System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii
12 maja 2026
Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.
Niniejsze badanie bada, jak zsynchronizowane oscylatorowe hiperglikemia i pulsujące naprężenie ścinające razem powodują dysfunkcję śródbłonka w cukrzycowej chorobie naczyń. Istniejące modele wykorzystują wysoki początkowy poziom glukozy lub stały laminarny przepływ. Badamy, jak pulsujące naprężenie ścinające przeciwdziała oscylatorowemu uszkodzeniu glukozy.
Na początek użyj oprogramowania do wspomaganego komputerowo projektowania, aby zaprojektować strukturę mikroczipu. Wykonaj master formy SU-8 poprzez komercyjną firmę. W czystym kubku mieszania wymieszaj środek utwardzający i prepolimer polidimetyloksylan w stosunku 10:1 wagowym i energicznie mieszaj ręcznie przez pięć minut.
Następnie umieść pojemnik w komorze próżniowej przy ciśnieniu 0,08 megapaskala przez co najmniej 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione podczas mieszania. Wlej polidimetyloksylan na wafer umieszczony w szklanej miseczce Petriego. Odgazuj polidimetyloksylan wlewaną na wafer w egzaleratorze przez kolejne 15 minut, aby usunąć wszelkie bąbelki powstałe podczas odlewania.
Umieść miseczkę Petriego zawierającą formę i polimer w piekarniku ustawionym na 80 stopni Celsjusza na dwie godziny. Za pomocą skalpela ostrożnie zdejmij stwardniały polimer z master formy. Za pomocą narzędzia do wybijania rdzeni stwórz porty wlotowe i wylotowe na wyznaczonych końcach kanałów na polimerze.
Wyczyść szklany pokrywający szlifowane szkło i wzorowaną powierzchnię polimeru za pomocą taśmy klejącej. Następnie traktuj zarówno polimer, jak i szklany pokrywający szlifowane szkło czyszczarką plazmową z mocą 65 watów w zwykłym powietrzu przez 60 sekund. Natychmiast wyrównaj powierzchnię kanału polimeru z traktowaną stroną szklanego pokrywającego szlifowane szkło.
Następnie delikatnie dociśnij, aby stworzyć trwale zamknięty mikrokanałowy chip. Umieść związany mikrokanałowy chip w borowanej szklanej butelce wypełnionej zjonizowaną wodą. Wysterylizuj przez autoklawowanie w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 funtów na cal kwadratowy przez 20 minut.
Umieść wysterylizowany chip w 60-milimetrowej miseczce kulturalnej wypełnionej równomolowym mieszaniem PBS i DMEM z niską zawartością glukozy. Następnie za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra wprowadź 100 mikrogramów na mililitr fibronektyny do kanału i inkubatoruj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie dodaj 24,5 milimolarnego demanitol do DMEM z niską zawartością glukozy, aby podnieść ciśnienie osmotyczne.
Dodaj pięć milimolarnego D-glukozy do DMEM z wysoką zawartością glukozy, aby uzyskać końcową koncentrację 30 milimolarnego glukozy. Przygotuj normalne środowisko kulturowe z glukozą i środowisko kulturowe z wysoką zawartością glukozy uzupełnione o 20%FBS i 1% penicylinę i streptomycynę. Następnie rozgrzej PBS, trypsynę, normalne środowisko kulturowe z glukozą i środowisko kulturowe z wysoką zawartością glukozy w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Zbierz komórki śródbłonka żyły pępowinowej człowieka z miseczki kulturalnej w 90% zagęszczeniu. Odłącz komórki za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Po inkubacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund, zlicz zebrane komórki i ponownie zawieś je osobno w normalnym środowisku z glukozą i wysokim środowisku z glukozą w stężeniu 1 razy 10 do potęgi 6 komórek na mililitr.
Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra wstrzyknij 100 mikrolitem zawiesiny komórek do portu wlotowego mikrokanałowego chipu z normalnym środowiskiem z glukozą dla grupy kontrolnej i wysokim środowiskiem z glukozą dla grupy eksperymentalnej. Umieść mikrokanałowe chipsy w inkubatorze umiarkowanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Oblicz przepływ wymagany do osiągnięcia docelowego pulsującego naprężenia ścinającego za pomocą przedstawionego równania.
Podłącz źródło ciśnienia do kontrolera ciśnienia. Następnie połącz kontroler ciśnienia z kontrolerem zaworów podłączonym do komputera w celu zautomatyzowanego sterowania formami fal ciśnienia. Napełnij dwa zbiorniki po 100 mililitrów, jeden normalnym środowiskiem kulturowym z glukozą, a drugi wysokim środowiskiem kulturowym z glukozą.
Podłącz zbiorniki do odpowiednich kanałów kontrolera ciśnienia. Następnie połącz zbiorniki i dwuosiowy trójdrożny magnetyczny zawór za pomocą silikonowych węży. Ustaw docelowe fizjologiczne pulsujące naprężenie ścinające odpowiadające przepływowi około 200 mikrolitrów na minutę.
Zaprogramuj programowalną pompę powietrza, aby wygenerować funkcję fali sinusoidalnej, aby utrzymać pulsujące naprężenie ścinające. Następnie zaprogramuj kontroler zaworów, aby przełączać kanały co pięć minut, aby wygenerować kwadratową falę oscylacja glukozy podczas dynamicznej stymulacji. Podłącz dwuosiowy trójdrożny magnetyczny zawór i mikrokanałowy chip za pomocą silikonowych węży.
Następnie uruchom programowalny system pomp, aby napełnić węże. Następnie, używając 9
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This protocol describes a programmable microfluidic platform designed to model endothelial dysfunction under physiologically relevant conditions that mimic diabetic vascular complications. By integrating synchronized oscillatory hyperglycemia and physiological pulsatile shear stress (PSS), the system enables precise investigation of the combined metabolic and mechanical factors affecting endothelial cells. The approach allows for detailed mechanistic studies and drug screening relevant to diabetic vascular disease.
Key Study Components
Area of Science
- Vascular biology
- Diabetes research
- Microfluidics
- Cellular mechanobiology
Background
- Endothelial dysfunction is a key contributor to diabetic vascular complications.
- Oscillatory glucose (OG) and pulsatile shear stress (PSS) are important factors in diabetic vasculature.
- Traditional models often use static high-glucose or simplified laminar flow, lacking physiological relevance.
- Integrated spatiotemporal coupling of metabolic and mechanical stimuli is critical for accurate modeling.
Purpose of Study
- To develop a microfluidic platform that synchronizes OG and PSS for endothelial cell studies.
- To model endothelial dysfunction under coupled metabolic and mechanical conditions.
- To enable mechanistic studies and drug screening for diabetic vascular disease.
Methods Used
- Programmable microfluidic platform with polydimethylsiloxane (PDMS) chip.
- Pressure-driven control system for independent modulation of flow and glucose profiles.
- Validation of hemodynamic fidelity using Micro-Particle Image Velocimetry (Micro-PIV).
- Quantitative assessment of intracellular reactive oxygen species (ROS) and cell viability.
Main Results
- Physiological PSS attenuates oxidative injury induced by oscillatory glucose.
- Reduced intracellular ROS levels observed under combined OG and PSS stimulation.
- Improved cell viability under physiologically relevant coupled conditions.
- System parameters such as shear stress, glucose oscillation, and channel geometry are adjustable.
Conclusions
- The platform effectively models the integrated effects of metabolic and mechanical stress on endothelial cells.
- Physiological PSS can mitigate oxidative damage from oscillatory hyperglycemia.
- This method is a versatile tool for mechanistic studies and therapeutic screening in diabetic vascular disease.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Modeling endothelial dysfunction under physiologically relevant, coupled metabolic and mechanical stressors is critical for predictive confidence in diabetic vascular disease research. This microfluidic system enables precise interrogation of mechanobiological pathways by integrating oscillatory hyperglycemia and pulsatile shear stress, directly addressing a key translational bottleneck in vascular target validation. The platform's quantitative outputs and tunable parameters support risk-adjusted decision-making across early discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by modeling disease-relevant endothelial dysfunction under synchronized metabolic and hemodynamic conditions.
- Supports functional target validation through quantitative assessment of oxidative stress and cell viability.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of vascular pathways implicated in diabetic complications.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, programmable system for generating reproducible, physiologically relevant flow and glucose profiles.
- Delivers quantitative readouts (ROS, viability) suitable for compound screening and assay standardization.
- Enables scalability and platform reuse by allowing adjustment of shear stress, glucose oscillation, and channel geometry.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro modeling with disease-relevant vascular stressors for improved translational continuity.
- Supports biomarker discovery and mechanistic studies relevant to diabetic vascular disease progression.
- Reduces late-stage biological risk by providing predictive, quantitative endpoints for preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic system bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, target validation, and assay development within a single, tunable platform.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of endothelial dysfunction under coupled metabolic and mechanical stress.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay optimization.
- Analytics: Enables direct measurement of ROS and viability for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant vascular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, programmable system adaptable to diverse vascular research and screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes complex flow and metabolic conditions for reproducible, scalable experimentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, vascular biology, and quantitative cell-based assays.
- Needs access to programmable flow control systems and Micro-PIV for hemodynamic validation.
- Demands cross-team standardization of experimental parameters and data analysis workflows.
- Adaptable to various channel geometries and flow/glucose profiles for different research questions.
- Practical limitations include the need for specialized instrumentation and technical training.