Name: Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T14:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj zintegrowany protokół oceny naczyń chłonnych opon mózgowo-rdzeniowych u myszy, obejmujący wstrzyknięcie do cisterny magny, wizualizację węzłów chłonnych i barwienie całego montażu. Metoda umożliwia kompleksową analizę funkcjonalną i morfologiczną w ciągu około trzech godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było wspierane przez fundusze z Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2023YFC2306500), Narodowej Fundacji Nauki Przyrodniczej Chin (82502108) oraz Chińskiej Fundacji Naukowej dla Doktorantów (2024M760542).

Opisane w tym protokoła procedury dotyczące myszy były wykonywane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu w Szanghaju (Numer zatwierdzenia ECSHU 2023-099). 
1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i buforów
UWAGA: Wykonuj czynności w kapturze chemicznym i stosuj rękawiczki, aby zminimalizować potencjalne ryzyko podczas pracy z PFA, substancją umiarkowanie toksyczną i rakotwórczą. Wszystkie operacje z użyciem alkoholu izoamylowego muszą być przeprowadzane w kapturze chemicznym, z dala od źródeł zapłonu, stosując rękawiczki i maskę, aby zmniejszyć ryzyko narażenia.
<ol>
	<li>Przygotuj narzędzia chirurgiczne, takie jak jedna para prostej nożyczki, dwie pary zakrzywionych nożyczek o ostrych końcach, dwie pary tępych nożyczek, jedna para mikroskopu i jedna para prostych mikroskopu o gładkich (bez ząbków) końcach. 
	UWAGA: Przetrzyj narzędzia chirurgiczne 75% alkoholem i utrzymuj je w suchości zarówno przed, jak i po eksperymencie.</li>
	<li>Przygotuj bufory.
	<ol>
		<li>1x PBS.</li>
		<li>4% roztwór fiksujący paraformaldehydu (4% PFA).</li>
		<li>Roztwór blokujący (1x PBS zawierający 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5% Triton X-100 i 2% surowicy bydlęcej).</li>
		<li>Bufor do rozcieńczania przeciwciał (1x PBS zawierający 3% BSA i 0,5% Triton X-100).</li>
		<li>Środek montujący Antifade. 
		​UWAGA: Przygotowaną substancję można przechowywać w temperaturze 4 °C przez miesiąc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór znieczulający 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin, 1,25%, 50 ml)
	<ol>
		<li>Waż 0,625 g tribromoetanolu do 2 ml rury, dodaj 1,25 ml alkoholu izoamylowego i dokładnie rozpuść (37 °C w szyjce).</li>
		<li>Przenieś całkowicie rozpuszczony roztwór tribromoetanolu-alkoholu izoamylowego do 50 ml stożkowej probówki, dodaj 1x PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml i dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór przez filtr o średnicy 0,22 μm w biologicznej szafie bezpieczeństwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór owalbuminy, koniugatu Alexa Fluor 647 (OVA-647) (2 mg/ml). Rozpuść 2 mg OVA-647 w 1 ml sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF).</li>
</ol>
2. Złożenie igły wstrzykiwania i podłączenie do pompy mikroiniekcyjnej
<ol>
	<li>Użyj tępych nożyczek, aby oderwać igłę 30 G i zachować końcówkę11 (średnica zewnętrzna 0,30 mm, średnica wewnętrzna 0,15 mm, długość 8 mm).</li>
	<li>Użyj 30 cm rury PE-10 (średnica zewnętrzna 0,64 mm, średnica wewnętrzna 0,28 mm), aby połączyć oderwaną igłę 30 G z igłą mikroiniekcyjną zawierającą igłę 30 G (Rysunek 1).</li>
	<li>Zamontuj igłę mikroiniekcyjną, z przymocowanym wężem i igłą 30 G, na pompie mikroiniekcyjnej.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie i.c.m. i obrazowanie na żywo
UWAGA: Jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko i przebije miąższ mózgu, substancja wstrzyknięta zostanie wprowadzona do tkanki mózgowej, a nie do komory CSF, co skutkuje niedokładnymi wynikami i potencjalnie prowadzi do śmierci myszy. Podczas zabiegu chirurgicznego wymagane jest ciągłe monitorowanie fizjologiczne myszy. Głębokość znieczulenia należy oceniać co 15 min za pomocą odruchu ściskającego palce, aby upewnić się, że zwierzę pozostaje wolne od bólu. Temperaturę ciała należy utrzymywać na poziomie 37 °C ± 0,5 °C za pomocą podgrzewanej podkładki, aby zapobiec hipotermii i powiązanym z nią wpływom na funkcje fizjologiczne. Ponadto co 30 min należy rejestrować oddech i częstość akcji serca, oceniając ruchy klatki piersiowej i palpując wierzchołek serca. Podczas wstrzyknięcia i.c.m., jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko i spowoduje krwawienie, oznacza to nieudane wstrzyknięcie. Zakończ eksperyment i wykonaj eutanazję zwierzęcia.
<ol>
	<li>Waż mysz i podaj 200 mg/kg Avertin drogą dootrzewnowej, aby znieczulić mysz. 
	UWAGA: Można stosować alternatywne leki znieczulające (np. ketamina/ksylazina).</li>
	<li>Nanieś maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.</li>
	<li>Nanieś krem do depilacji na szyję, aby usunąć włosy nad węzłami chłonnymi, gdy odruch ściskającego palce przestanie występować, a oddech stanie się powolny i regularny.</li>
	<li>Ogol szyję.</li>
	<li>Umieść mysz w ramie stereotaktycznej na podkładce grzewczej z głową nachyloną pod kątem 120° do tułowia (<strong class

<ol>
	<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523, 337-341 (2015).</li><li>Aspelund, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dural+lymphatic+vascular+system+that+drains+brain+interstitial+fluid+and+macromolecules.">A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules.</a> J Exp Med. 212, 991-999 (2015).</li><li>Sandrone, S., Moreno-Zambrano, D., Kipnis, J., Van Gijn, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+(delayed)+history+of+the+brain+lymphatic+system.">A (delayed) history of the brain lymphatic system.</a> Nat Med. 25, 538-540 (2019).</li><li>Da Mesquita, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and alzheimer's disease.</a> Nature. 560, 185-191 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphatic+vessels+regulate+brain+tumor+drainage+and+immunity.">Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity.</a> Cell Res. 30, 229-243 (2020).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphatic+vessels+mediate+neurotropic+viral+drainage+from+the+central+nervous+system.">Meningeal lymphatic vessels mediate neurotropic viral drainage from the central nervous system.</a> Nat Neurosci. 25, 577-587 (2022).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+meningeal+immunity+drive+impaired+cns+lymphatic+drainage.">Age-related alterations in meningeal immunity drive impaired cns lymphatic drainage.</a> J Exp Med. 220, (2023).</li><li>Kodama, T., Hatakeyama, Y., Kato, S., Mori, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+fluid+drainage+pathways+in+lymphatic+vessels+and+lymph+nodes+using+a+mouse+model+to+test+a+lymphatic+drug+delivery+system.">Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system.</a> Biomed Opt Express. 6, 124-134 (2015).</li><li>Banerjee, R., Knauer, L. A., Yang, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+in+vivo+and+in+vitro+study+of+lymphatic+valve+formation+driven+by+shear+stress+signaling+pathway.">Protocol for in vivo and in vitro study of lymphatic valve formation driven by shear stress signaling pathway.</a> STAR Protoc. 4, 102141 (2023).</li><li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+dermal+lymphatic+endothelial+cell+isolation.">Murine dermal lymphatic endothelial cell isolation.</a> J Vis Exp. (197), e65393 (2023).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+implantation+into+the+cisterna+magna+of+rodents.">Cannula implantation into the cisterna magna of rodents.</a> J Vis Exp. (135), e57378 (2018).</li><li>Hsieh, Y. T., Chen, S. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+analysis+of+neuromuscular+junctions+using+immunofluorescence.">Visualization and analysis of neuromuscular junctions using immunofluorescence.</a> Bio Protoc. 14, e5076 (2024).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyve-1,+a+new+homologue+of+the+cd44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">Lyve-1, a new homologue of the cd44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144, 789-801 (1999).</li><li>Da Mesquita, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphatics+affect+microglia+responses+and+anti-abeta+immunotherapy.">Meningeal lymphatics affect microglia responses and anti-abeta immunotherapy.</a> Nature. 593, 255-260 (2021).</li><li>Betsholtz, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+controversies+in+meningeal+biology.">Advances and controversies in meningeal biology.</a> Nat Neurosci. 27, 2056-2072 (2024).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathol. 137, 151-165 (2019).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+eeg+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high eeg delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Sci Adv. 5, eaav5447 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+body+posture+on+brain+glymphatic+transport.">The effect of body posture on brain glymphatic transport.</a> J Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).</li></ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

To protokoll zapewnia kompleksową metodę oceny funkcji i morfologii MLV poprzez integrację iniekcji i.c.m., in vivo obrazowanie CLN, sekcje oponą twardą i barwienie całego preparatu. Kluczowa zaletą tego zintegrowanego podejścia w porównaniu z konwencjonalnymi metodami jest to, że umożliwia jednoczesną ocenę funkcji drenażu limfatycznego i morfologii naczyń w jednym i tym samym zwierzęciu, eliminując potrzebę osobnych grup doświadczalnych, a tym samym zmniejszając zmienność eksperymentalną i poprawiając porównyw...

MLV są zlokalizowany w żyłach twardówkowych i są w stanie przenosić składniki mózgowo-rdzeniowego płynu otoczenia oraz komórki odpornościowe z OUN do WŁL1,2. Odkrycie MLV wyzwał tradycyjny koncept "uprzywilejowanej immunologicznie" strefy ośrodkowego układu nerwowego i stało się gorącym tematem badań w ostatnich latach3. Badania wykazały, że upośledzona funkcja MLV jest ściśle związana z różnymi chorobami, w tym chorobą Alzheimera, wiekiem związanym z pogorszeniem funkcji poznawczych, guzami mózgu oraz infekcjami OUN4,5,6,7. W miarę postępów badań w tej dziedzinie rośnie potrzeba zintegrowanych, powtarzalnych i dobrze standaryzowanych metod eksperymentalnych.
Większość istniejących protokołów badań nad naczyniami limfatycznymi koncentruje się na naczyniach limfatycznych obwodowych8,9,10. W badaniach dotyczących MLV, jedno z badań opisuje prostą procedurę kaniulacji CM, która umożliwia bezpośredni dostęp do płynu mózgowo-rdzeniowego bez uszkodzenia czaszki lub parenchymy mózgu11. W połączeniu z technikami obrazowania, ta metoda może skutecznie oceniać funkcjonowanie układu glymphatic i dynamiki płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednak szczegółowe protokoły eksperymentalne do badania funkcji i morfologii MLV nie zostały dobrze udokumentowane.
Niniejszy protokół integruje obrazowanie funkcjonalne z analizą morfologiczną, umożliwiając jednoczesne uzyskiwanie danych dotyczących funkcji drenażowych i morfologii strukturalnej od tego samego zwierzęcia, zmniejszając tym samym liczbę stosowanych zwierząt i poprawiając porównywalność i spójność danych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten może być wykorzystywany do badania zmian strukturalnych i funkcjonalnych MLV w różnych modelach chorobowych, a także do oceny wpływu interwencji farmakologicznych lub genetycznych na MLV. Protokół zawiera szczegółowe opisy etapów operacyjnych, kluczowych środków ostrożności oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Ponadto opisana w protokole technika wstrzyknięcia i.c.m. może być niezależnie stosowana do podaży leków do czaszki, a procedura sekcji oponowej jest zgodna ze świeżymi tkankami do dalszej ekstrakcji RNA lub białek, oferując znaczną elastyczność i skalowalność.

<table><tbody><tr><td>ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)</td><td>Tocris&nbsp;&nbsp;</td><td>Cat# 3525</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21208</td><td></td></tr><tr><td>Antifade Mounting Medium</td><td>Beyotime</td><td>Cat# P0126</td><td></td></tr><tr><td>Blunt-tipped forceps</td><td>RWD Life Science</td><td>Cat# F12011-10</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>Cat# ST023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>CITOTEST</td><td>Cat# 80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Curved sharp forceps</td><td>RWD Life Science</td><td>Cat# F11003-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# D9542</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dish-10 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 150464</td><td></td></tr><tr><td>Disposable intravenous (IV) infusion needle</td><td>Zhejiang Kindly Medical Devices&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol-75%</td><td>Sinopharm Chemical Reagent&nbsp;</td><td>Cat# 80176961</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Excell</td><td>Cat# FSD500</td><td></td></tr><tr><td>Filter-0.22 &micro;m</td><td>Merck Millipore&nbsp;</td><td>Cat# SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>CITOTEST</td><td>Cat# 80340-3610</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent&nbsp;</td><td>Cat# 10003218</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micro forceps</td><td>Shinva Medical Instrument&nbsp;</td><td>Cat# ZD372RB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Shinva Medical Instrument&nbsp;</td><td>Cat# ZO13056R</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection needle (25 &micro;L)</td><td>Shanghai Gaoge Industry &amp; Trade&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection pump</td><td>Voyage Power</td><td>Cat# QHZS-001A</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male&nbsp;</td><td>Cavens</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Needle-30G</td><td>Zhejiang Kindly Medical Devices&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Normal Saline</td><td>Beyotime</td><td>Cat# ST341</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin, Alexa Fluor&trade; 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# O34784</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Fix Solution-4%</td><td>Beyotime</td><td>Cat# P0099</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 tubing</td><td>Shanghai Qiujing Biochemical Reagent and Instrument</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (1x PBS)</td><td>Beyotime</td><td>Cat# ST447</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)</td><td>Santa Cruz</td><td>Cat# sc-65647</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Jonec</td><td>Cat# JSZ6</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>RWD Life Science</td><td>Cat# 68030</td><td></td></tr><tr><td>Straight scissors</td><td>RWD Life Science</td><td>Cat# S12007-10</td><td></td></tr><tr><td>Syringe-1-mL&nbsp;</td><td>Zhejiang Kindly Medical Devices&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Adhesive I</td><td>3M Vetbond</td><td>Cat# 1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# T48402</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Cat# T8787</td><td></td></tr><tr><td>VS120 High-throughput fluorescence imaging system</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

zintegrowany protokół oceny naczyń chłonnych opon mózgowo-rdzeniowych: wstrzyknięcie do cisterny magny, wizualizowanie węzłów chłonnych, sekcja opon mózgowo-rdzeniowych i barwienie całego montażu

Integrated Protocol for Assessing Meningeal Lymphatics: Cisterna Magna Injection, Lymph Node Imaging, Meningeal Dissection, and Whole-Mount Staining

Naczynia limfatyczne oponowe (MLVs) stały się kluczowymi regulatorami homeostazy ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a dysfunkcja MLVs została związana z różnymi zaburzeniami neurologicznymi. W związku z tym kompleksowa ocena morfologii i funkcji MLVs jest niezbędna do zrozumienia ich roli w fizjologii i chorobach OUN. Niniejszy protokół opisuje zintegrowaną metodę oceny MLVs u myszy z wykorzystaniem czterech kluczowych technik: wstrzyknięcia środków śledzących fluorescencyjnych do cysterny wielkiej (i.c.m.), obrazowania na żywo węzłów chłonnych szyjnych (CLNs), sekcji opon mózgowo-rdzeniowych i barwienia całościowego. Po pierwsze, igła 30 G jest podłączona do strzykawki i pompy infuzyjnej za pomocą polietylenowej (PE) kaniuli. Po znieczuleniu myszy, otrzewna jest eksponowana poprzez stępowanie mięśni szyi, a igła wstrzykująca jest wprowadzana do cysterny wielkiej (CM), aby dostarczyć środek śledzący do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z precyzyjną kontrolą. Odpływ środka śledzącego do CLNs można wizualizować w czasie rzeczywistym, podczas gdy kolejna sekcja opon i barwienie całościowe umożliwiają szczegółową analizę morfologii grzbietowych MLVs. Cały proces można zakończyć w ciągu 3 h, obejmując wstrzyknięcie i.c.m., perfuzję tkanek, izolację czaszki i umieszczenie w roztworze fiksującym. Ten protokół można również dostosować do podawaniu leków do czaszki lub połączyć z analizami molekularnymi, ponieważ procedura sekcji opon jest kompatybilna ze świeżymi, niefiksowanymi tkankami nadającymi się do ekstrakcji RNA i białka.

Po wstrzyknięciu OVA-647 drogą i.c.m., obrazowanie in vivo małych zwierząt wykazało wyraźne, owalne sygnały fluorescencyjne rozłożone obustronnie w okolicy szyjnej (Rysunek 6A). W przypadku prawidłowych wstrzyknięć marker był wyraźnie widoczny w CLN po podaniu, a intensywność fluorescencji osiągnęła szczyt po około 60 min (Rysunek 6B). Dodatkowo sygnały fluorescencyjne zaobserwowano w wyizolowanych powierzchownych i głębokich węzłach chłonnych szyjnych ...

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Meningeal lymphatic vessels (MLVs) have emerged as critical regulators of central nervous system (CNS) homeostasis, and MLVs dysfunction has been ...

Nasze badania koncentrują się na metodzie oceny funkcji i morfologii naczyń limfatycznych opon mózgowych u myszy. Niniejszy protokół wspomaga modele chorób neurologicznych, dostarczanie leków, korelacje molekularne oraz badania translacyjne. Na początek należy przygotować narzędzia chirurgiczne oraz wymagane bufory.Za pomocą pęsety tępych przełamać igłę 30G i zachować jej końcówkę. Używając odcinem rurki polietylenowej PE10 o długości 30 cm, połączyć przełamaną igłę 30G z igłą do mikroiniekcji zawierającą igłę 30G. Zamontować zestawioną igłę i rurkę na pompie do mikroiniekcji.Zważ mysz. Po znieczuleniu myszy poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, potwierdź zanik odruchu cofania łapy po uciśnięciu palca oraz spowolnienie i stabilizację oddechu. Na obszar szyi nałóż krem do depilacji, aby usunąć włosy nad węzłami chłonnymi.Ogolić skórę grzbietnej części karku. Umieścić mysz w aparacie stereotaksycznym na macie grzewczej. Pochylić głowę pod kątem 120 stopni względem tułowia.Oczyść obszar kolejno jodopowidonem i 75% etanolem. Wykonaj cięcie w linii środkowej skóry szyi. Za pomocą dwóch par pęset tępych rozdziel warstwy mięśni.Używając pęsety z cienkimi końcami, przeprowadź dyssekcję przez mięśnie, aż stanie się widoczna półprzezroczysta opona twarda pokrywająca cysternę wielką (CM). Odsunij mięśnie, aby zachować stałą ekspozycję obszaru. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pęsety tępokrawędziowej, aby przytrzymać igłę.Wprowadź igłę pod kątem 45 stopni do płaszczyzny opony twardej na głębokość około jednego do dwóch milimetrów. Ustaw ścięcie igły równolegle do opony twardej tak, aby znajdowało się ono całkowicie pod nią. Użyj papieru chłonnego, aby osuszyć ewentualny wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).Ustaw pompę do mikroiniekcji tak, aby dostarczała jeden mikrolitr na minutę. Wstrzyknij 5 µL roztworu owalbuminy sprzężonej z AlexaFluor 647 do CM i pozostaw igłę w miejscu przez dwie minuty, aby zapobiec cofaniu się płynu. Nałóż jedną kroplę kleju biologicznego na oponę twardą i zamknij cięcie chirurgiczne.Przeprowadź obrazowanie in vivo myszy w celu monitorowania intensywności barwnika w węzłach chłonnych szyi (CLN) po 30 i 60 minutach. W panelu sterowania akwizycji IVIS wybierz kreator obrazowania (imaging wizard) i kliknij „dalej” w wyskakującym oknie. Wybierz rozdzielanie widmowe/skanowanie filtrów (spectral unmixing/filter scan) i kliknij „dalej”.Kliknij prawym przyciskiem myszy na nazwę sondy, wybierz barwniki, zaznacz AlexaFluor 647, a następnie kliknij Dalej. Wybierz ustawienia ręczne. Ustaw czas ekspozycji na 0,5 seconds.Użyj trybu z filtrem wzbudzenia 640 nanometrów i filtrem emisji 680 nanometrów. Po odcięciu głowy uśpionej myszy, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki, aby otworzyć skórę głowy. Za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych oddziel skórę głowy obustronnie poprzez delikatną retrakcję.Wprowadź zakrzywione kleszczyki hemostatyczne do oczodołów i usuń resztki skóry głowy z okolic nosa i pyska. Usuń żuchwę, zachowując nienaruszoną strukturę czaszki. Usuń kość z podstawy czaszki, aby odsłonić brzuszna stronę mózgu.Używając pęsety tępym końcem, ostrożnie wyjmij mózg, unikając kontaktu z oponą twardą kości ciemieniowych. Całkowicie zanurz górną część czaszki w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu. Przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsius za 24 godziny.Gdy utrwalona czaszka osiągnie temperaturę pokojową, należy przemyć ją 5 ml 1XPBS i powtórzyć to przemywanie trzykrotnie, za każdym razem przez 10 minut. Umieścić czaszkę stroną grzbietową do dołu w 10 cm szalce wypełnionej 1XPBS. Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami chwycić lub nacisnąć bąbel słuchowy, a następnie usunąć go z czaszki.Za pomocą nożyczek przytnąć powierzchnię brzuszną czaszki na długości około dwóch milimetrów, aby ją wygładzić. Za pomocą pęsety usunąć pozostałości białej tkanki z miejsca zbiegu zatok lub obszaru COS opon mózgowych. Używając precyzyjnej mikropęsety, delikatnie unieść jeden brzeg opon mózgowych od krawędzi czaszki.Podnieś przeciwległą krawędź. Chwyć miseczkowaty brzeg opon mózgowych i pociągnij, aby oddzielić je od czaszki w regionie COS. Usuń kość szczękową za pomocą nożyczek.Ponownie chwyć krawędź opon mózgowych i pociągnij, aby oddzielić je od czaszki w obszarze kości czołowej. Umieść nienaruszone opony w płytce 24-dołkowej zawierającej 1 mL 1XPBS. Po zablokowaniu i barwieniu opon przeciwciałami pierwszorzędowymi oraz drugorzędowymi, wykonaj obrazowanie.Obrazowanie in vivo wykazało odrębne, owalne sygnały fluorescencyjne rozmieszczone obustronnie w obszarze szyjnym po wstrzyknięciu. Tracer był wyraźnie widoczny w CLN po wstrzyknięciu, a intensywność fluorescencji osiągnęła szczyt po około 60 minutach. Sygnały fluorescencyjne zaobserwowano w wyizolowanych powierzchownych i głębokich węzłach chłonnych szyi.Nieudane wstrzyknięcia nie doprowadziły do wykrycia sygnału fluorescencyjnego w obszarze szyjnym. Barwienie immunofluorescencyjne na receptor hialuronianu naczyń limfatycznych 1 (LYVE1) wyraźnie zarysowało morfologię naczyń limfatycznych. Zaobserwowano przerywany sygnał LYVE1 spowodowany przerwanym oponami mózgowo-rdzeniowymi, co uniemożliwiło wiarygodną kwantyfikację.W uszkodzonych próbkach widoczny był brak obszaru zatoki poprzecznej. Wykorzystując to podejście, badacze mogą badać funkcję przejściową oraz morfologię nosową opartą na grzbietowej ML u myszy. Największym wyzwaniem jest przeprowadzanie aktualnych wstrzyknięć ścięgnistych do wewnątrzczuciowych oraz staranna dyssekcja opon mózgowych przy jednoczesnym zachowaniu integralności naczyń.Po wykonaniu tej procedury badacze mogą przeprowadzić ekstrakcję RNA oraz białek. Wewnątrzczaszkowe dostarczanie leków lub analiza w modelach chorób.

integrated-protocol-for-assessing-meningeal-lymphatics-cisterna-magna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magna, Obrazowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całości

Tutaj opisujemy protokół wykonywania kaniulacji cisterna magna (CMc), minimalnie inwazyjnego sposobu dostarczania znaczników, substratów i cząsteczek sygnałowych do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). W połączeniu z różnymi metodami obrazowania, CMc umożliwia ocenę dynamiki układu limfatycznego i płynu mózgowo-rdzeniowego, a także dostarczanie różnych związków do mózgu.

Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni

Opisujemy iniekcję domostkową, która wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, która może być stabilizowana do czaszki, eliminując w ten sposób ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Podejście to może być wykorzystane do genetycznego mapowania losów i manipulacji komórkami opon mózgowo-rdzeniowych oraz do śledzenia ruchów płynu mózgowo-rdzeniowego.

Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie domostkowe

Przedstawiono protokół łączący oczyszczanie tkanek z mikroskopią fluorescencyjną (LSFM) w celu uzyskania trójwymiarowych i komórkowych obrazów naczyń limfatycznych i węzłów chłonnych (LN) zbierających płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i płyn zewnątrzoponowy rdzeniowy.

Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO+ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Aby badać regulację przepływu krwi w mózgu in vivo, tradycyjne metody farmakologiczne są inwazyjne, często uszkadzając czaszkę, oponę twardą i opony mózgowo-rdzeniowe. W ramach tej pracy opracowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę, która łączy wstrzykiwanie intracisternal magna (ICM) pod kontrolą nanoiniektora z laserowym obrazowaniem kontrastowym, zachowując integralność czaszki i opon mózgowo-rdzeniowych.

Sparowany test obrazowania Cisterna Magna Nanoinjection i laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym w celu zbadania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo

Protokół opisuje metodę wstrzykiwania komórek nowotworowych drogą przezskórnego nakłucia do cisterna magna, która silnie indukuje przerzuty opon mózgowo-rdzeniowych u myszy, zmniejszając uraz i obciążenie guzem pozaczaszkowym.

Minimalnie inwazyjny model iniekcji Cisterna Magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy

Przedstawiamy tutaj protokół jasno definiujący kroki anastomozy głębokiego węzła chłonnego szyjnego lub jego naczynia aferentnego z tylną żyłą twarzową u szczura, aby zminimalizować wpływ innych zmiennych i ujednolicić prowadzenie badań chirurgicznych.

Protokoły chirurgiczne głębokiej anastomozy szyjnej szyjnej w modelu szczura: anastomozy węzłów chłonnych i naczyń chłonnych

Ten eksperymentalny protokół demonstruje głęboki model szczura z kaniulowaniem przewodów wędrowych szyjnych, który umożliwia bezpośrednią i ilościową ocenę drenażu limfatycznego z okolic głowy. Model umożliwia szczegółową analizę substancji rozpuszczonych pochodzących z ośrodkowego układu nerwowego (OUN), populacji komórek odpornościowych oraz dystrybucję i oczyszczanie terapii ukierunkowanych na OUN.

Model szczura z kanulacją przewodu limfatycznego szyjnego do oceny transportu limfatycznego z głowy i mózgu

Ten protokół ocenia drenaż limfatyczny po złamaniu poprzez łączenie obrazowania w bliskiej podczerwieni z użyciem zielonej indokyaninowej (ICG) z ultrasonografią w celu ilościowego określenia usuwania ICG podeszwowego i powiększenia węzłów chłonnych okołokolanowych u myszy.

Ocena drenażu limfatycznego z wykorzystaniem obrazowania ICG w bliskiej podczerwieni i ultradźwięków po złamaniu

Poznaj zintegrowany protokół oceny naczyń chłonnych opon mózgowo-rdzeniowych u myszy, obejmujący wstrzyknięcie do cisterny magny, wizualizację węzłów chłonnych i barwienie całego montażu. Metoda umożliwia kompleksową analizę funkcjonalną i morfologiczną w ciągu około trzech godzin.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu (Wideo) | JoVE Journal

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Przeglądaj więcej filmów