Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej
July 3rd, 2026
Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Koncentrujemy się na charakteryzowaniu mechanizmów inwazji E.coli na komórki nabłonka jelitowego oraz identyfikacji czynników bakteryjnych, które przyczyniają się do tego procesu. Izolaty odporne na gentamycynę ograniczają tradycyjne testy inwazji. Ten protokół oparty na amikacynie pozwala na dokładne określenie liczby bakterii wewnątrzkomórkowych.
Na początek, zbierz wszystkie reagenty i media potrzebne do testu inwazji. Następnie, odzyskaj zamrożony zasobnik glicerolowy szczepu Escharicia colli, czyli AIEC, z zamrażarki 80 stopni Celsjusza. Używając sterylnego patyczka drewnianego lub końcówki pipety, delikatnie zetrzyj bakterie ze szypułki i rozmazuj na płytce Luria-Bertani, czyli LB, aby uzyskać pojedyncze kolonie.
Inkubator płytki w 37 stopniach Celsjusza przez noc. Następnego dnia, używając sterylnego patyczka drewnianego lub końcówki pipety, wybierz pojedynczą kolonię z płytki. Zakaż kolonię w 3 mililitrach bulionu LB i inkubator kultury w 37 stopniach Celsjusza przy 200 obrotach na minutę przez noc.
Następnie wykonaj rozcieńczenie 1 do 10 kultury nocnej w 1 mililitru bulionu LB. Zmierzyć gęstość optyczną na 600 nanometrach rozcieńczonej kultury za pomocą spektrofotometru. Przenieś 100 mikrolitrów kultury nocnej do mikrocentryfugowej probówki 1,5 mililitra i wyśrodkuj przez 10 minut przy 6 000 G i 4 stopniach Celsjusza.
Odstaw nadstan nadstanu ostrożnie, nie zakłócając osadu komórkowego i ponownie zawieś osad w 1 mililitru serum oraz media bez antybiotyków i antymykotyków. Oblicz wymaganą objętość zawiesiny bakteryjnej, aby osiągnąć wielokrotność zakażenia lub MOI 10, używając podanego wzoru. Aby przygotować media infekcyjne, przenieś obliczoną objętość zawiesiny bakteryjnej do sterylnej mikrocentryfugowej probówki 1,5 mililitra i uzupełnij objętość do 1 mililitra serum i media bez antybiotyków i antymykotyków.
Delikatnie wymieszaj pipetą poprzez kilkukrotne podnoszenie i opuszczanie. Przygotuj płytę 96-dołkową, aby określić liczbę formujących kolonie jednostek na mililitr rozcieńczonej kultury bakterii nocnej, wykonując dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe w sterylnym 1X PBS. Przenieś 200 mikrolitrów rozcieńczonej kultury nocnej do pierwszego dołka płytki.
Pipetą przenieś 20 mikrolitrów kultury do następnego rzędu zawierającego 180 mikrolitrów 1X PBS. Mieszaj pipetą poprzez dziesięciokrotne podnoszenie i opuszczanie i powtórz proces rozcieńczania, aż osiągniesz 10 do potęgi 6, używając za każdym razem świeżej końcówki pipety. Teraz rozłóż po 10 mikrolitrów kropli rozcieńczeń w trzech powtórzeniach z 10 do potęgi 2 do 10 do potęgi 6 na płytkach LB auger.
Pozwól, aby kropki wchłonęły się w augerze w pobliżu płomienia. Inkubator płytki przez noc w 27 do 30 stopniach Celsjusza, aby zapobiec przerostowi kolonii i uzyskać jasne pojedyncze kolonie. Wyjmij z inkubatora zdrowe, jednolite monowarstwy komórek nabłonkowych Caco-2 hodowanych na pokrytej kolagenową płytce kulturalnej 24-dołkowej i odstaw pełne media z każdego dołka.
Pipetą przenieś jeden mililitr serum oraz media bez antybiotyków i antymykotyków do każdego dołka. Odstaw media, aby usunąć ślady mediów i powtórz mycie jeszcze raz, łącznie dwa razy. Teraz dodaj jeden mililitr wcześniej przygotowanego media infekcyjnego zawierającego AIEC do każdego dołka płytki 24-dołkowej zawierającej komórki Caco-2.
Wyśrodkuj płytkę 24-dołkową przy 500G przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zsynchronizować kontakt bakteryjny z monowarstwą nabłonkową i inkubator płytki w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny, aby umożliwić inwazję bakteryjną. Przygotuj media zawierające antybiotyki, dodając 240 mikrogramów na mililitr amikacyny do wstępnie podgrzanego serum i media bez antybiotyków i antymykotyków. Po okresie infekcji, odstaw media z monowarstwy komórek Caco-2 i przepłucz każdy dołek 1 mililitr serum i media bez antybiotyków i antymykotyków.
Odstaw media i powtórz mycie jeszcze raz, łącznie dwa razy. Następnie pipetą przenieś jeden mililitr media zawierającego 240 mikrogramów na mililitr amikacyny do każdego dołka. Równolegle, lecz inny zestaw komórek 100 mikrogramami na mililitr gentamycyny w celu porównania i inkubator komórek w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 1 godzinę, aby wyeliminować bakterie pozakomórkowe.
Po inkubacji, odstaw media z każdego dołka. Dodaj 1 mililitr PBS, aby zmyć bakterie przywierające. Odstaw PBS i powtórz mycie jeszcze raz, łącznie dwa razy.
Teraz dodaj 200 mikrolitrów 1% Triton X100 rozcieńczonego w PBS do każdego dołka i inkubator na orbitowym miksowniku z 90 obrotów na minutę przez 10 minut, aby lizysować komórki nabłonkowe. Pipetą podnieś i opuszczaj około 30 razy na dołek, aby oddzielić kom
Overview
This article presents an alternative amikacin-based protection assay for quantifying and visualizing epithelial cell invasion by adherent-invasive Escherichia coli (AIEC) and other multidrug-resistant pathogens. The method addresses limitations of the traditional gentamicin protection assay, particularly in the context of antibiotic-resistant isolates from inflammatory bowel disease (IBD) patients.
Key Study Components
Area of Science
- Microbiology
- Cellular infection assays
- Pathogen diagnostics
Background
- Epithelial cell invasion is a hallmark of several enteric pathogens, including Salmonella, Shigella, and Vibrio.
- AIEC is an emerging pathogen implicated in IBD pathogenesis.
- AIEC strains lack classic virulence factors, complicating genetic identification.
- Phenotypic classification relies on cell invasion assays, traditionally using gentamicin.
Purpose of Study
- To develop a reliable assay for quantifying AIEC invasion in the context of rising antibiotic resistance.
- To provide a diagnostic tool for screening IBD patients for AIEC.
- To enable assessment of cell invasion by multidrug-resistant pathogens.
Methods Used
- Amikacin-based protection assay to kill extracellular bacteria while sparing intracellular bacteria.
- Quantification of invasion using colony-forming units (CFU) recovered post-infection.
- Calculation of percent invasion score for comparative analysis.
- Immunostaining and confocal microscopy for qualitative visualization of invaded epithelial cells.
Main Results
- The amikacin-based assay effectively quantifies and visualizes AIEC invasion of epithelial cells.
- Amikacin is effective against strains resistant to other aminoglycosides and remains extracellular to host cells.
- The assay provides both quantitative and qualitative data on bacterial invasiveness.
- It is suitable for use with multidrug-resistant isolates from IBD patients.
Conclusions
- The amikacin-based protection assay is a robust alternative to gentamicin-based methods for assessing epithelial cell invasion.
- This method enhances diagnostic capabilities for AIEC and other resistant pathogens in clinical and research settings.
- It serves as a proxy for evaluating pathogen virulence and pathogenicity.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantifying epithelial cell invasion by multidrug-resistant Escherichia coli is critical for target validation and mechanistic de-risking in infectious disease research. The amikacin protection assay enables reliable phenotypic classification and comparative analysis of invasive potential, especially in the context of antibiotic resistance. This capability supports translational continuity from discovery through preclinical pathogen characterization and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of bacterial invasion phenotypes in disease-relevant epithelial models.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing intracellular from extracellular pathogen populations.
- Facilitates comparative assessment of strain invasiveness for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative assay for evaluating cell invasion by antibiotic-resistant isolates.
- Delivers reproducible percent invasion scores using CFU quantification post-infection.
- Supports qualitative visualization of invaded cells via immunostaining and confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking invasion phenotype to pathogenicity in IBD and other diseases.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate strains or interventions based on invasion metrics.
- Offers continuity from in vitro discovery to preclinical infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The amikacin protection assay fits within the early discovery to preclinical continuum, supporting both hypothesis testing and downstream screening of multidrug-resistant pathogens.
- Discovery Biology: Provides robust quantification of invasion as a proxy for virulence and mechanistic insight.
- Screening: Standardizes evaluation of strain invasiveness for high-throughput or comparative workflows.
- Analytics: Generates quantitative percent invasion scores and qualitative imaging outputs for cross-condition analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro invasion data to preclinical and clinical pathogen characterization.
- Enterprise Reuse: Adaptable for diverse enteric pathogens and multidrug-resistant isolates across research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in invasion phenotypes and reduces ambiguity in pathogen classification.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and scalability for both research and diagnostic applications.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for pathogen-focused portfolios and supports capital-efficient screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains or interventions based on validated invasion metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture infection models and quantitative microbiology.
- Needs access to amikacin, CFU plating infrastructure, and confocal microscopy for qualitative analysis.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and readouts for reproducibility.
- Adaptable to various epithelial cell lines and multidrug-resistant pathogen isolates.
- Assay reliability may depend on antibiotic susceptibility profiles of clinical isolates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:29
Preparation of Adherent-Invasive E. coli (AIEC) and Infection Media
2:43
Plating Input AIEC Inoculum for Pre-Infection Quantification
3:55
Infection of Caco-2 Epithelial Cell Monolayers with AIEC
5:03
Treatment with Amikacin and Recovery of Intracellular Bacteria
7:38
Results
8:49
Conclusion
