Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej
3 lipca 2026
Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Koncentrujemy się na charakteryzowaniu mechanizmów inwazji E.coli na komórki nabłonka jelitowego oraz identyfikacji czynników bakteryjnych, które przyczyniają się do tego procesu. Izolaty odporne na gentamycynę ograniczają tradycyjne testy inwazji. Ten protokół oparty na amikacynie pozwala na dokładne określenie liczby bakterii wewnątrzkomórkowych.
Na początek, zbierz wszystkie reagenty i media potrzebne do testu inwazji. Następnie, odzyskaj zamrożony zasobnik glicerolowy szczepu Escharicia colli, czyli AIEC, z zamrażarki 80 stopni Celsjusza. Używając sterylnego patyczka drewnianego lub końcówki pipety, delikatnie zetrzyj bakterie ze szypułki i rozmazuj na płytce Luria-Bertani, czyli LB, aby uzyskać pojedyncze kolonie.
Inkubator płytki w 37 stopniach Celsjusza przez noc. Następnego dnia, używając sterylnego patyczka drewnianego lub końcówki pipety, wybierz pojedynczą kolonię z płytki. Zakaż kolonię w 3 mililitrach bulionu LB i inkubator kultury w 37 stopniach Celsjusza przy 200 obrotach na minutę przez noc.
Następnie wykonaj rozcieńczenie 1 do 10 kultury nocnej w 1 mililitru bulionu LB. Zmierzyć gęstość optyczną na 600 nanometrach rozcieńczonej kultury za pomocą spektrofotometru. Przenieś 100 mikrolitrów kultury nocnej do mikrocentryfugowej probówki 1,5 mililitra i wyśrodkuj przez 10 minut przy 6 000 G i 4 stopniach Celsjusza.
Odstaw nadstan nadstanu ostrożnie, nie zakłócając osadu komórkowego i ponownie zawieś osad w 1 mililitru serum oraz media bez antybiotyków i antymykotyków. Oblicz wymaganą objętość zawiesiny bakteryjnej, aby osiągnąć wielokrotność zakażenia lub MOI 10, używając podanego wzoru. Aby przygotować media infekcyjne, przenieś obliczoną objętość zawiesiny bakteryjnej do sterylnej mikrocentryfugowej probówki 1,5 mililitra i uzupełnij objętość do 1 mililitra serum i media bez antybiotyków i antymykotyków.
Delikatnie wymieszaj pipetą poprzez kilkukrotne podnoszenie i opuszczanie. Przygotuj płytę 96-dołkową, aby określić liczbę formujących kolonie jednostek na mililitr rozcieńczonej kultury bakterii nocnej, wykonując dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe w sterylnym 1X PBS. Przenieś 200 mikrolitrów rozcieńczonej kultury nocnej do pierwszego dołka płytki.
Pipetą przenieś 20 mikrolitrów kultury do następnego rzędu zawierającego 180 mikrolitrów 1X PBS. Mieszaj pipetą poprzez dziesięciokrotne podnoszenie i opuszczanie i powtórz proces rozcieńczania, aż osiągniesz 10 do potęgi 6, używając za każdym razem świeżej końcówki pipety. Teraz rozłóż po 10 mikrolitrów kropli rozcieńczeń w trzech powtórzeniach z 10 do potęgi 2 do 10 do potęgi 6 na płytkach LB auger.
Pozwól, aby kropki wchłonęły się w augerze w pobliżu płomienia. Inkubator płytki przez noc w 27 do 30 stopniach Celsjusza, aby zapobiec przerostowi kolonii i uzyskać jasne pojedyncze kolonie. Wyjmij z inkubatora zdrowe, jednolite monowarstwy komórek nabłonkowych Caco-2 hodowanych na pokrytej kolagenową płytce kulturalnej 24-dołkowej i odstaw pełne media z każdego dołka.
Pipetą przenieś jeden mililitr serum oraz media bez antybiotyków i antymykotyków do każdego dołka. Odstaw media, aby usunąć ślady mediów i powtórz mycie jeszcze raz, łącznie dwa razy. Teraz dodaj jeden mililitr wcześniej przygotowanego media infekcyjnego zawierającego AIEC do każdego dołka płytki 24-dołkowej zawierającej komórki Caco-2.
Wyśrodkuj płytkę 24-dołkową przy 500G przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zsynchronizować kontakt bakteryjny z monowarstwą nabłonkową i inkubator płytki w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny, aby umożliwić inwazję bakteryjną. Przygotuj media zawierające antybiotyki, dodając 240 mikrogramów na mililitr amikacyny do wstępnie podgrzanego serum i media bez antybiotyków i antymykotyków. Po okresie infekcji, odstaw media z monowarstwy komórek Caco-2 i przepłucz każdy dołek 1 mililitr serum i media bez antybiotyków i antymykotyków.
Odstaw media i powtórz mycie jeszcze raz, łącznie dwa razy. Następnie pipetą przenieś jeden mililitr media zawierającego 240 mikrogramów na mililitr amikacyny do każdego dołka. Równolegle, lecz inny zestaw komórek 100 mikrogramami na mililitr gentamycyny w celu porównania i inkubator komórek w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 1 godzinę, aby wyeliminować bakterie pozakomórkowe.
Po inkubacji, odstaw media z każdego dołka. Dodaj 1 mililitr PBS, aby zmyć bakterie przywierające. Odstaw PBS i powtórz mycie jeszcze raz, łącznie dwa razy.
Teraz dodaj 200 mikrolitrów 1% Triton X100 rozcieńczonego w PBS do każdego dołka i inkubator na orbitowym miksowniku z 90 obrotów na minutę przez 10 minut, aby lizysować komórki nabłonkowe. Pipetą podnieś i opuszczaj około 30 razy na dołek, aby oddzielić kom
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia alternatywną metodę testu ochronnego z użyciem amikacyny do ilościowego oznaczenia i wizualizacji inwazji komórek nabłonkowych przez adhezyjnie inwazyjne Escherichia coli (AIEC) oraz inne patogeny wielolekooporne. Metoda ta rozwiązuje ograniczenia tradycyjnego testu ochronnego z użyciem gentamycyny, szczególnie w kontekście izolatów opornych na antybiotyki pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Testy infekcji komórkowych
- Diagnostyka patogenów
Wstęp
- Inwazja komórek nabłonkowych jest cechą charakterystyczną dla wielu patogenów jelitowych, w tym Salmonella, Shigella oraz Vibrio.
- AIEC to wyłaniający się patogen zaangażowany w patogenezę IBD.
- Szczepy AIEC nie posiadają klasycznych czynników wirulencji, co utrudnia identyfikację genetyczną.
- Klasyfikacja fenotypowa opiera się na testach inwazji komórkowej, w których tradycyjnie stosuje się gentamycynę.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego testu do ilościowej oceny inwazji AIEC w kontekście rosnącej oporności na antybiotyki.
- Dostarczenie narzędzia diagnostycznego do przesiewowego wykrywania AIEC u pacjentów z IBD.
- Umożliwienie oceny inwazji komórkowej przez patogeny wielolekooporne.
Zastosowane metody
- Test ochrony oparty na amikacynie w celu eliminacji bakterii pozakomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu bakterii wewnątrzkomórkowych.
- Ilościowe oznaczenie inwazji z wykorzystaniem jednostek tworzących kolonie (CFU) odzyskanych po infekcji.
- Obliczenie procentowego wskaźnika inwazji do analizy porównawczej.
- Immunobarwienie i mikroskopia konfokalna w celu jakościowej wizualizacji zainfekowanych komórek nabłonkowych.
Główne wyniki
- Test oparty na amikacyną skutecznie ilościowo określa i wizualizuje inwazję AIEC do komórek nabłonkowych.
- Amikacyna jest skuteczna przeciwko szczepom opornym na inne aminoglikozydy i pozostaje poza komórkami gospodarza.
- Test dostarcza zarówno danych ilościowych, jak i jakościowych na temat inwazyjności bakterii.
- Nadaje się on do stosowania w przypadku izolatów wielolekoopornych pochodzących od pacjentów z IBD.
Wnioski
- Test ochrony oparty na amikacynie stanowi solidną alternatywę dla metod opartych na gentamycynie w ocenie inwazji komórek nabłonkowych.
- Metoda ta zwiększa możliwości diagnostyczne w przypadku AIEC oraz innych opornych patogenów w warunkach klinicznych i badawczych.
- Służy ona jako wskaźnik do oceny wirulencji i patogenności patogenów.
Często zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Ilościowe określenie inwazji komórek nabłonkowych przez wielolekooporne Escherichia coli jest kluczowe dla walidacji celu i ograniczania ryzyka mechanistycznego w badaniach nad chorobami zakaźnymi. Test ochrony amikacyną umożliwia niezawodną klasyfikację fenotypową oraz analizę porównawczą potencjału inwazyjnego, szczególnie w kontekście oporności na antybiotyki. Możliwość ta wspiera ciągłość translacyjną – od etapu odkryć, przez przedkliniczną charakterystykę patogenów, aż po selekcję projektów w portfelu badawczym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację fenotypów inwazyjności bakteryjnej w modelach nabłonkowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez rozróżnienie wewnątrzkomórkowych od zewnątrzkomórkowych populacji patogenów.
- Ułatwia porównawczą ocenę inwazyjności szczepów w celu priorytetyzacji celów.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowany, ilościowy test do oceny inwazji komórkowej przez izolaty oporne na antybiotyki.
- Umożliwia uzyskanie powtarzalnych wyników procentowej inwazji dzięki ilościowemu oznaczeniu CFU po infekcji.
- Umożliwia jakościową wizualizację zainfekowanych komórek za pomocą immunobarwienia i mikroskopii konfokalnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami dotyczącymi biomarkerów translacyjnych, łącząc fenotyp inwazyjności z patogennością w IBD i innych chorobach.
- Umożliwia dostosowanie postępu prac nad szczepami kandydackimi lub interwencjami do poziomu ryzyka na podstawie wskaźników inwazyjności.
- Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć in vitro do przedklinicznych modeli infekcji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test ochrony amikacyną wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania leków do badań przedklinicznych, wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i późniejszy screening patogenów wielolekoopornych.
- Biologia odkrywcza: zapewnia rzetelną kwantyfikację inwazyjności jako wskaźnika wirulencji oraz pozwala na zrozumienie mechanizmów procesów.
- Przesiewanie: standaryzuje ocenę inwazyjności szczepów w wysokoprzepustowych lub porównawczych schematach badawczych.
- Analityka: generuje ilościowe wyniki procentowej inwazyjności oraz jakościowe dane obrazowe do analizy porównawczej różnych warunków.
- Badania translacyjne: wiążą dane o inwazyjności in vitro z przedkliniczną i kliniczną charakterystyką patogenów.
- Zastosowanie w instytucjach: metoda możliwa do adaptacji dla różnorodnych patogenów jelitowych i izolatów wielolekoopornych w ramach programów badawczych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w odniesieniu do fenotypów inwazyjnych i zmniejsza niejednoznaczność w klasyfikacji patogenów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność testów zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i diagnostycznych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) dla portfeli skoncentrowanych na patogenach i wspiera efektywność kapitałową przesiewu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację szczepów lub interwencji z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane wskaźniki inwazyjności.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie modeli infekcji kultur komórkowych oraz mikrobiologii ilościowej.
- Niezbędny jest dostęp do amikacyny, infrastruktury do wysiewu CFU oraz mikroskopii konfokalnej do analizy jakościowej.
- Wymagana jest standaryzacja warunków testowych i odczytów pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych linii komórek nabłonkowych oraz izolatów patogenów wielolekoopornych.
- Niezawodność testu może zależeć od profili wrażliwości na antybiotyki izolatów klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmaceutyki
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:29
Preparation of Adherent-Invasive E. coli (AIEC) and Infection Media
2:43
Plating Input AIEC Inoculum for Pre-Infection Quantification
3:55
Infection of Caco-2 Epithelial Cell Monolayers with AIEC
5:03
Treatment with Amikacin and Recovery of Intracellular Bacteria
7:38
Results
8:49
Conclusion
