Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Nasze badania koncentrują się na metodzie oceny funkcji i morfologii naczyń limfatycznych opon mózgowych u myszy. Niniejszy protokół wspomaga modele chorób neurologicznych, dostarczanie leków, korelacje molekularne oraz badania translacyjne. Na początek należy przygotować narzędzia chirurgiczne oraz wymagane bufory.

Za pomocą pęsety tępych przełamać igłę 30G i zachować jej końcówkę. Używając odcinem rurki polietylenowej PE10 o długości 30 cm, połączyć przełamaną igłę 30G z igłą do mikroiniekcji zawierającą igłę 30G. Zamontować zestawioną igłę i rurkę na pompie do mikroiniekcji.

Zważ mysz. Po znieczuleniu myszy poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, potwierdź zanik odruchu cofania łapy po uciśnięciu palca oraz spowolnienie i stabilizację oddechu. Na obszar szyi nałóż krem do depilacji, aby usunąć włosy nad węzłami chłonnymi.

Ogolić skórę grzbietnej części karku. Umieścić mysz w aparacie stereotaksycznym na macie grzewczej. Pochylić głowę pod kątem 120 stopni względem tułowia.

Oczyść obszar kolejno jodopowidonem i 75% etanolem. Wykonaj cięcie w linii środkowej skóry szyi. Za pomocą dwóch par pęset tępych rozdziel warstwy mięśni.

Używając pęsety z cienkimi końcami, przeprowadź dyssekcję przez mięśnie, aż stanie się widoczna półprzezroczysta opona twarda pokrywająca cysternę wielką (CM). Odsunij mięśnie, aby zachować stałą ekspozycję obszaru. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pęsety tępokrawędziowej, aby przytrzymać igłę.

Wprowadź igłę pod kątem 45 stopni do płaszczyzny opony twardej na głębokość około jednego do dwóch milimetrów. Ustaw ścięcie igły równolegle do opony twardej tak, aby znajdowało się ono całkowicie pod nią. Użyj papieru chłonnego, aby osuszyć ewentualny wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).

Ustaw pompę do mikroiniekcji tak, aby dostarczała jeden mikrolitr na minutę. Wstrzyknij 5 µL roztworu owalbuminy sprzężonej z AlexaFluor 647 do CM i pozostaw igłę w miejscu przez dwie minuty, aby zapobiec cofaniu się płynu. Nałóż jedną kroplę kleju biologicznego na oponę twardą i zamknij cięcie chirurgiczne.

Przeprowadź obrazowanie in vivo myszy w celu monitorowania intensywności barwnika w węzłach chłonnych szyi (CLN) po 30 i 60 minutach. W panelu sterowania akwizycji IVIS wybierz kreator obrazowania (imaging wizard) i kliknij „dalej” w wyskakującym oknie. Wybierz rozdzielanie widmowe/skanowanie filtrów (spectral unmixing/filter scan) i kliknij „dalej”.

Kliknij prawym przyciskiem myszy na nazwę sondy, wybierz barwniki, zaznacz AlexaFluor 647, a następnie kliknij Dalej. Wybierz ustawienia ręczne. Ustaw czas ekspozycji na 0,5 seconds.

Użyj trybu z filtrem wzbudzenia 640 nanometrów i filtrem emisji 680 nanometrów. Po odcięciu głowy uśpionej myszy, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki, aby otworzyć skórę głowy. Za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych oddziel skórę głowy obustronnie poprzez delikatną retrakcję.

Wprowadź zakrzywione kleszczyki hemostatyczne do oczodołów i usuń resztki skóry głowy z okolic nosa i pyska. Usuń żuchwę, zachowując nienaruszoną strukturę czaszki. Usuń kość z podstawy czaszki, aby odsłonić brzuszna stronę mózgu.

Używając pęsety tępym końcem, ostrożnie wyjmij mózg, unikając kontaktu z oponą twardą kości ciemieniowych. Całkowicie zanurz górną część czaszki w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu. Przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsius za 24 godziny.

Gdy utrwalona czaszka osiągnie temperaturę pokojową, należy przemyć ją 5 ml 1XPBS i powtórzyć to przemywanie trzykrotnie, za każdym razem przez 10 minut. Umieścić czaszkę stroną grzbietową do dołu w 10 cm szalce wypełnionej 1XPBS. Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami chwycić lub nacisnąć bąbel słuchowy, a następnie usunąć go z czaszki.

Za pomocą nożyczek przytnąć powierzchnię brzuszną czaszki na długości około dwóch milimetrów, aby ją wygładzić. Za pomocą pęsety usunąć pozostałości białej tkanki z miejsca zbiegu zatok lub obszaru COS opon mózgowych. Używając precyzyjnej mikropęsety, delikatnie unieść jeden brzeg opon mózgowych od krawędzi czaszki.

Podnieś przeciwległą krawędź. Chwyć miseczkowaty brzeg opon mózgowych i pociągnij, aby oddzielić je od czaszki w regionie COS. Usuń kość szczękową za pomocą nożyczek.

Ponownie chwyć krawędź opon mózgowych i pociągnij, aby oddzielić je od czaszki w obszarze kości czołowej. Umieść nienaruszone opony w płytce 24-dołkowej zawierającej 1 mL 1XPBS. Po zablokowaniu i barwieniu opon przeciwciałami pierwszorzędowymi oraz drugorzędowymi, wykonaj obrazowanie.

Obrazowanie in vivo wykazało odrębne, owalne sygnały fluorescencyjne rozmieszczone obustronnie w obszarze szyjnym po wstrzyknięciu. Tracer był wyraźnie widoczny w CLN po wstrzyknięciu, a intensywność fluorescencji osiągnęła szczyt po około 60 minutach. Sygnały fluorescencyjne zaobserwowano w wyizolowanych powierzchownych i głębokich węzłach chłonnych szyi.

Nieudane wstrzyknięcia nie doprowadziły do wykrycia sygnału fluorescencyjnego w obszarze szyjnym. Barwienie immunofluorescencyjne na receptor hialuronianu naczyń limfatycznych 1 (LYVE1) wyraźnie zarysowało morfologię naczyń limfatycznych. Zaobserwowano przerywany sygnał LYVE1 spowodowany przerwanym oponami mózgowo-rdzeniowymi, co uniemożliwiło wiarygodną kwantyfikację.

W uszkodzonych próbkach widoczny był brak obszaru zatoki poprzecznej. Wykorzystując to podejście, badacze mogą badać funkcję przejściową oraz morfologię nosową opartą na grzbietowej ML u myszy. Największym wyzwaniem jest przeprowadzanie aktualnych wstrzyknięć ścięgnistych do wewnątrzczuciowych oraz staranna dyssekcja opon mózgowych przy jednoczesnym zachowaniu integralności naczyń.

Po wykonaniu tej procedury badacze mogą przeprowadzić ekstrakcję RNA oraz białek. Wewnątrzczaszkowe dostarczanie leków lub analiza w modelach chorób.