Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni
5 czerwca 2026
Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.
Nasze badania dotyczą genów i mechanizmów, które umożliwiają długotrwałą regenerację korzeni po stresie osmotycznym w celu wzmocnienia roślin przed suszą. Chociaż protokół ten został opracowany dla korzeni arabidopsis, można go zastosować do systemów z liniami markerów białek fluorescencyjnych. Uzyskaj płyty hodowlane zawierające sadzonki Arabidopsis thaliana przygotowane do obrazowania.
Napisz 60 mikrolitrów czystej wody na szklanej ślizgówce. Ułóż trzy sześciodniowe korzenie A.thaliana na wodzie. Umieść pokrywkę nr 1,5 o wymiarach 22x22 milimetrów nad korzeniami, nie zasłaniając liści.
W ustawieniach mikroskopu konfokalnego ustaw czas ekspozycji lasera na 1000 milisekund. W ustawieniach łącznika lasera ustaw laser 488 nanometrów na 50% dla obrazowania zielonego białka fluorescencyjnego, lub GFP. Ustaw laser 561 nanometrów na 50% dla obrazowania czerwonego białka fluorescencyjnego, lub RFP.
Zdrój próbkę za pomocą obiektywu 20x bez zoomu optycznego. Ustaw rozmiar kroków warstwy Z na 0,3 mikrometrów. Ustaw przerwy między obrazami na jedną minutę, a całkowity czas obrazowania na 10 minut.
Zlokalizuj korzenie i wybierz do 20 warstw Z. Zdrój obrazy 16-bitowe. Uruchom akwizycję time lapse i zapisz time lapse jako plik TIFF z kompresją bezstratną.
Przenieś nabyte dane na komputer w celu analizy. Otwórz oprogramowanie ImageJ lub Fiji. Kliknij i przeciągnij plik VSI na główne okno aplikacji ImageJ lub Fiji.
W oknie opcji importu Bio Formats kliknij OK w prawym dolnym rogu. Następnie w oknie opcji serii Bio Formats upewnij się, że wybrana jest seria 1. Kliknij OK w lewym dolnym rogu.
Po załadowaniu obrazu podziel sygnały, wybierając Obraz. Wybierz Kolor i wybierz Opcję Rozdzielenie kanałów. Wyświetl oddzielne okna wygenerowane dla jąder oznaczonych GFP i chromatinu oznaczonego RFP.
Określ, które z dwóch okien obrazu odpowiada chromatinowi. Po kliknięciu okna obrazu chromatinu zastosuj operację Z Project, wybierając Obraz, wybierając Stosy, a następnie klikając Z Project z głównego okna ImageJ. Zmień Typ projekcji na Max Intensywność.
Upewnij się, że aktywne są Wszystkie Klatki Czasu i kliknij OK, aby wygenerować projekcję. Otwórz menu kontrastu, naciskając Control Shift C lub wybierając Obraz i wybierając Koryguj, a następnie klikając Jasność lub Kontrast z głównego okna ImageJ. Przesuń pasek Minimalny w lewo, aż chromatin będzie wyraźnie widoczny.
Przejdź do wtyczek. Kliknij strzałkę w dół w menu Wtyczki, aby przewinąć do opcji Tracking. Wybierz Tracking i kliknij TrackMate.
Potwierdź, że ustawienia kalibracji są dokładne i kliknij Dalej. Wybierz Detektor progowania i kliknij Dalej. Przejdź do ostatniej klatki time lapse na oknie obrazu.
Kliknij Auto obok Progu Intensywności i kliknij Podgląd. Dostosuj Próg Intensywności i kliknij Podgląd. Powtarzaj proces dostosowywania i podglądu, aż wszystkie chromatiny będą uwzględnione z minimalnym hałasem, a następnie kliknij Dalej.
Pozwól, aby początkowe wykrywanie progowe zostało zakończone i kliknij Dalej. Ręcznie dostosuj próg, aż zostanie tylko chromatin, a następnie kliknij Dalej. Dostosuj wyświetlanie obrazu fluorescencyjnego i kliknij Dalej.
Wybierz Tracker Simple LAP i kliknij Dalej. Ustaw Max Dystans Łączenia na 5 mikrometrów, Max Dystans Zamknięcia Przerwy na 15 mikrometrów, Max Przerwa Klatek Zamknięcia Przerwy na 1 i kliknij Dalej. Pozwól, aby tracking został zakończony.
Obserwuj ścieżki wyświetlane w oryginalnym oknie obrazu i kliknij Dalej. Naciśnij zielony przycisk plus w lewym dolnym rogu, aby utworzyć filtr. Wybierz liczbę plamek w trybie ścieżki.
Dostosuj suwak progu. Upewnij się, że tryb filtra jest ustawiony na Powyżej, a następnie kliknij Dalej. Kliknij przycisk Ścieżki u dołu strony Opcje Wyświetlania.
Wybierz Eksport do CSV. Zignoruj wbudowaną stronę wykresu i kliknij Dalej. Przejrzyj wyniki analizy TrackMate.
Kliknij Przechwyć Nakładkę, a następnie wybierz Wykonaj. Zapisz wideo, wybierając Plik i klikając Zapisz jako, a następnie wybierając GIF. Komórki korzeni traktowanych solą wyglądały na zestresowane, a centromerne ogniska były większe niż w warunkach kontrolnych.
Prędkość chromatinu była znacznie wyższa w warunkach kontrolnych niż w warunkach traktowanych 100-milimolarowym chlorkiem sodu. Ten protokół umożliwia śledzenie i ilościowe określenie ruchu białek oznaczonych fluorescencyjnie w korzeniach arabidopsis. Największym wyzwaniem w tym protokole jest uzyskanie obrazów wysokiej jakości, ponieważ blaknięcie zdjęć i dryf próbki mogą utrudniać śledzenie.
Przyszłe badania powinny zbadać mechanizmy leżące u podstaw zmniejszonego ruchu chromatinu zaobserwowanego w naszym badaniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Jądro komórkowe w komórkach eukariotycznych wykazuje dynamiczne zmiany kształtu, które ulegają zaburzeniom w warunkach stresu, takich jak nowotwory u zwierząt czy stres abiotyczny u roślin. W niniejszym badaniu opracowano procedurę obrazowania żywych komórek w korzeniach Arabidopsis thaliana z wykorzystaniem podwójnych markerów fluorescencyjnych dla otoczki jądrowej i chromatyny w celu ilościowego określenia dynamiki jądra i chromatyny w warunkach kontrolnych oraz pod wpływem stresu solnego. Mikroskopia konfokalna w połączeniu z oprogramowaniem Fiji/ImageJ oraz TrackMate umożliwiła analizę ilościową, która wykazała zmniejszenie ruchliwości chromatyny w warunkach stresu solnego. Metoda ta stanowi niezawodne podejście do badania wpływu stresorów abiotycznych na architekturę jądra i dynamikę chromatyny w komórkach roślinnych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki roślinnej
- Dynamika jądra komórkowego
- Mobilność chromatyny
- Odpowiedź na stres abiotyczny
Wstęp
- Kształt jądra w żywych komórkach jest dynamiczny, a nie statyczny, jak przedstawiano to tradycyjnie.
- Zmieniona morfologia jądra wiąże się z nowotworami w komórkach zwierzęcych oraz ze stresem środowiskowym u roślin.
- Otoczka jądrowa oddziałuje z chromatyną, wpływając na ekspresję genów.
- Istnieje ograniczona wiedza na temat tego, jak stres abiotyczny wpływa na kształt, ruch i dynamikę chromatyny w jądrach komórkowych roślin.
Cel badania
- Opracowanie procedury do ilościowego pomiaru dynamiki jądra komórkowego i chromatyny w żywych komórkach roślinnych.
- Zastosowanie tej metody do oceny zmian pod wpływem stresu abiotycznego, a konkretnie stresu solnego.
- Walidacja podejścia poprzez pomiar ruchu chromatyny w warunkach kontrolnych i stresowych.
- Umożliwienie przyszłych analiz odpowiedzi jądra i chromatyny na stresory środowiskowe w korzeniach Arabidopsis.
Zastosowane metody
- Obrazowanie żywych komórek korzeni Arabidopsis thaliana z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
- Zastosowanie linii markerowej z podwójnym znakowaniem fluorescencyjnym (białko otoczki jądrowej i chromatyna).
- Akwizycja obrazów w warunkach kontrolnych oraz w warunkach stresu solnego.
- Analiza dynamiki jądra i chromatyny przy użyciu programu Fiji/ImageJ z wtyczką TrackMate.
- Śledzenie cząstek w celu ilościowego określenia prędkości i ruchu chromatyny.
Główne wyniki
- Ruch chromatyny był znacznie ograniczony w korzeniach poddanych stresowi solnemu w porównaniu z grupą kontrolną.
- System podwójnego znakowania umożliwił jednoczesną wizualizację koperty jądrowej oraz chromatyny.
- Oprogramowanie TrackMate pozwoliło na precyzyjne śledzenie cząstek i kwantyfikację dynamiki.
- Metoda ta skutecznie uchwyciła ilościowe zmiany zachowania jądra i chromatyny w czasie rzeczywistym.
Wnioski
- Opracowany schemat analizy umożliwia ilościowe obrazowanie na żywo kształtu jądra oraz dynamiki chromatyny w korzeniach roślin.
- Stres solny prowadzi do zmniejszenia ruchliwości chromatyny, co wskazuje na zmienioną dynamikę jądrową w warunkach stresu abiotycznego.
- Podejście to można zastosować do badania reakcji jądra na różne stresory środowiskowe.
- Metoda ta stanowi podstawę do powiązania architektury jądra z regulacją genów i adaptacją roślin do stresu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe obrazowanie żywych komórek w celu analizy kształtu jądra oraz dynamiki chromatyny w korzeniach Arabidopsis stanowi solidną platformę do szczegółowego badania reakcji komórkowych na stres środowiskowy z wysoką rozdzielczością. Podejście to umożliwia wiarygodne przewidywanie powiązań między zmianami w architekturze jądra a regulacją genów, co wspiera wczesne odkrycia i redukcję ryzyka mechanistycznego w procesach biotechnologii roślin. Ilościowe wyniki tej metody ułatwiają podejmowanie decyzji w oparciu o analizę ryzyka w zakresie rozwoju cech oraz badań nad adaptacją do stresu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę zachowania jądra komórkowego i chromatyny w określonych warunkach stresowych.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez ilościowe określanie dynamicznych odpowiedzi jądrowych na bodźce abiotyczne.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów związanych z otoczką jądrową i chromatyną.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia ustandaryzowane, ilościowe testy obrazowania dynamiki jądra komórkowego i chromatyny.
- Umożliwia powtarzalny pomiar zmian wywołanych stresem w żywych komórkach roślinnych.
- Wspiera skalowalne przesiewanie genetycznych lub chemicznych modulatorów wpływających na architekturę jądra.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie dynamiki jądra komórkowego i chromatyny z fenotypami adaptacji do stresu w systemach modelowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację cech odporności na stres.
- Wspiera predykcyjne ograniczanie ryzyka w badaniach translacyjnych nad ulepszaniem roślin uprawnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten schemat obrazowania i analizy integruje procesy od wczesnego etapu odkryć, poprzez screening, aż po badania translacyjne w biotechnologii roślin.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie dynamiki jądra i chromatyny w celu wyjaśnienia szlaków odpowiedzi na stres.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnienie śledzenia cząstek i wyników statystycznych dla rzetelnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Powiązanie zmian w architekturze jądra z adaptacją do stresu, co wspiera walidację cech.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie powtarzalnego przepływu pracy w obrazowaniu i analizie, możliwego do dostosowania do różnych modeli roślin i czynników stresogennych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów jądrowych i chromatynowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie żywych komórek i analizę ilościową w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) przy opracowywaniu cech adaptacji do stresu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację interwencji genetycznych lub chemicznych z uwzględnieniem ryzyka.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej i obrazowania żywych komórek.
- Wymaga dostępu do linii z podwójnymi markerami fluorescencyjnymi oraz oprogramowania do analizy obrazu (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Wymaga standaryzacji protokołów obrazowania i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda może zostać zaadaptowana do innych gatunków roślin po opracowaniu odpowiednich markerów.
- Ograniczona dostępnością kompatybilnych markerów fluorescencyjnych dla badanych systemów.
