Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Nasze badania koncentrują się na opracowaniu podejścia 3D do badania męskich meiocytów kukurydzy i wizualizacji białek meiotycznych w pojedynczych komórkach. Poza kukurydzą protokół ten można zastosować do badania meiocytów ryżu, żyta, jęczmienia i pszenicy. Na początek należy pozyskać rośliny kukurydzy w stadium V13, gdy kwiatostany wciąż rozwijają się wewnątrz łodygi.

W tygodniu utrwalania pręcików w fazie mitozy, delikatnie uciśnij pogrubioną łodygę w miejscu wybrzuszenia, używając rękawiczek, aby sprawdzić, czy jest wystarczająco miękka do nacięcia. Po przygotowaniu wymaganych buforów, przygotuj komorę wilgotnościową, umieszczając od pięciu do 10 zwilżonych ręczników papierowych w plastikowym pudełku. Usuń nadmiar wody z komory.

Za pomocą żyletki należy rozciąć łodygę na poziomie kwiatostanu, aby odsłonić gałązki wiechu oraz gałęzie boczne. Po wypreparowaniu i zebraniu gałęzi bocznych, należy owinąć je ręcznikami w komorze wilgotnej, utrzymując w niej temperaturę pokojową. Używając stereomikroskopu, należy zebrać świeże pylniki z kwiatuszków do szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 2 mL 1X buforu A lub BA. Etapy mitozy należy zidentyfikować na podstawie wielkości i koloru.

Po przeniesieniu pręcików do nowej szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów, dodaj do nich trzy mililitry roztworu utrwalającego. Uszczelnij szalkę Petriego parafilmem, aby zapobiec odparowywaniu formaldehydu. Umieść szalkę Petriego o średnicy 35 milimetrów na większej szalce Petriego umieszczonej na wytrząsarku rotacyjnym, ustawionym na 40 do 60 RPM w temperaturze pokojowej na 45 minut.

Przepłucz pylniki 3 mL 1X BA. Po przeniesieniu pylników do małej szalki Petriego, zamknij szczelnie szalkę i umieść ją na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej na 45 minut, ustawiając prędkość od 40 do 60 RPM. Za pomocą czystej pęsety przenieś pylniki do małej szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 3 mL 1X BA.

Po szczelnym zamknięciu szalki Petriego parafilmem, należy umieścić małą szalkę Petriego wewnątrz większej szalki Petriego. Po przykryciu jej folią aluminiową, próbkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Pierwszego dnia należy przygotować 2 mL roztworu akrylamidu, mieszając równe objętości akrylamidu oraz 2 XBA.

Odgazuj roztwór akrylamidu w próżni przez 5 do 10 minut przed dodaniem siarczynu sodu i nadtlenosiarczanu amonu. Odmierz 100 µL mieszaniny akrylamidu i 2XBA w stosunku 1:1 do probówek o pojemności 1,5 ml, zgodnie z liczbą przygotowanych szkiełek. Umieść kawałki parafilmu o wymiarach 2 cm na 2 cm na szalce Petriego i ustaw je pod stereomikroskopem.

Po przycięciu końcówki pipety nożyczkami, nanieś 50 µL roztworu BA z pręcikami na parafilm. Nanieś 25 µL roztworu BA na inny obszar parafilmu. Przytrzymując pręciki pęsetą, odetnij ich końcówki za pomocą skalpela.

Po wyciśnięciu meiocytów należy przenieść je pipetą do 25 µL kropli BA i delikatnie wymieszać. 10 µL mieszaniny meiocytów nanieść pipetą na osobne szkiełko nakrywkę. Szybko dodać 5 µL siarczynu sodu i 5 µL nadtlenosiarczanu amonu do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej akrylamid i 2XBA.

Pipetuj 5 µL tej mieszaniny na szkiełko nakrywkowe i wymieszaj ją z meiocytami. Na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe pokryte poli-lizyną pod kątem 45 stopni. Po odczekaniu od 30 do 50 minut w temperaturze pokojowej w celu pełnej polimeryzacji, ostrożnie rozdziel szkiełka nakrywkowe za pomocą żyletki.

Następnie umieść je stroną z podkładką do góry w szalce Petriego. Przepłucz szkiełko nakrywkowe 1 mL 1XPBS uzupełnionego o 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) oraz 1% Triton w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Przygotuj i połącz przeciwciała pierwszorzędowe pochodzące od różnych gatunków gospodarzy, aby zapewnić odrębne sygnały podczas detekcji.

Nanieś 50 µL rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na środek szkiełka podstawowego z naniesioną płytką. Następnie umieść szalkę Petriego w komorze wilgotnościowej na całą noc. Drugiego dnia przygotuj 500 mL buforu płuczącego zawierającego 1×PBS, 0,1% Tween 20 oraz 1 mM EDTA.

Za pomocą pipety usunąć roztwór po inkubacji nocnej. Przepłukać szkiełko okrywkowe dwukrotnie za pomocą 1 ml buforu płuczącego. Po usunięciu buforu ponownie dodać 1 ml buforu płuczącego i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Powtórz ten etap płukania jeszcze siedem razy. Po ostatnim płukaniu przykryj szalkę i pozostaw ją na noc w komorze wilgotnościowej. Przygotuj przeciwciała wtórne, rozcieńczając je w stosunku 1:50 w buforze blokującym.

Po usunięciu roztworu piorącego nanieś 50 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na środek każdej płytki. Następnie umieść szalkę Petriego w komorze wilgotnościowej na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po usunięciu roztworu z dołka przemyj cztery razy jedną mililitrem buforu piorącego, po jednej godzinie każdego płukania w temperaturze pokojowej.

Przemyj studzienkę 1 mL PBS przez 10 minut i powtórz ten proces jeszcze dwa razy. Do studzienki dodaj 500 µL DAPI, przygotowanego w stężeniu końcowym 1 µg/mL, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wyjęciu przedłużonego złota z temperatury 4 °C, rozmroź je do osiągnięcia temperatury pokojowej.

Przemyj preparaty 1 mL PBS przez 30 minut i powtórz tę czynność dwukrotnie. Po usunięciu ostatniej porcji roztworu do płukania, nanieś dwie krople środka Prolong Antifade na środek pola obrazowania. Po podniesieniu szkiełka nakrywki z dołka, zamocuj je na opisanych preparatach.

Używając próżni, usuń nadmiar gliceryny z krawędzi szkiełka nakrywki i zabezpiecz je dwiema warstwami laku do paznokci. Obserwuj preparaty pod mikroskopem, stosując odpowiednie długości fal wzbudzenia i filtry w celu wykonania zdjęć. Barwienie DAPI wykazało wyraźne jądro i barwienie chromatyny, wraz z mniej intensywnym natywnym barwieniem cytoplazmatycznym DNA plastydowego i mitochondrialnego.

Brak białka Absence of first division one (AFD1), asynaptic one (ASY1) oraz Zipper1 (ZYP1) zlokalizowanych na chromosomach i w cytoplazmie podczas preleptynemy. W późniejszych etapach sygnał skoncentrował się na chromosomach, podczas gdy znaczna ilość ZYP1 pozostała w cytoplazmie przed całkowitą synapsją. Meiotyczna kohezyna AFD1 utworzyła strukturę liniową dopiero po zygonemie.

Równocześnie z tworzeniem się liniowych filamentów kompleksu synaptonemalnego sygnał ASY1 stał się stosunkowo słaby po wbudowaniu ZYP1 i AFD1 w struktury liniowe. Niniejszy protokół umożliwia badaczom analizę ko-lokalizacji i dynamiki białek, natywnej lokalizacji subkomórkowej, trójwymiarowej architektury chromosomów, przebiegu mejozy oraz określanie etapów jej rozwoju.

Głównym wyzwaniem w tym protokole jest staranny dobór kompatybilnych kombinacji przeciwciał pierwotnych i wtórnych. Dalsze badania mogą opierać się na tej pracy poprzez porównanie mejozy u samców i samic w celu zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw athelchasmi.