Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni
5 czerwca 2026
Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.
Nasze badania dotyczą genów i mechanizmów, które umożliwiają długotrwałą regenerację korzeni po stresie osmotycznym w celu wzmocnienia roślin przed suszą. Chociaż protokół ten został opracowany dla korzeni arabidopsis, można go zastosować do systemów z liniami markerów białek fluorescencyjnych. Uzyskaj płyty hodowlane zawierające sadzonki Arabidopsis thaliana przygotowane do obrazowania.
Napisz 60 mikrolitrów czystej wody na szklanej ślizgówce. Ułóż trzy sześciodniowe korzenie A.thaliana na wodzie. Umieść pokrywkę nr 1,5 o wymiarach 22x22 milimetrów nad korzeniami, nie zasłaniając liści.
W ustawieniach mikroskopu konfokalnego ustaw czas ekspozycji lasera na 1000 milisekund. W ustawieniach łącznika lasera ustaw laser 488 nanometrów na 50% dla obrazowania zielonego białka fluorescencyjnego, lub GFP. Ustaw laser 561 nanometrów na 50% dla obrazowania czerwonego białka fluorescencyjnego, lub RFP.
Zdrój próbkę za pomocą obiektywu 20x bez zoomu optycznego. Ustaw rozmiar kroków warstwy Z na 0,3 mikrometrów. Ustaw przerwy między obrazami na jedną minutę, a całkowity czas obrazowania na 10 minut.
Zlokalizuj korzenie i wybierz do 20 warstw Z. Zdrój obrazy 16-bitowe. Uruchom akwizycję time lapse i zapisz time lapse jako plik TIFF z kompresją bezstratną.
Przenieś nabyte dane na komputer w celu analizy. Otwórz oprogramowanie ImageJ lub Fiji. Kliknij i przeciągnij plik VSI na główne okno aplikacji ImageJ lub Fiji.
W oknie opcji importu Bio Formats kliknij OK w prawym dolnym rogu. Następnie w oknie opcji serii Bio Formats upewnij się, że wybrana jest seria 1. Kliknij OK w lewym dolnym rogu.
Po załadowaniu obrazu podziel sygnały, wybierając Obraz. Wybierz Kolor i wybierz Opcję Rozdzielenie kanałów. Wyświetl oddzielne okna wygenerowane dla jąder oznaczonych GFP i chromatinu oznaczonego RFP.
Określ, które z dwóch okien obrazu odpowiada chromatinowi. Po kliknięciu okna obrazu chromatinu zastosuj operację Z Project, wybierając Obraz, wybierając Stosy, a następnie klikając Z Project z głównego okna ImageJ. Zmień Typ projekcji na Max Intensywność.
Upewnij się, że aktywne są Wszystkie Klatki Czasu i kliknij OK, aby wygenerować projekcję. Otwórz menu kontrastu, naciskając Control Shift C lub wybierając Obraz i wybierając Koryguj, a następnie klikając Jasność lub Kontrast z głównego okna ImageJ. Przesuń pasek Minimalny w lewo, aż chromatin będzie wyraźnie widoczny.
Przejdź do wtyczek. Kliknij strzałkę w dół w menu Wtyczki, aby przewinąć do opcji Tracking. Wybierz Tracking i kliknij TrackMate.
Potwierdź, że ustawienia kalibracji są dokładne i kliknij Dalej. Wybierz Detektor progowania i kliknij Dalej. Przejdź do ostatniej klatki time lapse na oknie obrazu.
Kliknij Auto obok Progu Intensywności i kliknij Podgląd. Dostosuj Próg Intensywności i kliknij Podgląd. Powtarzaj proces dostosowywania i podglądu, aż wszystkie chromatiny będą uwzględnione z minimalnym hałasem, a następnie kliknij Dalej.
Pozwól, aby początkowe wykrywanie progowe zostało zakończone i kliknij Dalej. Ręcznie dostosuj próg, aż zostanie tylko chromatin, a następnie kliknij Dalej. Dostosuj wyświetlanie obrazu fluorescencyjnego i kliknij Dalej.
Wybierz Tracker Simple LAP i kliknij Dalej. Ustaw Max Dystans Łączenia na 5 mikrometrów, Max Dystans Zamknięcia Przerwy na 15 mikrometrów, Max Przerwa Klatek Zamknięcia Przerwy na 1 i kliknij Dalej. Pozwól, aby tracking został zakończony.
Obserwuj ścieżki wyświetlane w oryginalnym oknie obrazu i kliknij Dalej. Naciśnij zielony przycisk plus w lewym dolnym rogu, aby utworzyć filtr. Wybierz liczbę plamek w trybie ścieżki.
Dostosuj suwak progu. Upewnij się, że tryb filtra jest ustawiony na Powyżej, a następnie kliknij Dalej. Kliknij przycisk Ścieżki u dołu strony Opcje Wyświetlania.
Wybierz Eksport do CSV. Zignoruj wbudowaną stronę wykresu i kliknij Dalej. Przejrzyj wyniki analizy TrackMate.
Kliknij Przechwyć Nakładkę, a następnie wybierz Wykonaj. Zapisz wideo, wybierając Plik i klikając Zapisz jako, a następnie wybierając GIF. Komórki korzeni traktowanych solą wyglądały na zestresowane, a centromerne ogniska były większe niż w warunkach kontrolnych.
Prędkość chromatinu była znacznie wyższa w warunkach kontrolnych niż w warunkach traktowanych 100-milimolarowym chlorkiem sodu. Ten protokół umożliwia śledzenie i ilościowe określenie ruchu białek oznaczonych fluorescencyjnie w korzeniach arabidopsis. Największym wyzwaniem w tym protokole jest uzyskanie obrazów wysokiej jakości, ponieważ blaknięcie zdjęć i dryf próbki mogą utrudniać śledzenie.
Przyszłe badania powinny zbadać mechanizmy leżące u podstaw zmniejszonego ruchu chromatinu zaobserwowanego w naszym badaniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
