System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii
12 maja 2026
Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.
Niniejsze badanie bada, jak zsynchronizowane oscylatorowe hiperglikemia i pulsujące naprężenie ścinające razem powodują dysfunkcję śródbłonka w cukrzycowej chorobie naczyń. Istniejące modele wykorzystują wysoki początkowy poziom glukozy lub stały laminarny przepływ. Badamy, jak pulsujące naprężenie ścinające przeciwdziała oscylatorowemu uszkodzeniu glukozy.
Na początek użyj oprogramowania do wspomaganego komputerowo projektowania, aby zaprojektować strukturę mikroczipu. Wykonaj master formy SU-8 poprzez komercyjną firmę. W czystym kubku mieszania wymieszaj środek utwardzający i prepolimer polidimetyloksylan w stosunku 10:1 wagowym i energicznie mieszaj ręcznie przez pięć minut.
Następnie umieść pojemnik w komorze próżniowej przy ciśnieniu 0,08 megapaskala przez co najmniej 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione podczas mieszania. Wlej polidimetyloksylan na wafer umieszczony w szklanej miseczce Petriego. Odgazuj polidimetyloksylan wlewaną na wafer w egzaleratorze przez kolejne 15 minut, aby usunąć wszelkie bąbelki powstałe podczas odlewania.
Umieść miseczkę Petriego zawierającą formę i polimer w piekarniku ustawionym na 80 stopni Celsjusza na dwie godziny. Za pomocą skalpela ostrożnie zdejmij stwardniały polimer z master formy. Za pomocą narzędzia do wybijania rdzeni stwórz porty wlotowe i wylotowe na wyznaczonych końcach kanałów na polimerze.
Wyczyść szklany pokrywający szlifowane szkło i wzorowaną powierzchnię polimeru za pomocą taśmy klejącej. Następnie traktuj zarówno polimer, jak i szklany pokrywający szlifowane szkło czyszczarką plazmową z mocą 65 watów w zwykłym powietrzu przez 60 sekund. Natychmiast wyrównaj powierzchnię kanału polimeru z traktowaną stroną szklanego pokrywającego szlifowane szkło.
Następnie delikatnie dociśnij, aby stworzyć trwale zamknięty mikrokanałowy chip. Umieść związany mikrokanałowy chip w borowanej szklanej butelce wypełnionej zjonizowaną wodą. Wysterylizuj przez autoklawowanie w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 funtów na cal kwadratowy przez 20 minut.
Umieść wysterylizowany chip w 60-milimetrowej miseczce kulturalnej wypełnionej równomolowym mieszaniem PBS i DMEM z niską zawartością glukozy. Następnie za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra wprowadź 100 mikrogramów na mililitr fibronektyny do kanału i inkubatoruj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie dodaj 24,5 milimolarnego demanitol do DMEM z niską zawartością glukozy, aby podnieść ciśnienie osmotyczne.
Dodaj pięć milimolarnego D-glukozy do DMEM z wysoką zawartością glukozy, aby uzyskać końcową koncentrację 30 milimolarnego glukozy. Przygotuj normalne środowisko kulturowe z glukozą i środowisko kulturowe z wysoką zawartością glukozy uzupełnione o 20%FBS i 1% penicylinę i streptomycynę. Następnie rozgrzej PBS, trypsynę, normalne środowisko kulturowe z glukozą i środowisko kulturowe z wysoką zawartością glukozy w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Zbierz komórki śródbłonka żyły pępowinowej człowieka z miseczki kulturalnej w 90% zagęszczeniu. Odłącz komórki za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Po inkubacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund, zlicz zebrane komórki i ponownie zawieś je osobno w normalnym środowisku z glukozą i wysokim środowisku z glukozą w stężeniu 1 razy 10 do potęgi 6 komórek na mililitr.
Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra wstrzyknij 100 mikrolitem zawiesiny komórek do portu wlotowego mikrokanałowego chipu z normalnym środowiskiem z glukozą dla grupy kontrolnej i wysokim środowiskiem z glukozą dla grupy eksperymentalnej. Umieść mikrokanałowe chipsy w inkubatorze umiarkowanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Oblicz przepływ wymagany do osiągnięcia docelowego pulsującego naprężenia ścinającego za pomocą przedstawionego równania.
Podłącz źródło ciśnienia do kontrolera ciśnienia. Następnie połącz kontroler ciśnienia z kontrolerem zaworów podłączonym do komputera w celu zautomatyzowanego sterowania formami fal ciśnienia. Napełnij dwa zbiorniki po 100 mililitrów, jeden normalnym środowiskiem kulturowym z glukozą, a drugi wysokim środowiskiem kulturowym z glukozą.
Podłącz zbiorniki do odpowiednich kanałów kontrolera ciśnienia. Następnie połącz zbiorniki i dwuosiowy trójdrożny magnetyczny zawór za pomocą silikonowych węży. Ustaw docelowe fizjologiczne pulsujące naprężenie ścinające odpowiadające przepływowi około 200 mikrolitrów na minutę.
Zaprogramuj programowalną pompę powietrza, aby wygenerować funkcję fali sinusoidalnej, aby utrzymać pulsujące naprężenie ścinające. Następnie zaprogramuj kontroler zaworów, aby przełączać kanały co pięć minut, aby wygenerować kwadratową falę oscylacja glukozy podczas dynamicznej stymulacji. Podłącz dwuosiowy trójdrożny magnetyczny zawór i mikrokanałowy chip za pomocą silikonowych węży.
Następnie uruchom programowalny system pomp, aby napełnić węże. Następnie, używając 9
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje programowalną platformę mikroprzepływową zaprojektowaną do modelowania dysfunkcji śródbłonka w warunkach fizjologicznie istotnych, naśladujących cukrzycowe powikłania naczyniowe. Poprzez zintegrowanie zsynchronizowanej oscylacyjnej hiperglikemii i fizjologicznego pulsującego naprężenia ścinającego (PSS), system umożliwia precyzyjne badanie połączonych czynników metabolicznych i mechanicznych wpływających na komórki śródbłonka. Podejście to pozwala na szczegółowe badania mechanistyczne oraz przesiewowe testy leków istotne w kontekście cukrzycowej choroby naczyniowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Badania nad cukrzycą
- Mikrofluidyka
- Mechanobiologia komórkowa
Wprowadzenie
- Dysfunkcja śródbłonka jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do powikłań naczyniowych w cukrzycy.
- Oscylacyjna glukoza (OG) oraz pulsacyjne naprężenie ścinające (PSS) są istotnymi czynnikami w naczyniach krwionośnych w przebiegu cukrzycy.
- Tradycyjne modele często wykorzystują statycznie wysokie stężenie glukozy lub uproszczony przepływ laminarny, co sprawia, że brakuje im istotności fizjologicznej.
- Zintegrowane sprzężenie czasoprzestrzenne bodźców metabolicznych i mechanicznych jest krytyczne dla dokładnego modelowania.
Cel badania
- Opracowanie platformy mikroprzepływowej synchronizującej OG i PSS na potrzeby badań nad komórkami śródbłonka.
- Modelowanie dysfunkcji śródbłonka w sprzężonych warunkach metabolicznych i mechanicznych.
- Umożliwienie badań mechanistycznych oraz przesiewania leków w kontekście cukrzycowej choroby naczyniowej.
Zastosowane metody
- Programowalna platforma mikroprzepływowa z chipem z polidimetylosiloksanu (PDMS).
- System sterowania ciśnieniowego do niezależnej modulacji przepływu i profili glukozy.
- Walidacja wierności hemodynamicznej przy użyciu mikro-PIV (mikro-Particle Image Velocimetry).
- Ilościowa ocena wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) oraz żywotności komórek.
Główne wyniki
- Fizjologiczny PSS łagodzi uszkodzenia oksydacyjne indukowane oscylacyjnym poziomem glukozy.
- Obserwowano obniżone wewnątrzkomórkowe poziomy ROS przy jednoczesnej stymulacji OG i PSS.
- Poprawiona żywotność komórek w fizjologicznie istotnych warunkach sprzężonych.
- Parametry systemu, takie jak naprężenie ścinające, oscylacje glukozy i geometria kanału, są regulowalne.
Wnioski
- Platforma skutecznie modeluje zintegrowane efekty stresu metabolicznego i mechanicznego w komórkach śródbłonka.
- Fizjologiczne PSS może łagodzić uszkodzenia oksydacyjne wywołane oscylacyjną hiperglikemią.
- Metoda ta stanowi wszechstronne narzędzie do badań mechanistycznych i przesiewowych w kontekście terapeutycznego leczenia naczyniowych powikłań cukrzycy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Modelowanie dysfunkcji śródbłonka w warunkach fizjologicznie istotnych, sprzężonych stresorów metabolicznych i mechanicznych, ma kluczowe znaczenie dla wiarygodności prognostycznej w badaniach nad naczyniowymi powikłaniami cukrzycy. Ten system mikroprzepływowy umożliwia precyzyjną analizę ścieżek mechanobiologicznych poprzez integrację oscylacyjnej hiperglikemii i pulsacyjnego naprężenia ścinającego, bezpośrednio rozwiązując kluczowy problem translacyjny w walidacji celów naczyniowych. Ilościowe wyniki oraz regulowane parametry platformy wspierają podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka na etapie wczesnego odkrywania i w fazie badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie istotnej dla choroby dysfunkcji śródbłonka w zsynchronizowanych warunkach metabolicznych i hemodynamicznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościową ocenę stresu oksydacyjnego i żywotności komórek.
- Ułatwia badanie opartych na hipotezach szlaków naczyniowych uwikłanych w powikłania cukrzycowe.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany, programowalny system do generowania powtarzalnych, fizjologicznie istotnych profili przepływu i poziomu glukozy.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników (ROS, żywotność) odpowiednich do przesiewania związków i standaryzacji testów.
- Zapewnia skalowalność i możliwość ponownego wykorzystania platformy dzięki możliwości regulacji naprężenia ścinającego, oscylacji glukozy oraz geometrii kanałów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modelowania in vitro do stresorów naczyniowych istotnych dla danej choroby w celu poprawy ciągłości translacyjnej.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów oraz badania mechanistyczne istotne dla progresji naczyniowych powikłań cukrzycy.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach badań poprzez dostarczenie predykcyjnych, ilościowych punktów końcowych do oceny przedklinicznej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten system mikrofluidyczny łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz opracowywanie analiz w ramach jednej, regulowanej platformy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania mechanistyczne nad dysfunkcją śródbłonka w warunkach połączonego stresu metabolicznego i mechanicznego.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i optymalizacji testów.
- Analityka: Umożliwia bezpośredni pomiar ROS i żywotności w celu przeprowadzenia analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników in vitro do fenotypów naczyniowych istotnych w przebiegu chorób.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje elastyczny, programowalny system, który można dostosować do różnorodnych potrzeb w zakresie badań naczyniowych i przesiewów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje złożone warunki przepływu i metabolizmu w celu zapewnienia odtwarzalności i skalowalności eksperymentów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych, ilościowych punktów końcowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów naczyniowych i kandydatów terapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu mikrofluidyki, biologii naczyniowej oraz ilościowych analiz komórkowych.
- Konieczny jest dostęp do programowalnych systemów kontroli przepływu oraz systemu Micro-PIV w celu walidacji hemodynamicznej.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów eksperymentalnych i przepływów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych geometrii kanałów oraz profili przepływu/glukozy w zależności od stawianych pytań badawczych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność posiadania specjalistycznej aparatury oraz odpowiedniego przeszkolenia technicznego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:29
Microfluidic Chip Fabrication for Studying Pulsatile Shear Stress
2:29
Endothelial Cell Preparation for Microfluidic Chamber Seeding
5:01
Dynamic Microfluidic Flow Setup
7:01
Assessment of Cell Viability and Intracellular ROS Using Fluorescent Probes
8:42
Quantitative Analysis and Evaluation of Oxidative Stress and Cellular Response
11:24
Results
13:23
Conclusion
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
