ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Adrianie Montserrat za zarządzanie administracyjne i zakupowe. A. Ronceret uznaje granty od UNAM-PAPIIT i SECIHTI oraz dziękuje Instytutowi Biotechnologii (IBt-UNAM) za wsparcie początkowe i roczne. P. Bolaños dziękuje Wicerektoratowi ds. Badań na Uniwersytecie Kostaryki za ciągłe wsparcie.

UWAGA: Obsługiwać formaldehyd i akryloamid należy z zachowaniem należytej ostrożności i stosując odpowiednie wyposażenie do ochrony osobistej oraz zabezpieczenia chemicznego; oba są toksyczne (akryloamid jest również neurotoksyczny przed polimeryzacją). Wszystkie materiały użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Fiksacja pylników kukurydzy w celu zachowania integralnej struktury meiocytów
<ol>
	<li>Użyj roślin kukurydzy na etapie V13 z kwiatostanami wciąż rosnącymi wewnątrz łodygi. W tygodniu fiksacji meiotycznych pylników, należy nosić rękawiczki i delikatnie naciskać zgrubiały łodygę w miejscu wybrzuszeń, aby sprawdzić, czy jest dość miękka, by ją otworzyć. 
	UWAGA: Ten protokół fiksacji i immunolokalizacji może być stosowany zarówno dla kukurydzy, jak i pąków kwiatowych mejotycznych Arabidopsis thaliana (mniej niż 400 µm). Jednak w przypadku kukurydzy, w zależności od użytej odmiany i pory roku (wiosna przyspiesza wzrost), od momentu sadzenia do osiągnięcia odniesienia dla linii inbred B73 upływa około 8 tygodni, ale tylko 6 tygodni dla wcześnie kwitnącej linii inbred A344.</li>
	<li>Przygotowanie buforów. 
	UWAGA: Dzień przed fiksacją chemiczną, przygotuj następujące roztwory robocze, czyń to uważnie i poprawnie oznacz wszystkie butelki.
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 mL 10x Bufor A (BA) soli, dodając 4,53 g PIPES (Piperazina-N, N′-bis(2-etanosulfonian) w ostatecznym stężeniu 150 mM), 5,96 g KCl (ostateczne stężenie 800 mM), 1,17 g NaCl (ostateczne stężenie 200 mM), 0,74 g EDTA (ostateczne stężenie 20 mM), 0,19 g EGTA (ostateczne stężenie 5 mM) oraz 90 mL H2O, najpierw dostosuj pH do 6,8–7 za pomocą KOH, a następnie dostosuj objętość do 100 mL.</li>
		<li>Na koniec filtrosterylizuj za pomocą jednorazowego sterylnego filtra Rapid-Flow z PES o porowatości 0,45 µm (przechowywaj w 4 °C, ale nie zamrażaj; możesz przechowywać przez kilka miesięcy).</li>
		<li>Przygotuj: 
		- 50 mM PIPES (pH dostosowany do 7 za pomocą KOH). 
		- zasoby sperminy w stężeniu 0,4 M (wcześniej rozpuszczone w 50 mM PIPES, dostosuj pH do 7 za pomocą KOH, przechowuj alikwoty 50 µL w -20 °C). 
		- zasoby spermidyny w stężeniu 0,4 M (rozpuszczone w 50 mM PIPES, pH dostosowane do 7 za pomocą KOH, przechowuj zamrożone alikwoty 125 µL w -20°C). 
		- zasoby Ditiotreitolu (DTT) 1 M (rozpuszczone w 0,01 M octotaniu sodu, do pH 5,2, przechowuj zamrożone alikwoty 100 µL w -20 °C). 
		- sorbitol 2 M, przechowywany w 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 50 mL 2x Bufor A (BA), na lodzie, używając 10 mL 10x Bufor A soli (przechowywany w 4 °C), 50 µL sperminy (0,4 M w 50 mM PIPES, z pH dostosowanym do 7 za pomocą KOH), 125 µL spermidyny (0,4 M w 50 mM PIPES, z pH dostosowanym do 7 za pomocą KOH), 100 µL DTT (1 M w 0,01 M octotaniu sodu, pH 5,2) energicznie wymieszaj, aby się rozpuścił; i nie podgrzewaj.
	<ol>
		<li>Następnie dodaj 16 mL 2 M sorbitolu. Dostosuj ostateczną objętość do 50 mL sterylną wodą. Przefiltruj i sterylizuj za pomocą jednorazowego sterylnego filtra Rapid-Flow i przechowuj w 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wilgotną komorę złożoną z 5-10 zwilżonych ręczników papierowych umieszczonych w plastikowym pudełku. Upewnij się, że pokrywka szczelnie się zamyka. Usuń wszelką nadmiarę wody.</li>
	<li>Następnie umieść w tacki następujące przedmioty: wilgotną komorę, ostrzałkę, drobne kleszcze (wcześniej wysuszone 70% alkoholem), małą butelkę sterylnej wody i taśmę maskującą. Przynieś tackę i jej zawartość do roślin kukurydzy sprawdzonych w kroku 1.1.</li>
	<li>Użyj ostrza do otwarcia zgrubiałej łodygi na wysokości kwiatostanu. Główne gałęzie kłosów, jak również boczne gałęzie kwiatostanu, mogą być używane do zbioru meiotycznych kwiatów. 
	UWAGA: Te gałęzie kłosów zawierają interesujące kwiaty do zbierania meiotycznych pylników. Każdy kwiat zawiera sześć pylników, a 3 górne, większe są zazwyczaj używane do analizy. Przybliżona wielkość i kolor pylników koreluje z każdym etapem mejozy. Prawie przezroczyste pylniki o długości około 1 mm są na etapie leptotenu, przezroczyste pylniki o długości 1,5 mm są na etapie zygotenu, białawe pylniki o długości 2 mm są na etapie pachytenu, a żółtawe pylniki o długości większej niż 2 mm mogą zawierać meiocyty na etapie diplotenu, tetrad i ziarna pyłku,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

To protokoll oferuje kluczową przewagę nad innymi, ponieważ zachowuje istotne trójwymiarowe dane dotyczące ładowania białek chromosomowych mejotycznych. Te cechy nie mogą być zachowane przy użyciu regularnych technik rozprowadzania1,2. Niemniej jednak, ten protokół ma dwie ograniczenia: jest powolny i wymaga dużego nakładu pracy w porównaniu z regularnymi technikami rozprowadzania wykonywanymi w ciągu jednego dnia. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół wymaga ...

Mejoza jest kluczowym procesem, który reguluje przekazywanie cech u roślin modelowych i upraw; dlatego proste metody mikroskopiczne, które umożliwiają spójne i wiarygodne wizualizowanie lokalizacji białek, ułatwiają zrozumienie, jak te cechy mogą być przekazywane bardziej efektywnie. Niestety, wizualizację lokalizacji białek wewnątrz meiocytów znacznie różniła w zależności od stosowanej techniki1,2. Zatem celem protokołu jest zapewnienie prostego, powtarzalnego metodu, który eliminuje artefakty podczas obserwacji meiocytów. Na przykład od dawna uznaje się, że obserwacja chromosomów mejotycznych jest delikatnym procesem, który ułatwia rozcieranie komórek poprzez proste rozgniatanie lub jeszcze bardziej niszczące techniki rozmazywania3,4,5. W Arabidopsis thaliana naukowcy zwykle stosujące metody rozmazywania, które wykorzystują utrwalacz Carnoy’a (3:1 mieszanka etanolu i kwasu octowego) wraz z różnymi detergentami, takimi jak Lipsol, Tween-20 i TritonX-100, a także mieszankami enzymów zawierających celulazę, pektynazę i cytohelikazy, aby rozbić komórki i umożliwić skuteczne immunolokalizację na jego małych chromosomach1,2. Te techniki zamieniają 3D konformację chromosomu w 2D, umożliwiając szybkie obserwowanie całości sztucznie rozproszonych chromosomów na jednym obrazku. Pewne cechy chromosomów, które przetrwają te surowe traktowania, mogą być widoczne; jednak często nie reprezentują typową zachowanie komórek i chromosomów in vivo6. Szybka i bardzo szeroka detekcja do dwóch przeciwciał jest możliwa za pomocą 2D technik rozmazywania u różnych gatunków roślin, w tym u kukurydzy7,8,9,10,11.
Mimo to, pomimo wygody starszych technik 2D, obecnie uznaje się, że niektóre zjawiska są wrażliwe na metody niszczące i nie można ich obserwować, jeśli komórka, jądro lub chromosomy są uszkodzone podczas rozmazywania lub rozgniatania. Na przykład ruch białka RAD50 z cytoplazmy do jądra w czasie etapu leptotenu, lub podczas sprzęgania centromerów (leptonem/zygonem), został wykryty tylko w nienaruszonych 3D meiocytach12. Tutaj czytelnikom oferujemy szczegółowy 4-dniowy protokół 3D, który wykorzystuje kwiatki utrwalone w 4% paraformaldehydzie do immunolokalizacji trzech kluczowych białek w męskich meiocytach kukurydzy, zachowując tym samym ich integralność strukturalną. W porównaniu do podobnej metodologii 3D immunolokalizacji kukurydzy8, dodaliśmy praktyczne uwagi i porady dotyczące rozwiązywania problemów dla naukowców. Ten protokół będzie przydatny dla biologów roślin i hodowców roślin zainteresowanych badaniem różnych procesów mejotycznych, takich jak kontrola rekombinacji mejotycznej przez kompleks synaptonemalową.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtubes Axygen</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate Falcon polystyrene microplate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Ocetowa kwas, 60%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid 30%&nbsp; oraz roztwór bis-akrylamidu, 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610157</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowy składany</td><td>Reynolds&nbsp;</td><td>U07211R0</td><td></td></tr><tr><td>Persiarczan amonu (APS)</td><td>Merck</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Binokularowy stereomikroskop</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Albumina wołowa (BSA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>&nbsp;A9418</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop DelltaVision</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Destylowana H2O</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe jednostki filtracyjne z filtrami PES o porach 0,45 &mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific/Nalgene</td><td>09-740-63B</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne kleszcze FST Dumont SS</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>kozi (IgG H+L) silnie wchłaniany krzyżowo przeciwko szczurom, oznaczony AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>kozi (IgG H+L) silnie wchłaniany krzyżowo przeciwko królikom, oznaczony AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>kozi (IgG H+L) silnie wchłaniany krzyżowo przeciwko świnkom morskim, oznaczony AlexaFluor488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11073</td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki</td><td>Merck</td><td>Z412392</td><td></td></tr><tr><td>Komory hodowlanowe / szklarnia / lub pole</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Merck</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Taśma maskująca 3M</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-047-259</td><td></td></tr><tr><td>Nasienie kukurydzy</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy 22 x 22 mm-1,5 szklane pokrywki&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy 22 x 22 mm-H pokrywki&nbsp;</td><td>Deckgläser, Zeiss</td><td>474030-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopowe szklany slajd</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopowa skrzynka na slajd</td><td>Fisher Scientific,</td><td>03-448-9</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety P20, P200, P1000</td><td>Merck</td><td>CLS4069</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Merck</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór paraformaldehydu&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Grade</td><td>&nbsp;15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>Plastowa skrzynka z pokrywką</td><td>Tupperware</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lizyna</td><td>Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwotne (anty-ZmAFD1 szczura, anty-ZmASY1 królika, anty-ZmZYP1 świnki morskiej)</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Antifading</td><td>Molecular Probes</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish regular size</td><td>Merck</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Merck</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipet (0,5-10 uL) sterylne&nbsp;</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT300</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipet (200 uL) sterylne</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT200Y&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipet (1000 uL) sterylne</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT1000BRS</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza brzytwy - jednosieczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsacz z platformą obrotową</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Spermina</td><td>Merck</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Merck</td><td>S8143</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysty akrylamid</td><td>Invitrogen</td><td>15512023</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Three-Dimensional Immunolocalization In Maize Meiocytes

W czasie profazy I mejozy, fizyczna konfiguracja chromosomów różni się znacznie na poszczególnych etapach rozwoju, na szczęście te specyficzne dla faz konfiguracje pozwalają na prawidłową identyfikację każdego z tych klasycznych etapów mejozy, które są odpowiednio znane jako leptoten (np. ‘cienkie nici’), zygoten (np. ‘spojene nici’), pachyten (np. ‘grubkie nici’), dyploten (np. ‘podwójne nici’) i diakineza (np. ‘ruch odpychający’). Wizualna analiza kilku zjawisk cytogenetycznych, które występują podczas profazy I, takich jak rekombinacja, parowanie i synapsis, wymaga wysoce niezawodnych technik immunolokalizacji. W przeciwieństwie do tradycyjnych technik rozciągania i miażdżenia, które tłumią wszystkie informacje subkomórkowe i subnuklearne, opisana tu procedura 3D konserwacji pozwala na zachowanie kluczowych białek mejotycznych w ich naturalnych miejscach lokalizacji subkomórkowej (cytoplazmatycznej, jądrowej i subnuklearnej: euchromatyna, heterochromatyna i nukleolus). Dlatego protokół ten opisuje, jak efektywnie fiksować mejotyczne pylniki, dysekcję i uwalnianie mejocytów z pylników oraz przeprowadzać jednoczesną immunolokalizację trzech kluczowych białek w męskich mejocytach kukurydzy.

Stosując niniejszy protokół, możemy jednocześnie obserwować wzorce lokalizacji trzech kluczowych białek meiotycznych u kukurydzy (Ryc. 1). Białko meiotyczne ABSENCE OF FIRST DIVISION 1 (AFD1) jest homologiem podjednostki REC8 typu alpha-Kleisin kompleksu kohezyny meiotycznej. Białko ASYNAPTIC 1 (ASY1) jest kluczowym elementem osiowym, natomiast ZYPPER1 (ZYP1) stanowi element poprzeczny kompleksu synaptonemalnego15. Barwienie DAPI ukazuje wyraźne jądro i barwienie chro...

Ten protokół immunolokalizacji w męskich mejocytach kukurydzy zachowuje trójwymiarową integralność komórek podczas mejozy. Umożliwia dynamiczne śledzenie lokalizacji wewnątrzkomórkowej do trzech niezależnych przeciwciał w zachowanym materiale utrwalonym paraformaldehydem, oprócz DAPI, które barwi DNA.

Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

During meiotic prophase I, the physical configuration of chromosomes varies widely across developmental stages, fortunately these stage-specific ...

Nasze badania koncentrują się na opracowaniu podejścia 3D do badania męskich meiocytów kukurydzy i wizualizacji białek meiotycznych w pojedynczych komórkach. Poza kukurydzą protokół ten można zastosować do badania meiocytów ryżu, żyta, jęczmienia i pszenicy. Na początek należy pozyskać rośliny kukurydzy w stadium V13, gdy kwiatostany wciąż rozwijają się wewnątrz łodygi.W tygodniu utrwalania pręcików w fazie mitozy, delikatnie uciśnij pogrubioną łodygę w miejscu wybrzuszenia, używając rękawiczek, aby sprawdzić, czy jest wystarczająco miękka do nacięcia. Po przygotowaniu wymaganych buforów, przygotuj komorę wilgotnościową, umieszczając od pięciu do 10 zwilżonych ręczników papierowych w plastikowym pudełku. Usuń nadmiar wody z komory.Za pomocą żyletki należy rozciąć łodygę na poziomie kwiatostanu, aby odsłonić gałązki wiechu oraz gałęzie boczne. Po wypreparowaniu i zebraniu gałęzi bocznych, należy owinąć je ręcznikami w komorze wilgotnej, utrzymując w niej temperaturę pokojową. Używając stereomikroskopu, należy zebrać świeże pylniki z kwiatuszków do szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 2 mL 1X buforu A lub BA. Etapy mitozy należy zidentyfikować na podstawie wielkości i koloru.Po przeniesieniu pręcików do nowej szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów, dodaj do nich trzy mililitry roztworu utrwalającego. Uszczelnij szalkę Petriego parafilmem, aby zapobiec odparowywaniu formaldehydu. Umieść szalkę Petriego o średnicy 35 milimetrów na większej szalce Petriego umieszczonej na wytrząsarku rotacyjnym, ustawionym na 40 do 60 RPM w temperaturze pokojowej na 45 minut.Przepłucz pylniki 3 mL 1X BA. Po przeniesieniu pylników do małej szalki Petriego, zamknij szczelnie szalkę i umieść ją na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej na 45 minut, ustawiając prędkość od 40 do 60 RPM. Za pomocą czystej pęsety przenieś pylniki do małej szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 3 mL 1X BA.Po szczelnym zamknięciu szalki Petriego parafilmem, należy umieścić małą szalkę Petriego wewnątrz większej szalki Petriego. Po przykryciu jej folią aluminiową, próbkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Pierwszego dnia należy przygotować 2 mL roztworu akrylamidu, mieszając równe objętości akrylamidu oraz 2 XBA.Odgazuj roztwór akrylamidu w próżni przez 5 do 10 minut przed dodaniem siarczynu sodu i nadtlenosiarczanu amonu. Odmierz 100 µL mieszaniny akrylamidu i 2XBA w stosunku 1:1 do probówek o pojemności 1,5 ml, zgodnie z liczbą przygotowanych szkiełek. Umieść kawałki parafilmu o wymiarach 2 cm na 2 cm na szalce Petriego i ustaw je pod stereomikroskopem.Po przycięciu końcówki pipety nożyczkami, nanieś 50 µL roztworu BA z pręcikami na parafilm. Nanieś 25 µL roztworu BA na inny obszar parafilmu. Przytrzymując pręciki pęsetą, odetnij ich końcówki za pomocą skalpela.Po wyciśnięciu meiocytów należy przenieść je pipetą do 25 µL kropli BA i delikatnie wymieszać. 10 µL mieszaniny meiocytów nanieść pipetą na osobne szkiełko nakrywkę. Szybko dodać 5 µL siarczynu sodu i 5 µL nadtlenosiarczanu amonu do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej akrylamid i 2XBA.Pipetuj 5 µL tej mieszaniny na szkiełko nakrywkowe i wymieszaj ją z meiocytami. Na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe pokryte poli-lizyną pod kątem 45 stopni. Po odczekaniu od 30 do 50 minut w temperaturze pokojowej w celu pełnej polimeryzacji, ostrożnie rozdziel szkiełka nakrywkowe za pomocą żyletki.Następnie umieść je stroną z podkładką do góry w szalce Petriego. Przepłucz szkiełko nakrywkowe 1 mL 1XPBS uzupełnionego o 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) oraz 1% Triton w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Przygotuj i połącz przeciwciała pierwszorzędowe pochodzące od różnych gatunków gospodarzy, aby zapewnić odrębne sygnały podczas detekcji.Nanieś 50 µL rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na środek szkiełka podstawowego z naniesioną płytką. Następnie umieść szalkę Petriego w komorze wilgotnościowej na całą noc. Drugiego dnia przygotuj 500 mL buforu płuczącego zawierającego 1×PBS, 0,1% Tween 20 oraz 1 mM EDTA.Za pomocą pipety usunąć roztwór po inkubacji nocnej. Przepłukać szkiełko okrywkowe dwukrotnie za pomocą 1 ml buforu płuczącego. Po usunięciu buforu ponownie dodać 1 ml buforu płuczącego i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Powtórz ten etap płukania jeszcze siedem razy. Po ostatnim płukaniu przykryj szalkę i pozostaw ją na noc w komorze wilgotnościowej. Przygotuj przeciwciała wtórne, rozcieńczając je w stosunku 1:50 w buforze blokującym.Po usunięciu roztworu piorącego nanieś 50 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na środek każdej płytki. Następnie umieść szalkę Petriego w komorze wilgotnościowej na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po usunięciu roztworu z dołka przemyj cztery razy jedną mililitrem buforu piorącego, po jednej godzinie każdego płukania w temperaturze pokojowej.Przemyj studzienkę 1 mL PBS przez 10 minut i powtórz ten proces jeszcze dwa razy. Do studzienki dodaj 500 µL DAPI, przygotowanego w stężeniu końcowym 1 µg/mL, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wyjęciu przedłużonego złota z temperatury 4 °C, rozmroź je do osiągnięcia temperatury pokojowej.Przemyj preparaty 1 mL PBS przez 30 minut i powtórz tę czynność dwukrotnie. Po usunięciu ostatniej porcji roztworu do płukania, nanieś dwie krople środka Prolong Antifade na środek pola obrazowania. Po podniesieniu szkiełka nakrywki z dołka, zamocuj je na opisanych preparatach.Używając próżni, usuń nadmiar gliceryny z krawędzi szkiełka nakrywki i zabezpiecz je dwiema warstwami laku do paznokci. Obserwuj preparaty pod mikroskopem, stosując odpowiednie długości fal wzbudzenia i filtry w celu wykonania zdjęć. Barwienie DAPI wykazało wyraźne jądro i barwienie chromatyny, wraz z mniej intensywnym natywnym barwieniem cytoplazmatycznym DNA plastydowego i mitochondrialnego.Brak białka Absence of first division one (AFD1), asynaptic one (ASY1) oraz Zipper1 (ZYP1) zlokalizowanych na chromosomach i w cytoplazmie podczas preleptynemy. W późniejszych etapach sygnał skoncentrował się na chromosomach, podczas gdy znaczna ilość ZYP1 pozostała w cytoplazmie przed całkowitą synapsją. Meiotyczna kohezyna AFD1 utworzyła strukturę liniową dopiero po zygonemie.Równocześnie z tworzeniem się liniowych filamentów kompleksu synaptonemalnego sygnał ASY1 stał się stosunkowo słaby po wbudowaniu ZYP1 i AFD1 w struktury liniowe. Niniejszy protokół umożliwia badaczom analizę ko-lokalizacji i dynamiki białek, natywnej lokalizacji subkomórkowej, trójwymiarowej architektury chromosomów, przebiegu mejozy oraz określanie etapów jej rozwoju.Głównym wyzwaniem w tym protokole jest staranny dobór kompatybilnych kombinacji przeciwciał pierwotnych i wtórnych. Dalsze badania mogą opierać się na tej pracy poprzez porównanie mejozy u samców i samic w celu zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw athelchasmi.

three-dimensional-immunolocalization-in-maize-meiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Trójwymiarowe immunolokalizacja w komórkach mejotycznych kukurydzy

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół pokazuje, jak na żywo obrazować i analizować merystemy wierzchołkowe pędów z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

255 Views.  National Autonomous University of Mexico (UNAM). Nasze badania koncentrują się na opracowaniu 3D podejścia do badania męskich mejocytów kukurydzy i wizualizacji białek mejotycznych w pojedynczych komórkach. Oprócz kukurydzy, protokół ten może być stosowany do badania mejocytów w ryżu, życie, jęczmieniu, pszenicy. Na początek, uzyskaj rośliny kukurydzy w fazie V13 z kwiatostanami wciąż rosnącymi wewnątrz łodygi.W tygodniu fiksacji pylników mijotycznych, delikatnie naciśnij powiększoną łodygę na wypukłośc...

Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Przeglądaj więcej filmów