Name: Rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny. Ta technika umożliwia ilościową analizę dynamiki sieci aktynowej i generowania siły.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr. Danielowi Saferowi i Rickowi Wike'owi za doskonałą pomoc techniczną przy oczyszczaniu białek. Dziękujemy dr. Roberto Dominguezowi, w szczególności dr Małgorzacie Boczkowskiej i dr. Grzegorzowi Rebowskiemu, za hojne udostępnienie kompleksu Arp2/3 oraz białek CapZ. Dziękujemy również dr. Lutherowi Pollardowi, dr Faviolli A. Báez-Cruz oraz wszystkim członkom laboratoriów Ostapa i Domingueza za cenny wkład w realizację projektu. Praca ta była wspierana przez grant National Institutes of Health R37 GM057247 (przyznany E.M.O.). E.M.O. i M.X. otrzymali częściowe wsparcie z National Science Foundation (CMMI-1548571). ChatGPT został wykorzystany do pomocy w redakcji językowej podczas rewizji manuskryptu. Autorzy sprawdzili i zredagowali wszystkie treści przygotowane z pomocą AI i biorą pełną odpowiedzialność za ostateczną wersję manuskryptu.

<ol>
	<li>Blanchoin L, Boujemaa-Paterski R, Sykes C, Plastino J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 2014;94(1):235-63.</li>
	<li>Svitkina T. The actin cytoskeleton and actin-based motility. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(1).</li>
	<li>Papalazarou V, Machesky LM. The cell pushes back: The Arp2/3 complex is a key orchestrator of cellular responses to environmental forces. Curr Opin Cell Biol. 2021;68:37-44.</li>
	<li>Krendel M, Gauthier NC. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 2022;77:102112.</li>
	<li>Yang C, et al. Actin polymerization promotes invagination of flat clathrin-coated lattices in mammalian cells by pushing at lattice edges. Nat Commun. 2022;13(1):6127.</li>
	<li>Clarke DN, Martin AC. Actin-based force generation and cell adhesion in tissue morphogenesis. Curr Biol. 2021;31(10):R667-R80.</li>
	<li>McConnell RE, Tyska MJ. Leveraging the membrane-cytoskeleton interface with myosin-1. Trends Cell Biol. 2010;20(7):418-26.</li>
	<li>Almeida CG, et al. Myosin 1b promotes the formation of post-Golgi carriers by regulating actin assembly and membrane remodelling at the trans-Golgi network. Nat Cell Biol. 2011;13(7):779-89.</li>
	<li>McIntosh BB, Ostap EM. Myosin-I molecular motors at a glance. J Cell Sci. 2016;129(14):2689-95.</li>
	<li>Pedersen RTA, Drubin DG. Type I myosins anchor actin assembly to the plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis. J Cell Biol. 2019;218(4):1138-47.</li>
	<li>Barger SR, et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 2019;10(1):1249.</li>
	<li>Manenschijn HE, et al. Type-I myosins promote actin polymerization to drive membrane bending in endocytosis. eLife. 2019;8.</li>
	<li>Smith SL, et al. Class-I myosin responds to changes in membrane tension during clathrin-mediated endocytosis in human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026;123(9):e2532817123.</li>
	<li>Loisel TP, Boujemaa R, Pantaloni D, Carlier MF. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 1999;401(6753):613-6.</li>
	<li>Akin O, Mullins RD. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 2008;133(5):841-51.</li>
	<li>Boujemaa-Paterski R, et al. Directed actin assembly and motility. Methods Enzymol. 2014;540:283-300.</li>
	<li>Sykes C, Plastino J. Reconstitution of actin-based motility with commercially available proteins. J Vis Exp. 2022;(188).</li>
	<li>Xu M, et al. Myosin-I synergizes with Arp2/3 complex to enhance the pushing forces of branched actin networks. Sci Adv. 2024;10(37):eado5788.</li>
	<li>Kawska A, et al. How actin network dynamics control the onset of actin-based motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(36):14440-5.</li>
	<li>Cameron LA, Footer MJ, van Oudenaarden A, Theriot JA. Motility of ActA protein-coated microspheres driven by actin polymerization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(9):4908-13.</li>
	<li>Bernheim-Groswasser A, et al. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 2002;417(6886):308-11.</li>
	<li>van der Gucht J, Paluch E, Plastino J, Sykes C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(22):7847-52.</li>
	<li>Achard V, et al. A &#34;primer&#34;-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Curr Biol. 2010;20(5):423-8.</li>
	<li>Noireaux V, et al. Growing an actin gel on spherical surfaces. Biophys J. 2000;78(3):1643-54.</li>
	<li>Theriot JA, Mitchison TJ, Tilney LG, Portnoy DA. The rate of actin-based motility of intracellular Listeria monocytogenes equals the rate of actin polymerization. Nature. 1992;357(6375):257-60.</li>
	<li>Bieling P, et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. EMBO J. 2018;37(1):102-21.</li>
	<li>Funk J, et al. A barbed end interference mechanism reveals how capping protein promotes nucleation in branched actin networks. Nat Commun. 2021;12(1):5329.</li>
	<li>Gautreau AM, Fregoso FE, Simanov G, Dominguez R. Nucleation, stabilization, and disassembly of branched actin networks. Trends Cell Biol. 2022;32(5):421-32.</li>
	<li>Nakamura F, Osborn E, Janmey PA, Stossel TP. Comparison of filamin A-induced cross-linking and Arp2/3 complex-mediated branching on the mechanics of actin filaments. J Biol Chem. 2002;277(11):9148-54.</li>
	<li>Colin A, et al. Friction patterns guide actin network contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(39):e2300416120.</li>
	<li>Colin A, et al. Recycling of the actin monomer pool limits the lifetime of network turnover. EMBO J. 2023;42(9):e112717.</li>
	<li>Suarez C, et al. Reconstitution of the transition from a lamellipodia- to filopodia-like actin network with purified proteins. Eur J Cell Biol. 2023;102(4):151367.</li>
	<li>Pollard LW, Boczkowska M, Dominguez R, Ostap EM. Myosin-1C differentially displaces tropomyosin isoforms altering their inhibition of motility. J Biol Chem. 2024;300(8):107539.</li>
	<li>Thompson CP, et al. Non-muscle tropomyosins inhibit myosin-19 and dynamically localize to mitochondrially associated actin filaments. J Biol Chem. 2026;302(5):111377.</li>
	<li>Bussonnier M, et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophys J. 2014;107(4):854-62.</li>
	<li>Paluch E, van der Gucht J, Joanny JF, Sykes C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophys J. 2006;91(8):3113-22.</li>
	<li>Lewis JH, Lin T, Hokanson DE, Ostap EM. Temperature dependence of nucleotide association and kinetic characterization of Myo1b. Biochemistry. 2006;45(38):11589-97.</li>
	<li>Baez-Cruz FA, Ostap EM. Drosophila class-I myosins that can impact left-right asymmetry have distinct ATPase kinetics. J Biol Chem. 2023;299(8):104961.</li>
	<li>Lin T, Tang N, Ostap EM. Biochemical and motile properties of Myo1b splice isoforms. J Biol Chem. 2005;280(50):41562-7.</li>
	<li>Lebreton G, et al. Molecular to organismal chirality is induced by the conserved myosin 1D. Science. 2018;362(6417):949-52.</li>
	<li>Spudich JA, Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J Biol Chem. 1971;246(15):4866-71.</li>
	<li>Boczkowska M, et al. X-ray scattering study of activated Arp2/3 complex with bound actin-WCA. Structure. 2008;16(5):695-704.</li>
	<li>Rao JN, Madasu Y, Dominguez R. Mechanism of actin filament pointed-end capping by tropomodulin. Science. 2014;345(6195):463-7.</li>
	<li>Putkey JA, Slaughter GR, Means AR. Bacterial expression and characterization of proteins derived from the chicken calmodulin cDNA and a calmodulin processed gene. J Biol Chem. 1985;260(8):4704-12.</li>
	<li>Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676-82.</li>
	<li>Greenberg MJ, Ostap EM. Regulation and control of myosin-I by the motor and light chain-binding domains. Trends Cell Biol. 2013;23(2):81-9.</li>
	<li>Lewis JH, et al. Calcium regulation of myosin-I tension sensing. Biophys J. 2012;102(12):2799-807.</li>
	<li>Manceva S, et al. Calcium regulation of calmodulin binding to and dissociation from the Myo1c regulatory domain. Biochemistry. 2007;46(42):11718-26.</li>
	<li>Mullins RD, Bieling P, Fletcher DA. From solution to surface to filament: actin flux into branched networks. Biophys Rev. 2018;10(6):1537-51.</li>
	<li>Mooren OL, et al. Reconstitution of Arp2/3-nucleated actin assembly with proteins CP, V-1, and CARMIL. Curr Biol. 2024;34(22):5173-86.e4.</li>
	<li>Pollard LW, et al. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Mol Biol Cell. 2020;31(5):335-47.</li>
	<li>Marcy Y, Prost J, Carlier MF, Sykes C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(16):5992-7.</li>
	<li>Dayel MJ, et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biol. 2009;7(9):e1000201.</li>
	<li>Hammer JA 3rd, Sellers JR. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;13(1):13-26.</li>
	<li>Buss F, Kendrick-Jones J. How are the cellular functions of myosin VI regulated within the cell. Biochem Biophys Res Commun. 2008;369(1):165-75.</li>
	<li>Spudich JA, Sivaramakrishnan S. Myosin VI: an innovative motor that challenged the swinging lever arm hypothesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(2):128-37.</li>
	<li>Self T, et al. Shaker-1 mutations reveal roles for myosin VIIA in both development and function of cochlear hair cells. Development. 1998;125(4):557-66.</li>
	<li>Crawley SW, et al. Intestinal brush border assembly driven by protocadherin-based intermicrovillar adhesion. Cell. 2014;157(2):433-46.</li>
	<li>Houdusse A, Titus MA. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 2021;31(10):R586-R602.</li>
	<li>Bohil AB, Robertson BW, Cheney RE. Myosin-X is a molecular motor that functions in filopodia formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(33):12411-6.</li>
	<li>Fitz GN, et al. Protrusion growth driven by myosin-generated force. Dev Cell. 2023;58(1):18-33.</li>
	<li>Quintero OA, et al. Human Myo19 is a novel myosin that associates with mitochondria. Curr Biol. 2009;19(23):2008-13.</li>
	<li>Zimmet A, et al. Cryo-EM structure of NPF-bound human Arp2/3 complex and activation mechanism. Sci Adv. 2020;6(23):eaaz7651.</li>
	<li>Giardini PA, Fletcher DA, Theriot JA. Compression forces generated by actin comet tails on lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(11):6493-8.</li>
	<li>Upadhyaya A, Chabot JR, Andreeva A, Samadani A, van Oudenaarden A. Probing polymerization forces by using actin-propelled lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(8):4521-6.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów.

Test ruchliwości koralików z ogonem kometowym z aktyny jest dobrze ugruntowanym systemem rekonstrukcji in vitro do badania rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez kompleks Arp2/3 oraz jego roli w generowaniu sił protruzywnych14,15,16,17. System ten był szeroko stosowany do analizy biochemicznej regulacji rozgałęzionego montażu aktyny14,15,26,27,31,49,50,51 oraz generowania sił20,21,22,23,52, stanowiąc jednocześnie podstawę dla ilościowych badań nad wyłaniającymi się właściwościami aktywnej materii sieci aktynowych19,35,36,53. Poprzez włączenie miozyny, w szczególności miozyny-I18, do tego zrekonstruowanego systemu, zmodyfikowany test umożliwia badanie, w jaki sposób sprzężenie miozyna–aktyna moduluje montaż aktyny i produkcję siły na styku z błoną, co jest obszarem pozostającym stosunkowo mało zbadanym. Co istotne, miozynę-I w tym systemie można łatwo zastąpić innymi motorami miozynowymi, aby zbadać ich poszczególne role w przebudowie sieci aktynowej i generowaniu sił. Na przykład można włączyć miozynę V (transport ładunku)54, miozynę VI (transport endocytyczny i dynamika błon)55,56, miozynę VII i XV (organizacja stereociliów i mikrokosmków)57,58,59, miozynę X (tworzenie filopodiów)60,61 oraz miozynę XIX (dynamika mitochondrialna)62, aby zbadać, w jaki sposób różne klasy miozyn przyczyniają się do organizacji aktyny i powiązanych z nimi procesów fizjologicznych.
Analiza jest wysoce powtarzalna pod warunkiem starannego kontrolowania kilku krytycznych parametrów. Po pierwsze, wysokiej jakości monomericzna G-aktyna jest niezbędna do prawidłowego tworzenia się ogonów komet. Zalecamy oczyszczanie G-aktyny z proszku acetonowego mięśni szkieletowych królika przy użyciu ustalonych protokołów41. Po 2–3 dniach dializy monomeryczną aktynę należy dodatkowo oczyścić za pomocą filtracji żelowej na Sephacryl S-300 w buforze G (2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM ATP; 0.1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; oraz 0.5 mM DTT). Należy wykorzystać frakcje zebrane bezpośrednio po piku elucji. Oczyszczona G-aktyna zazwyczaj zachowuje silną aktywność polimeryzacyjną przez 2–3 tygodnie podczas przechowywania w lodzie w 4°C i może pozostać użyteczna do czwartego tygodnia, choć następnie jej wydajność zazwyczaj spada. Zmniejszona stabilność ogonów komet, charakteryzująca się rzadkimi, kruchymi sieciami aktynowymi i niespójnym wzrostem ogona, często wskazuje na obniżoną jakość aktyny. Po drugie, aktywność NPF ma krytyczne znaczenie dla formowania się ogonów komet. Komercyjna domena WCA z ludzkiego neuronalnego białka zespołu Wiskotta-Aldricha (N-WASP) z tagiem GST (GST-VCA) zapewnia silną i trwałą aktywność nukleacyjną, a dimeryzacja GST dodatkowo wzmacnia tę aktywność63. Zalecamy walidację każdego konstruktu NPF za pomocą testu polimeryzacji pirena-aktyny przed powlekaniem kulek. Aktywność komercyjnego GST-VCA może służyć jako standard referencyjny. Warto zauważyć, że zastosowane tutaj komercyjne GST-VCA nie posiada regionu poliprolinowego, a zatem nie oddziałuje z kompleksami profiliny-aktyny26. Po trzecie, niezawodna wizualizacja wzrostu ogonów komet wymaga starannego przygotowania szkiełek i lamellek. Zalecamy dokładne oczyszczenie szkiełek i lamellek wodą i etanolem, a następnie czyszczenie plazmowe bezpośrednio przed użyciem. Jeśli są dostępne, preferowane są lamelki silanizowane glikolem polietylenowym26, ponieważ minimalizują one niespecyficzną adsorpcję białek i poprawiają powtarzalność. Dodanie odpowiedniego stężenia BSA do mieszaniny ruchowej może dodatkowo zredukować niespecyficzne oddziaływania powierzchniowe i zapewnić spójne wyniki analizy. Po czwarte, objętość próbki naniesionej do komory jest krytyczna dla wiarygodnych pomiarów15,16,17. Nadmierna objętość próbki prowadzi do dryfu kulek, co uniemożliwia dokładne śledzenie wydłużania się ogona komety. Z kolei niewystarczająca objętość próbki powoduje ściskanie kulek między szkiełkiem a lamelką, co zwiększa tarcie i unieruchamia kulki. To ograniczenie mechaniczne może zniekształcić morfologię ogona komety i zmienić mierzoną kinetykę wzrostu. Dlatego optymalizacja zarówno wysokości komory, jak i objętości próbki jest niezbędna dla uzyskania powtarzalnych wyników. Zalecamy empiryczną optymalizację objętości próbki dla każdego układu eksperymentalnego. Przy zastosowaniu lamelki o wymiarach 22 mm × 22 mm, zgodnie z opisem, naniesienie 2.1–2.3 µL mieszaniny ruchowej tworzy komorę o wysokości około 4.3 µm, co zapewnia stabilne rozmieszczenie kulek o średnicy 2.0 µm bez nadmiernego dryfu lub kompresji.&#160;W przypadku użycia lamelki o innym rozmiarze objętość próbki należy odpowiednio dostosować, aby uzyskać równomierne wypełnienie komory, stabilne rozmieszczenie kulek i minimalny dryf próbki.
Jeśli ogony komet nie powstają, należy zweryfikować zdolność do polimeryzacji aktyny oraz aktywność NPF. W przypadku braku złamania symetrii należy dostosować stężenie CP w celu modulacji gęstości sieci. Nadmiernie gęste sieci stawiają opór pękaniu, natomiast sieci zbyt rzadkie nie posiadają integralności strukturalnej. Jeśli koraliki pokryte miozyną nie wykazują różnic w stosunku do koralików kontrolnych, należy potwierdzić gęstość miozyny na powierzchni oraz aktywność motorów. W ramach kontroli jakości kryterium akceptacji ma charakter funkcjonalny, a nie opiera się na bezwzględnej wartości liczbowej. Nową preparację uznaje się za akceptowalną, jeśli&#160;odtwarza ona formowanie i wzrost ogonów komet zaobserwowany w przypadku wcześniej zwalidowanej preparacji (jak pokazano na &#160;Rysunku 3). Ponadto każda nowa preparacja miozyny, kompleksu Arp2/3, NPF, CapZ lub aktyny powinna zostać oceniona za pomocą odpowiednich testów kontroli jakości i porównana z wcześniej zwalidowaną preparacją przed użyciem, aby zapewnić spójność między eksperymentami ilościowymi (patrz Sekcja 3.1 Protokołu).
Przy interpretacji wyników należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń tego testu. Po pierwsze, intensywność fluorescencji jest wykorzystywana jako relatywny, niekalibrowany wskaźnik gęstości sieci aktynowej; w związku z tym porównania należy przeprowadzać wyłącznie między próbkami obrazowanymi przy identycznych ustawieniach akwizycji i analizowanymi przy użyciu tego samego schematu progowania. Po drugie, ruchliwość kuleczek, wzrost ogona komety oraz wydajność wzrostu stanowią pośrednie odczyty zachowania sieci generującej siłę, ale nie są bezpośrednimi pomiarami tej siły. Do ilościowego określenia sił wytwarzanych przez sieć wymagane są bezpośrednie pomiary mechaniczne, takie jak pułapkowanie optyczne lub testy deformacji błony z kalibracją siły64,65. Po trzecie, test ten nie pozwala na bezpośrednią analizę ultrastruktury sieci aktynowej, np. orientacji filamentów, gęstości rozgałęzień czy lokalnej organizacji miozyny.&#160;Do charakterystyki struktury w skali nanometrycznej&#160;może być wymagane zastosowanie metod komplementarnych, takich jak mikroskopia elektronowa lub obrazowanie o superrozdzielczości. Wreszcie, zastosowanie sztywnych kuleczek o rozmiarach mikrometrycznych zapewnia uproszczony i łatwy do badania eksperymentalnie interfejs, ale nie oddaje odkształcalności, heterogeniczności krzywizny, mobilności lipidów ani złożoności molekularnej błon komórkowych. Przyszły rozwój interfejsów bardziej istotnych fizjologicznie będzie zatem ważny dla zbadania, w jaki sposób komponenty cytoszkieletu koordynują się na przednim brzegu komórki.
Podsumowując, to podejście do rekonstytucji zapewnia precyzyjną kontrolę nad składem i stężeniem białek, co pozwala na mechanistyczną analizę poszczególnych komponentów w sposób trudny do osiągnięcia w systemach komórkowych. Stanowi ono wszechstronną platformę do badania, w jaki sposób motory molekularne przebudowują rozgałęzione sieci aktynowe i kształtują generowanie siły na interfejsach przypominających błony. Po odpowiedniej walidacji test ten można rozszerzyć o badanie tego, jak różne klasy miozyn, mutanty lub warianty motorów związane z chorobami oraz białka wiążące aktynę wrażliwe na siłę regulują sprzężenie zwrotne mechaniczne w dynamicznych sieciach aktynowych. W szerszym ujęciu system ten pomaga powiązać aktywność motorów w skali molekularnej z organizacją cytoszkieletu i funkcją mechaniczną w skali mezoskopowej, co ma znaczenie dla motylowości komórek, endocytozy oraz przebudowy błon.

Rozgałęziona polimeryzacja aktyny mediowana przez kompleks białek związanych z aktyną 2/3 (Arp2/3) generuje główne siły protruzywne napędzające różnorodne procesy komórkowe, w tym motywność komórek, endocytozę, fagocytozę oraz formowanie kompleksów adhezyjnych komórek1,2,3,4,5,6. Na krawędzi natarcia migrujących komórek czynniki promujące nukleację (NPFs) aktywują kompleks Arp2/3 w błonie plazmatycznej, inicjując montaż dendrytycznej sieci aktynowej, która wypycha błonę do przodu. Motory miozyna-I często kolokalizują z tymi rozgałęzionymi sieciami aktynowymi na interfejsach błonowych i są zaangażowane w regulację&#160;organizacji aktyny&#160;oraz modulowanie generowania siły7,8,9,10,11,12,13. Pomimo narastających dowodów na to, że miozyna-I przyczynia się do zależnych od aktyny procesów mechanicznych, molekularne mechanizmy, poprzez które miozyna-I oddziałuje z mediowanym przez Arp2/3 montażem rozgałęzionej aktyny w celu modulowania architektury sieci i efektu mechanicznego, pozostają słabo poznane.
Aby wypełnić tę lukę, włączyliśmy miozynę-I do dobrze opracowanego systemu ruchliwości kuleczek z ogonami komet z aktyny14,15,16,17, aby zrekonstruować oddziaływania między miozyną-I, aktyną a kompleksem Arp2/3 na powierzchni kuleczek o rozmiarach mikrometrycznych. Ogólnym celem tej metody jest ilościowe zbadanie, w jaki sposób sprzężenie miozyna-aktyna wpływa na montaż rozgałęzionej aktyny, architekturę sieci, łamanie symetrii oraz ruchliwość kuleczek na interfejsie przypominającym błonę. W tym teście miozyna-I oraz NPF są wspólnie powlekane na mikroskalowych kuleczkach, aby naśladować ich kolokalizację w błonie plazmatycznej18. Po zainicjowaniu polimeryzacji, związane z powierzchnią NPF stymulują zależny od Arp2/3 montaż rozgałęzionej aktyny, co prowadzi do powstania powłoki aktynowej, łamania symetrii i rozwoju spolaryzowanego ogona komety&#160;, który napędza ruch kuleczki14,19,20,21,22,23. Poprzez systematyczną zmianę gęstości powierzchniowej miozyny18 oraz modulowanie gęstości sieci aktynowej za pomocą stężenia białka capping (CP)15,19,24, metoda ta umożliwia ilościową analizę kinetyki montażu aktyny, wydajności wzrostu, architektury sieci i ruchliwości kuleczek, dostarczając pośrednich odczytów związanych z zależnymi od miozyny-I zmianami w wyjściu mechanicznym.
Test ten oferuje również wyraźne zalety w porównaniu z podejściami komplementarnymi. W przeciwieństwie do testów polimeryzacji masowej, takich jak testy z pyrenem-aktyną, ten system ruchliwości kulek umożliwia bezpośrednią wizualizację montażu rozgałęzionej aktyny oraz ruchu kulek napędzanego polimeryzacją aktyny. W przeciwieństwie do badań komórkowych, w których nakładające się funkcje białek i złożone środowisko komórkowe mogą zacierać indywidualne wkłady i komplikować interpretację, test ten zapewnia precyzyjną kontrolę nad składem białek, ich stężeniem oraz organizacją powierzchni, umożliwiając tym samym systematyczne badanie interakcji miozyny-I z montażem aktyny pośredniczonym przez Arp2/3 w określonych warunkach biochemicznych.
Metoda ta jest najbardziej odpowiednia do badania sposobu, w jaki komponenty cytoszkieletu koordynują się na interfejsie przypominającym błonę&#160;, aby regulować architekturę sieci aktynowej i wynik mechaniczny. Chociaż obecny protokół jest zoptymalizowany pod kątem rozgałęzionego montażu aktyny zapośredniczonego przez miozynę I, jego modułowa konstrukcja może zostać w przyszłości dostosowana do badania innych klas miozyn związanych z błoną (np. miozyny VI, VII, X, XV i XIX) i/lub białek wiążących aktynę (np. formin, fosfoproteiny stymulowanej przez rozszerzacze naczyń (VASP), kortaktyny, koroniny lub tropomiozyny). Takie adaptacje wymagałyby walidacji unieruchomienia białek, ich aktywności oraz gęstości powierzchniowej. Dodatkowo, test ten jest podatny na strategie znakowania typu pulse-chase. Wprowadzenie aktyny fotokonwertowalnej lub fotoaktywowalnej, bądź znakowanych podjednostek Arp2/3, mogłoby umożliwić pomiar obrotu filamentów i szybkości dysocjacji rozgałęzień wewnątrz rosnącej sieci25. Ogólnie rzecz biorąc, test ten stanowi wszechstronną platformę do badania molekularnych oddziaływań między motorami związanymi z błoną, filamentami aktynowymi a białkami wiążącymi aktynę, a także do badania, w jaki sposób motory i białka wiążące aktynę regulują przebudowę sieci i generowanie siły na interfejsach przypominających błonę14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. W szerszym kontekście służy on również jako minimalna, regulowana platforma materii aktywnej do badania zasad fizycznych leżących u podstaw dynamiki nierównowagowej napędzanej przez motory, takich jak łamanie symetrii, samoorganizacja, sprzężenie zwrotne mechanochemiczne i inne zachowania emergentne w aktywnych sieciach akto-miozynowych18,19,20,21,22,23,35,36, co może mieć znaczenie dla fizyki materii aktywnej i inżynierii materiałowej.

<table><tbody><tr><td>Hydrat soli sodowej trifosforanu adenozyny 5&amp;prime;</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>Stosowany do przygotowywania buforów zawierających ATP; rozdzielić na aliquoty i przechowywać w &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Kompleks Arp2/3</td><td>Przygotowany wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>Stosowany do nukleacji rozgałęzionych sieci aktynowych; oczyszczony zgodnie z Ref. 42.</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny barwnik Biotin-CF640</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Stosowany do fluorescencyjnego znakowania kulek kontrolnych; chronić przed światłem i przechowywać w &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Biotynilowana miozyna Myo1d</td><td>Przygotowana wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>Białko motoryczne stosowane do pokrywania kulek miozyną; przygotowane zgodnie z opisem w Refs. 18 i 38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>Seryjowa albumina wołowa (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Stosowana do blokowania kulek oraz do buforów do przechowywania kulek; przygotować przefiltrowany roztwór stokowy.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Składnik buforu stosowany w buforze X oraz w eksperymentach z zaburzaniem wiązań wapniowych.</td></tr><tr><td>Kalmodulina</td><td>Przygotowana wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>Dodawana do reakcji zawierających miozynę oraz do buforu do przechowywania kulek; oczyszczona zgodnie z Ref. 44.</td></tr><tr><td>Karboksylowane kulki polistyrenowe (średnica 2,0 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>Stosowane jako nośnik stały dla NPF, NeutrAvidyny, barwnika fluorescencyjnego i powłoki z miozyny; przechowywać w 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Stosowana do akwizycji obrazów fluorescencyjnych podczas mikroskopii time-lapse.</td></tr><tr><td>Barwnik Coomassie Brilliant Blue</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Stosowany do barwienia żeli SDS-PAGE przed analizą densytometryczną.</td></tr><tr><td>Kryszalki, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1.5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>Stosowane z szkiełkami przedmiotowymi do montażu komór ścisłych (squeeze chambers).</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Środek redukujący stosowany w buforach i mieszaninach do badań motywności; przechowywać w &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sucha pompa próżniowa spiralna</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Stosowana do obsługi systemu czyszczenia plazmowego.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Chelator wapnia stosowany w buforze M, buforze do motywności oraz podczas wstępnej obróbki aktyny.</td></tr><tr><td>Zewnętrzne źródło światła</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Metalohalogenowe źródło światła do mikroskopii fluorescencyjnej.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Open source</td><td>N/A</td><td>Stosowany do analizy długości ogonów komet, intensywności fluorescencji i gęstości sieci (wersja 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny stosowany do obrazowania aktynowych ogonów komet.</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>Składnik roztworu do odbarwiania żeli SDS-PAGE; substancja żrąca, obchodzić się z należytą ostrożnością.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>Czynnik promujący nukleację stosowany do montażu aktyny pośredniczonego przez Arp2/3; rozdzielić na aliquoty i przechowywać w &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Odczynnik buforujący stosowany w buforze X, buforze M i buforze do motywności.</td></tr><tr><td>Ludzkie białko CapZ</td><td>Przygotowane wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>Białko zamykające stosowane do regulacji gęstości sieci aktynowej; oczyszczone zgodnie z Ref. 43.</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Składnik buforu stosowany w buforach reakcyjnych oraz podczas wstępnej obróbki aktyny.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Stosowane do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazów (wersja 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>Składnik roztworu do odbarwiania żeli SDS-PAGE; substancja łatwopalna, obchodzić się zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa.</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Dodawana do buforu do motywności w celu zwiększenia lepkości roztworu (1500 cP).</td></tr><tr><td>Szkiełka przedmiotowe</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Stosowane do montażu komór ścisłych do mikroskopii.</td></tr><tr><td>Białko NeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Stosowane do unieruchamiania biotynilowanych białek na powierzchni kulek; rozdzielić na aliquoty i przechowywać w &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>Marker masy cząsteczkowej stosowany do analizy SDS-PAGE; przechowywać w &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Urządzenie do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Stosowane do czyszczenia plazmowego szkiełek przedmiotowych i kryszalek przed montażem komory.</td></tr><tr><td>Strzykawkowy filtr z polietersulfonu, 0,22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Stosowany do filtrowania roztworu stokowego seryjnej albuminy wołowej przed rozdzieleniem na aliquoty.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Sól stosowana w celu utrzymania siły jonowej w buforach do analiz.</td></tr><tr><td>Aktyna z mięśnia szkieletowego królika</td><td>Przygotowana wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>Oczyszczona zgodnie z Ref. 41 i stosowana jako G-aktyna w testach montażu aktynowych ogonów komet.</td></tr><tr><td>Chłodzona mikrocentryfuga</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Stosowana do wirowania kulek podczas etapów przygotowania i przemywania kulek.</td></tr><tr><td>Rotacyjny mieszadło do probówek (rotator laboratoryjny)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Stosowane podczas inkubacji z pokrywaniem kulek w celu utrzymania zawiesiny kulek.</td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy Tris/Glicyna/SDS (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>Rozcieńczyć do 1&amp;times; przed elektroforezą SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>Stosowany do uszczelniania komór ścisłych przed obrazowaniem fluorescencyjnym.</td></tr><tr><td>Gradientowy żel SDS-poliakryloamidowy 4%&amp;ndash;20%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Stosowany do analizy SDS-PAGE białek związanych z kulkami; przechowywać w 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę i w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

Polimeryzacja rozgałęzionej aktyny pośredniczona przez kompleks białek związanych z aktyną 2/3 (Arp2/3) dostarcza głównych sił pchających dla szeregu procesów komórkowych, w tym migracji komórek, endocytozy i fagocytozy. Wykazano również, że motory miozyny-I, które często kolokalizują z rozgałęzionymi sieciami aktynowymi na krawędzi prowadzącej komórki, uczestniczą w tych procesach i prawdopodobnie regulują organizację sieci aktynowej oraz efekt mechaniczny. Jednakże molekularne mechanizmy, za pomocą których miozyna-I oddziałuje z kompleksem Arp2/3 w celu modulowania montażu rozgałęzionej aktyny i generowania siły, pozostają w dużej mierze nieznane. W niniejszej pracy opisujemy wysoce regulowalny test ruchliwości koralików z „ogonami komet” aktynowych in vitro, który odtwarza współzależność między miozyną-I, aktyną a kompleksem Arp2/3 na krawędzi prowadzącej komórki na powierzchni koralików o rozmiarach mikronowych. Metoda ta została zaadaptowana z dobrze ugruntowanych testów ogonów komet aktynowych poprzez współunieruchomienie miozyny-I wraz z czynnikami promującymi nukleację (NPFs) na powierzchniach koralików, co tworzy interfejs montażu aktyny przypominający błonę komórkową. Test ten umożliwia wizualizację i ilościową analizę montażu sieci aktynowej, gęstości sieci, ruchliwości koralików oraz efektywności wzrostu. Zapewnia on również pośrednie, jakościowe odczyty wzmocnienia siły pośredniczonego przez miozynę-I w rozgałęzionych sieciach aktynowych. Protokół ten obejmuje funkcjonalizację koralików, przygotowanie reakcji, obrazowanie fluorescencyjne, ilościową analizę obrazów oraz strategie rozwiązywania problemów, zapewniając powtarzalną platformę do badania regulowanego przez miozynę-I montażu aktyny na interfejsach przypominających błony.

Analiza ruchliwości kulek z ogonami aktynowymi (actin comet-tail bead motility assay) została wykorzystana do zbadania wpływu aktywności miozyny-I na zależną od kompleksu Arp2/3 polimeryzację rozgałęzionej aktyny na czołowym brzegu komórki, co odzwierciedla scenariusze, w których związana z błoną miozyna-I koordynuje polimeryzację aktyny w celu napędzania wypustek błonowych7,8,9,10,11,12,13. Aby naśladować kolokalizację miozyny-I i NPF na granicy błona–aktyna, oba białka naniesiono jednocześnie na powierzchnię kulek mikrometrycznych, odtwarzając tym samym ich bliskość przestrzenną w kontrolowanym systemie in vitro (Rycina 1A,B).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny mediowanego przez miozynę-I na koralikach w skali mikro. (A) Schemat przedstawiający oddziaływania między miozyną-I, czynnikami promującymi nukleację (NPFs), kompleksem białka 2/3 związanego z aktyną (Arp2/3), białkiem zamykającym (CP) oraz aktyną globularną (G-actin) na czołowym brzegu komórki. (B) Schemat funkcjonalizacji koralików. Koraliki kontrolne i koraliki pokryte miozyną zostały pokryte NPF i neutrawidyną. Neutrawidynę sprzęgnięto albo z biotynilowanym dalekoczerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w przypadku koralików kontrolnych, albo z biotynilowaną Myo1d z Drosophila w przypadku koralików pokrytych miozyną. (C) Reprezentatywna seria czasowa pokazująca wzrost ogona kometowego aktyny od momentu przełamania symetrii do utworzenia spolaryzowanego ogona kometowego dla koralika kontrolnego i koralika pokrytego miozyną. Ostatni panel przedstawia oba koraliki w tym samym polu widzenia. Pasek skali, 5 µm. Panele B i C zostały powielone/zmodyfikowane z Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, za zgodą autora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby lepiej ocenić specyficzny wkład miozyny-I w montaż aktyny, przygotowano również odpowiadający jej koralik kontrolny. Koraliki kontrolne były identyczne z koralikami powleczonymi miozyną, z wyjątkiem tego, że miozynę-I zastąpiono biotynilowanym dalekoczerwonym barwnikiem fluorescencyjnym sprzężonym z neutrawidyną (Rysunek 1B). Mieszanie obu typów koralików w jednej komorze reakcyjnej i obrazowanie ich w tym samym polu widzenia umożliwiło bezpośrednie porównanie montażu rozgałęzionej aktyny w obecności i przy braku miozyny-I w identycznych warunkach eksperymentalnych (Rysunek 1C). Ponadto, poprzez zmianę stosunku miozyny do NPF na powierzchni koralika, można było systematycznie badać wpływ miozyny-I przy różnych gęstościach powierzchniowych (Rysunek 2A,B). Dodatkowo gęstość sieci aktynowej można było regulować poprzez dostosowanie stężenia CP, tworząc sieci o strukturze od gęsto upakowanych i odpornych na łamanie symetrii, po luźno zorganizowane i podatne na pękanie15,19,24. Takie podejście pozwoliło zbadać, w jaki sposób miozyna-I wpływa na montaż rozgałęzionej aktyny w sieciach o różnej gęstości i integralności strukturalnej (Rysunek 2A,B).
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
Rycina 2. Morfologia ogonów komet aktynowych&#160;w zależności od gęstości powierzchniowej miozyny i stężeń białka zamykającego. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne kulek o średnicy 2 µm pokrytych różnymi gęstościami powierzchniowymi miozyny i zestawionych w reakcjach zawierających 30–200 nM białka zamykającego (CP), 4 µM aktyny z 5% aktyny znakowanej rodamyną oraz 200 nM kompleksu Arp2/3&#160;. Dla każdego warunku kuleczki kontrolne i kuleczki pokryte miozyną obrazowano w tym samym polu widzenia. Gęstości powierzchniowe miozyny i czynnika promującego nukleację (NPF) określono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu, zgodnie z opisem w kroku 2.3. Obrazy pozyskano 20–35 min po rozpoczęciu reakcji. Jasność i kontrast dostosowano liniowo i identycznie w obrębie każdej pary kuleczek kontrolnych i pokrytych miozyną, ale skalowano je niezależnie pomiędzy różnymi warunkami w celu lepszej wizualizacji. Pasek skali, 5 µm. (B) Jakościowa mapa testu podsumowująca wyniki formowania ogonów komet w zależności od stężeń CP i gęstości powierzchniowej miozyny. Każdy punkt danych reprezentuje dopasowaną parę kuleczek kontrolna–miozyna w wskazanym warunku. Symbole wskazują zaobserwowane wyniki, w tym kuleczki pokryte miozyną promujące przełamanie symetrii, dłuższe ogony, podobne ogony, krótsze ogony, brak formowania ogonów komet lub struktury przypominające aster. Dane zebrano z ponad 20 niezależnych eksperymentów, analizując ponad 10 par kuleczek dla każdego warunku. Rycina ta została powielona/zmodyfikowana z Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, za zgodą autora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Po zmieszaniu komponentów testu, związane z powierzchnią NPF stymulowały zależną od kompleksu Arp2/3 polimeryzację rozgałęzionej aktyny wokół powierzchni kuleczki. W typowej, prawidłowej reakcji aktyna pojawiała się najpierw jako rzadka otoczka wokół kuleczki. W miarę postępu polimeryzacji otoczka powiększała się, a sieć stawała się gęściej splątana. Dalsza polimeryzacja aktyny na powierzchni kuleczki napędzała wzrost sieci na zewnątrz, co mogło prowadzić do przełamania symetrii i utworzenia spolaryzowanego ogona kometowego. Po uformowaniu się ogona kometowego, ciągła nukleacja i polimeryzacja aktyny na powierzchni kuleczki podtrzymywały jej stały ruch (Rycyna 1C). Te następujące po sobie etapy – tworzenie otoczki aktynowej, przełamanie symetrii, wydłużanie ogona kometowego i napęd kuleczki – służyły jako wizualne wskaźniki prawidłowego przebiegu testu.
Jak wykazano w naszym pierwotnym badaniu18 i zilustrowano na Rysunku 2A,B, morfologia ogona komety była wrażliwa zarówno na stężenie CP, jak i gęstość powierzchniową miozyny. W standardowych warunkach testowych (200 nM kompleksu Arp2/3, 50 nM CP, stosunek miozyny do NPF = 0,43:1) koraliki pokryte miozyną zazwyczaj tworzyły rzadsze lub bardziej rozproszone aktynowe ogony komet niż koraliki kontrolne (Rysunek 2A). Przy niskich stężeniach CP (&lt;30 nM) aktyna składała się w gęste, odporne na pękanie otoczki. W tych warunkach koraliki kontrolne często pozostawały zamknięte w otoczce i nie ulegały zaburzeniu symetrii, podczas gdy koraliki pokryte miozyną częściej wykazywały tendencję do zaburzenia symetrii i ucieczki z otaczającej otoczki aktynowej (Rysunek 2A,B). Przy wysokich stężeniach CP (&gt;200 nM) kohezja sieci była zmniejszona, a obecność miozyny dodatkowo destabilizowała sieć aktynową, sprzyjała odrzucaniu aktyny i zapobiegała tworzeniu stabilnych ogonów komet (Rysunek 2A,B). Te zależne od warunków wyniki stanowią przydatne punkty odniesienia, które badacze mogą wykorzystać do zidentyfikowania odpowiednich reżimów testowych i rozwiązywania problemów z wydajnością testu.
Wpływ miozyny-I na morfologię „ogonów komet” aktyny można ocenić poprzez pomiar średniej intensywności fluorescencji ogona komety. Obszar ogona komety zdefiniowano za pomocą progu intensywności, zgodnie z opisem w kroku 4.2, a następnie zmierzono średnią intensywność fluorescencji w tym obszarze (Rysunek 3A). W tych samych warunkach obrazowania, w których kule kontrolne i kule pokryte miozyną obrazowano w tym samym polu widzenia, wartość ta służyła jako względny, niekalibrowany wskaźnik gęstości sieci aktynowej, gdzie niższa średnia intensywność oznaczała rzadszą sieć. W standardowych warunkach testowych kule pokryte miozyną zazwyczaj generowały ogony komet o niższej średniej intensywności fluorescencji niż kule kontrolne, co jest zgodne z obniżoną pozorną gęstością sieci (Rysunek 3C).
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
Rycina 3. Schemat kwantyfikacji kinetyki wzrostu ogonów komet aktynowych i wydajności montażu. (A) Reprezentatywna seria czasowa wzrostu ogona komety z koralika kontrolnego oraz koralika pokrytego miozyną w stosunku 0,43:1 w obecności 50 nM białka capping protein (CP). Czarne obrysy wskazują obszary zainteresowania (ROI) ogona komety, zidentyfikowane za pomocą oprogramowania Fiji w celu pomiaru intensywności fluorescencji. Warunki reakcji: 4 µM aktyny z 5% aktyny znakowanej rodaminą, 200 nM kompleksu białka Arp2/3 (actin-related protein 2/3) oraz 50 nM CP. Pasek skali, 5 µm. (B) Długość ogona komety przedstawiona jako funkcja czasu dla reprezentatywnej pary koralików kontrolny–miozynowy pokazanej na panelu (A). Wstawka pokazuje okno czasowe wykorzystane do dopasowania liniowego; szybkości wzrostu ogona wyznaczono z nachyleń dopasowanych linii. (C) Znormalizowana całkowita intensywność fluorescencji ogona komety przedstawiona jako funkcja czasu dla reprezentatywnej pary koralików kontrolny–miozynowy pokazanej na panelu (A). Koraliki kontrolne i pokryte miozyną znormalizowano do średniej intensywności fluorescencji koralików kontrolnych między 1100 a 1300 s. Wstawka pokazuje okno czasowe wykorzystane do dopasowania liniowego, a szybkości montażu fluorescencji obliczono z nachyleń dopasowanych linii. (D) Tabela podsumowująca szybkość wzrostu ogona, szybkość montażu fluorescencji oraz wydajność wzrostu dla reprezentatywnej pary koralików kontrolny–miozynowy pokazanej na panelu (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wpływ miozyny-I na kinetykę wzrostu ogona komety można określić ilościowo, mierząc zarówno wydłużanie się ogona komety, jak i akumulację fluorescencji aktyny w czasie. W większości eksperymentów ogony komet rosły z w przybliżeniu stałą prędkością przez pierwsze ~10 min po przełamaniu symetrii. Wraz z wyczerpywaniem się komponentów polimeryzacji, wydłużanie stopniowo zwalniało i zazwyczaj ustawało około 30 min po zainicjowaniu reakcji. Aby określić ilościowo kinetykę wzrostu, długość ogona komety oraz całkowitą intensywność fluorescencji przedstawiono jako funkcje czasu (Rysunek 3B,C). Pierwsze 7–10 punktów danych, odpowiadających początkowej fazie liniowej, dopasowano za pomocą regresji liniowej (Rysunek 3B,C, wstawki). Nachylenia tych dopasowań reprezentowały odpowiednio początkową szybkość wzrostu ogona oraz szybkość montażu fluorescencyjnej aktyny. Efektywność wzrostu zdefiniowano jako szybkość wzrostu ogona komety podzieloną przez szybkość montażu fluorescencyjnej aktyny, co pozwala określić, jak efektywnie polimeryzacja aktyny była przekształcana w produktywne przemieszczanie koralika (Rysunek 3D). W reprezentatywnym przykładzie przedstawionym na Rysunku 3A–D, koralik pokryty miozyną wykazał szybkość wzrostu ogona wynoszącą 0.60 µm/min (0.010 µm/s), w porównaniu do 0.57 µm/min (0.0095 µm/s) dla koralika kontrolnego (Rysunek 3B,D). Odpowiadające im efektywności wzrostu wynosiły odpowiednio 5.6 i 4.5 µm/jednostkę intensywności, co oznacza wartość około 1.2-krotnie wyższą dla koralika pokrytego miozyną (Rysunek 3D). W standardowych warunkach koraliki pokryte miozyną zazwyczaj wykazywały szybkości wzrostu porównywalne z koralikami kontrolnymi (miozyna: 0.69 ± 0.10 µm/min; kontrola: 0.66 ± 0.20 µm/min), wraz z niższą szybkością montażu fluorescencyjnej aktyny (około 0.76-krotność kontroli) i około 1.4-krotnie wyższą efektywnością wzrostu, jak zgłoszono wcześniej w naszym pierwotnym badaniu18. Wartości te są podane jako średnia ± SD z 11 par koralików na warunek, uzyskanych w pięciu niezależnych eksperymentach. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą obustronnego sparowanego testu t, zgodnie z opisem w pierwotnym badaniu18.
Aby ocenić wkład skoku mocy miozyny i wykluczyć możliwość, że obserwowane efekty wynikały z zawady sterycznej spowodowanej zajętością powierzchni przez miozynę, test ruchliwości kuleczek można przeprowadzić w warunkach zaburzających aktywność skoku mocy miozyny-I. W niniejszym protokole aktywność motoryczną miozyny-I zahamowano poprzez dodanie 1,1 mM Ca2+ do mieszaniny reakcyjnej. Podwyższony poziom Ca2+ promował dysocjację kalmoduliny z ramienia dźwigni miozyny-I, co zmniejszyło sztywność ramienia dźwigni i upośledziło jego zdolność do generowania siły46,47,48. W tych warunkach miozyna-I pozostawała dynamicznie związana z aktyną, ale nie wspierała poślizgu aktyny (Rycyna 4A,B), stanowiąc użyteczną kontrolę do oceny efektów zależnych od aktywności motorycznej18.
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
Rycina 4. Kontrola oparta na wapniu do oceny aktywności motorowej Myo1d w teście ruchliwości kuleczek. (A) Obrazy skumulowane w czasie przedstawiające filamenty aktynowe poruszające się po powierzchni pokrytej Myo1d w przypadku braku podwyższonego stężenia wapnia lub tworzące nieproduktywne wzory wirowe w obecności 100 µM wolnego wapnia. Tęczowy pasek kolorów wskazuje upływ czasu w ciągu 61 klatek zarejestrowanych w odstępach 5 s. Pasek skali, 5 µm. (B) Kwantyfikacja prędkości ślizgania aktyny w obecności i przy braku 100 µM wolnego wapnia (N = 2 niezależne eksperymenty; n = 25 filamentów). W tych warunkach w obecności 100 µM wolnego wapnia nie zaobserwowano produktywnego ślizgania aktyny. Słupki błędu reprezentują SD. (C) Reprezentatywne pary kuleczek kontrolnych i pokrytych miozyną, zmontowane w obecności lub przy braku 100 µM wolnego wapnia. Dla każdego warunku pokazano pięć reprezentatywnych par kuleczek. W każdej parze kuleczka kontrolna i kuleczka pokryta miozyną zostały zobrazowane w tym samym polu widzenia. Obrazy zarejestrowano około 15–20 min po rozpoczęciu reakcji. Jasność i kontrast zostały dostosowane liniowo i identycznie w obrębie każdej pary kuleczek kontrolnych i z miozyną, ale skalowano je niezależnie pomiędzy warunkami. Warunki reakcji: 4 µM aktyny z 5% aktyny znakowanej rodaminą, 200 nM kompleksu białka 2/3 związanego z aktyną (Arp2/3) oraz 50 nM białka cappingowego (CP). Paski skali, 5 µm. Panele A i B zostały powtórzone/zmodyfikowane z Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, za zgodą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
W przypadku prawidłowego wykonania testu, koraliki pokryte miozyną badane w warunkach podwyższonego stężenia Ca2+ generowały krótsze ogony komet aktynowych o gęstości sieci porównywalnej z gęstością koralików kontrolnych (Rysunek 4C). Przedstawiono pięć reprezentatywnych par koralików kontrolnych i pokrytych miozyną z dwóch niezależnych eksperymentów. Ten jakościowy wynik był konsekwentnie obserwowany w powtórzonych przygotowaniach testowych i jest wspierany przez analizę ilościową opisaną w oryginalnym badaniu18. Oczekiwany rezultat ten wskazuje, że różnice w sieci obserwowane w warunkach standardowych zależą od aktywnego skurczu miozyny (power stroke), a nie tylko od stopnia zajętości powierzchni przez miozynę. Zatem warunki podwyższonego stężenia Ca2+ służą jako kluczowa kontrola do oceny, czy zmiany w organizacji rozgałęzionej sieci aktynowej wynikają z aktywności motorowej miozyny.

Niniejszy protokół opisuje regulowalny test ruchomości koralików z ogonami z aktyny w celu ilościowego zbadania, w jaki sposób aktywność motorów miozynowych wpływa na montaż rozgałęzionej aktyny oraz architekturę sieci na interfejsie przypominającym błonę.

Rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny

Polimeryzacja rozgałęzionej aktyny, pośredniczona przez kompleks białek związanych z aktyną 2/3 (Arp2/3), generuje główne siły pchające dla wielu procesów komórkowych...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

reconstituting-myosin-i-mediated-branched-actin-assembly-bead-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test odwróconej ruchliwości: technika in vitro do wizualizacji ruchu miozyny na unieruchomionych włóknach aktyny

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Poznaj metodę rekonstytucji rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny. Ta technika umożliwia ilościową analizę dynamiki sieci aktynowej i generowania siły.

Rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny (Wideo) | JoVE Journal

Rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny

Przeglądaj więcej filmów