td><td>Jackson Labs</td><td>Strain #: 008449</td><td></td></tr><tr><td>Small animal lung inflation bulb</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-9083</td><td></td></tr><tr><td>Sodium propionate</td><td>Thermo Scientific</td><td>A17440.36</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB705</td><td></td></tr><tr><td>Sorval Centrifuge X pro series</td><td>Thermo Scientific</td><td>75009020</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Genesys 10 UV</td><td>Thermo Spectronic</td><td>335903</td><td></td></tr><tr><td>SurgiSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M02</td><td>Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming</td></tr><tr><td>Tracheal catheter</td><td>Exelint International</td><td>26746</td><td>22G</td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0307-50G</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pickup system metal probe&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>528-112</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Intravital Imaging of Attenuated Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis in Murine Lung during Early Intravascular Infection

Mikroskopia intravitalna umożliwia bezpośrednie wizualizowanie dynamicznych procesów komórkowych w nienaruszonych tkankach. Jednak jej zastosowanie do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) było ograniczone przez wymagania dotyczące poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3) i trudności techniczne związane ze stabilizowaniem płuc w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości obrazu. Przedstawiamy protokół, który łączy okno klatki piersiowej do wysokiej rozdzielczości obrazowania płuc mysich (WHRIL) z mc27902, genetycznie określoną potrójnie auxotroficzną szczepem Mtb zatwierdzoną do stosowania w warunkach BSL-2. Opisujemy również wytworzenie mc28471, pochodnej szczepu mc27902 ekspresującej tdTomato, jej przygotowanie do infekcji dożylnej oraz zastosowanie do obrazowania intravitalnego w myszy reporter. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wczesnej dynamiki infekcji, w tym szybkiego wnikania pręcików do naczyń płucnych, agregacji, rozsiewu do parenchymy płuc i pożerania przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płucnym przez pierwsze 3 dni po infekcji. Umożliwiając longitudinalne obrazowanie pręcików i interakcji gospodarz–pasożyt z rozdzielczością pojedynczej komórki, podejście to pozwala na pokonywanie kluczowych ograniczeń związanych z konwencjonalnymi modelami obrazowania i wysokiego poziomu zabezpieczeń. Ten protokół zapewnia praktyczną, zgodną z BSL-2 platformę do obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym uwzględniającą osłabione pręciki w płucach i stanowi podstawę do przeprowadzania badań mechanistycznych fizjologii bakterii, rozpoznawania gospodarza i oczyszczania opartych na odpowiedzi immunologicznej.

Po elektroporacji i selekcji kanamycyną izolowane kolonie mc28471 wykazywały intensywną czerwoną fluorescencję, co potwierdziło stabilną ekspresję tdTomato. Prątki mc28471 namnożono, przygotowano w formie zawiesiny pojedynczych komórek i podano dożylnie myszom z chirurgicznie implantowanym WHRIL. Przeprowadzono obrazowanie intravitalne w celu wizualizacji wczesnej dynamiki infekcji Mtb w mikrośrodowisku płuc. W badaniu tym, przed infekcją, pozyskano obrazy bazowe naczyń krwionośnych płuc (<strong cl...

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Intravital microscopy enables direct visualization of dynamic cellular processes within intact tissues. However, its application to Mycobacterium ...

intravital-imaging-attenuated-auxotrophic-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Niu, L. i in. Wizualizacja śmierci limfocytów makrofagów podczas zakażenia mykobakteriami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii śródwitalnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii konfokalnej wewnątrzżyciowej do wizualizacji litycznej śmierci komórek makrofagów u zarodków danio pręgowanego po zakażeniu Mycobacterium marinum .

Obrazowanie na żywo śmierci komórek makrofagów podczas infekcji mykobakterią w zarodkach danio dano pręgowanego

Źródło: Bernut, A. i inni. Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania rdzenia ropnia Mycobacterium absceptus w zarodkach danio dano dano. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje protokół wykorzystujący transgeniczne zarodki danio danio ekspresyjne ekspresujące makrofagi fluorescencyjne i zakażone fluorescencyjnym szczepem Mycobacterium abscessus rough do wizualizacji interakcji żywiciel-patogen. Pokazuje, jak pozakomórkowe przewody umożliwiają unikanie odporności, wspierając...

Obrazowanie na żywo interakcji żywiciel-patogen w zarodkach danio dano zakażonych Mycobacterium abscessus

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Ten protokół opisuje technikę wizualizacji zachowania i śmierci makrofagów u embrionalnego danio pręgowanego podczas infekcji Mycobacterium marinum. Uwzględniono etapy przygotowania bakterii, zakażenia zarodków i mikroskopii przyżyciowej. Technika ta może być stosowana do obserwacji zachowania komórek i śmierci w podobnych scenariuszach obejmujących infekcję lub sterylny stan zapalny.

Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania śródskórnej inokulacji Mycobacterium avium w uchu myszy w niskiej dawce, aby odzwierciedlić warunki podobne do ekspozycji.

Śródskórne inokulowanie Mycobacterium avium w uchu myszy

Albert Einstein College of Medicine.  Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Przeglądaj więcej filmów