Charakterystyka funkcjonalna poszczególnych partnerów przed- i postsynaptycznych W Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym za pomocą CaMPARI
June 16th, 2026
Ten protokół ocenia działalność synaptyczną pomiędzy określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych sensorycznych neuronów cIVda za pomocą CsChrimson indukuje zależną od wapnia fotokonwersję CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.
Nasze badania koncentrują się na ocenie funkcjonalnego połączenia synaptycznego między określonymi węzłami neuronowymi u żywych i sekcjonowanych larw Drosophila. Konwencjonalne metody wymagają sekcji lub fizycznej stymulacji. Ten protokół wykorzystuje optogenetykę u nietkniętych larw, zmniejszając efekty uboczne.
Aby rozpocząć, roztapiaj agar z mąki kukurydzianej w mikrofali przez 8-10 sekund bez gotowania i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej bez stwardnienia. Przed całkowitym ostygnięciem dodaj all-trans-retinal, lub ATR, w stężeniu 0,5 milimolara, aby uzupełnić medium dla much wymagających aktywacji csChrimson. Przykryj słoiki całkowicie folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
Skrzyżuj samica dziewicę posiadającą geny CaMPARI i csChrimson z samcem posiadającym geny GAL4 i LexA w plastikowych słoikach zawierających przygotowane medium. Przygotuj równoległe słoiki bez ATR jako kontrolę. Inkubuje słoiki w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż larwy osiągną trzeci etap linienia.
Użyj pędzelka, aby zebrać larwę trzeciego etapu. Płucz larwę w trzech komorach mikroplatek zawierających 0,1 molowe PBS, aby usunąć wszelkie pokarmowe zanieczyszczenia. Umieść niewielką ilość plasteliny na każdym rogu czystej 18 x 18 milimetrowej pokrywki.
Umieść larwę w kropli PBS na pokrywce i pozwól jej ustąpić brzuszną stroną w dół. Umieść czysty slajd mikroskopowy nad pokrywką zawierającą larwę. Zabezpiecz pokrywkę, stosując plastelinę na rogach, używając tylko tyle ciśnienia, aby unieruchomić larwę bez jej zmiażdżenia lub rozbicia szkła.
Umieść slajd zawierający larwę na scenie mikroskopii konfokalnej wyposażonej w obiektyw 40x/1.2. W interfejsie oprogramowania mikroskopu kliknij Live. Następnie, pod panelem Z Stack, kliknij Set First, a potem Set Last, a następnie Stop, aby uzyskać podstawowy Z Stack neuronów postsynaptycznych, ekspresujących CaMPARI.
Pod menu Kanały, ustaw zielony kanał 488 nanometrów z mocą lasera 0,8%. Następnie ustaw czerwony kanał 561 nanometrów na 0,8% mocy lasera. Pod menu Z Stack, ustaw wartość Interval na 1 mikrometr.
W menu Nabywanie, wybierz Presets, aby ustawić rozdzielczość 256 x 256 pikseli. Wartość Line Averaging wynoszącą 2, dwukierunkowe skanowanie i szybkość skanowania 9, pozwalając na automatyczną aktualizację czasu pikseli. Przeprowadź wszystkie obrazowanie w ciemnym otoczeniu, zachowując identyczne parametry nabywania przez cały eksperyment.
Ustaw światło fotokonwersji 405 nanometrów na 0,5% mocy lasera. I światło stymulacji optogenetycznej 561 nanometrów na 0,8% mocy lasera. Kliknij Live, a następnie wybierz Best Fit pod panelem histogramu.
Pozwól obu laserom jednocześnie stymulować larwę przez 30 sekund, a następnie zatrzymaj stymulację. Podczas akwizycji ZStack po stymulacji przy użyciu tych samych parametrów, co w podstawie, obserwuj czerwoną fluorescencje CaMPARI w neuronach stymulowanych laserem larw karmionych ATR z minimalną fotokonwersją i kontrolami. W oprogramowaniu Fiji ImageJ, kliknij na Plik, a następnie wybierz Otwórz.
W oknie opcji importu BioFormats z ustawieniami domyślnymi, kliknij OK, aby otworzyć nabyte zdjęcie ZStack. Pod menu Obraz, wybierz Kolor, a następnie Rozdziel Kanały, aby zobaczyć czerwony i zielony kanał nabytego obrazu. Do subtrakcji tła, kliknij na Przetwarzanie, a następnie wybierz Odejmij Tło.
W wyskakującym oknie, ustaw promień kuli toczącej się na 50 pikseli, a następnie kliknij OK i wybierz Tak w oknie Przetwarzanie Stosu. Następnie, pod menu Analizy, wybierz Narzędzia, a następnie wybierz Menedżer ROI, aby otworzyć okno ROI. Użyj narzędzia do wyznaczania wolnym ręką, aby zarysować regiony zainteresowania wokół poszczególnych komórek.
W oknie ROI, wybierz Dodaj, aby zapisać wybrany zarys. Następnie kliknij Miarę, aby wygenerować wyniki dotyczące powierzchni, średniej, odchylenia standardowego i zintegrowanej gęstości. Powtórz proces dla wielu komórek tej samej larwy w obu kanałach zielonym i czerwonym osobno.
Po wyeksportowaniu wyników do arkusza kalkulacyjnego, zmierzyć stosunek czerwonego do zielonego lub R przez G stosunku zintegrowanych gęstości dla każdej komórki i przeciętne te wartości, aby obliczyć średni stosunek R przez G na larwy dla obrazów przed i po stymulacji. Na koniec, oblicz zmianę fluorescencji lub delta R przez G, odejmując stosunek R przez G przed stymulacją od stosunku R przez G po stymulacji, aby sprecyzować aktywność wapnia postsynaptycznego. Badania połączeń funkcjonalnych między czwartą klasą neuronów arboryzacyjnych dendrytycznych lub cIVda neuronów i interneuronów z basenu-4 w larwach trzeciego etapu pokazały, że interneurony z basenu-4 wykazywały zieloną fluorescencje z powodu cytozolowej ekspresji CaMPARI przed fotokonwersją i stymulacją światłem optogenetycznym.
Żadnej czerwonej fluorescencji nie wykryto w warunkach bazowych, co potwierdza brak fotokonwersji przed stymulacją. Jednoczesne narażenie na światło fotokonwersji i
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.