Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI
16 czerwca 2026
Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.
Nasze badania koncentrują się na ocenie funkcjonalnej łączności synaptycznej między określonymi parami węzłów nerwowych u żywych i sekcjach larw Drosophila. Konwencjonalne metody wymagają sekcjonowania lub fizycznej stymulacji. Ten protokół wykorzystuje optogenetykę na niesektoryzowanych larwach, zmniejszając tym samym artefakty.
Aby rozpocząć, stopić agarowe medium kukurydziane w mikrofalówce przez 8-10 sekund bez gotowania i pozwolić mu ostygnąć w temperaturze pokojowej bez stwardnienia. Przed całkowitym ostygnięciem, dodaj all-trans-retinal, lub ATR, do stężenia 0,5 milimolarnego, aby uzupełnić medium dla much, które wymagają aktywacji csChrimson. Przykryj pojemniki całkowicie folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
Skrzyżuj samica dziewicę noszącą geny CaMPARI i csChrimson z samcem noszącym geny GAL4 i LexA driver w plastikowych pojemnikach zawierających przygotowane medium. Przygotuj równoległe pojemniki bez ATR jako kontrole. Inkubatoruj pojemniki w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż larwy osiągną trzeci stadium.
Użyj pędzelka, aby zebrać larwy trzeciego stadium. Przepłucz larwę w trzykomorowym płytce mikro spot zawierającej 0,1 molarny PBS, aby usunąć wszelkie skupiska jedzenia. Umieść małą ilość glinki modelarskiej w każdym rogu czystego pokrycia 18 x 18 milimetrów.
Umieść larwę na kropli PBS na pokryciu i pozwól jej ustąpić brzuszną stroną w dół. Umieść czysty slajd mikroskopowy nad pokryciem zawierającym larwę. Zabezpiecz pokrycie, stosując glinkę modelarską do narożników, stosując tylko wystarczającą presję, aby unieruchomić larwę bez jej zmiażdżenia lub złamania szkła.
Umieść slajd zawierający larwę na stole mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę obiektywu 40x/1.2. W interfejsie oprogramowania mikroskopu kliknij Live. Następnie pod panelem Z Stack kliknij Set First, a następnie Set Last, a następnie Stop, aby uzyskać podstawowe Z Stack postsynaptycznych neuronów, ekspresujących CaMPARI.
Pod menu Kanał, ustaw zielony kanał 488 nanometrów z mocą lasera 0,8%. Następnie ustaw czerwony kanał 561 nanometrów na 0,8% mocy lasera. Pod menu Z Stack, ustaw wartość Interval na 1 mikrometr.
W menu Nabycie, wybierz Presets, aby ustawić rozdzielczość 256 x 256 pikseli. Wartość Averaging linii 2, dwukierunkowe skanowanie i szybkość skanowania 9, umożliwiając automatyczną aktualizację czasu pikseli. Przeprowadź wszystkie zdjęcia w ciemnym środowisku, utrzymując identyczne parametry nabycia przez cały eksperyment.
Ustaw światło fotokonwersji 405 nanometrów na 0,5% mocy lasera. I światło stymulacji optogenetycznej 561 nanometrów na 0,8% mocy lasera. Kliknij Live, a następnie wybierz Best Fit pod panelem Histogram.
Pozwól, aby oba lasery jednocześnie stymulowały larwę przez 30 sekund, a następnie zatrzymaj stymulację. Podczas akwizycji ZStack po stymulacji za pomocą tych samych parametrów, jak w bazie, obserwuj czerwoną fluorescencje CaMPARI w neuronach stymulowanych laserem larw karmionych ATR z minimalną fotokonwersją i kontrolami. W oprogramowaniu Fiji ImageJ kliknij File, a następnie wybierz Open.
W oknie opcji importu BioFormats z ustawieniami domyślnymi kliknij OK, aby otworzyć nabyte zdjęcie ZStack. Pod menu Obraz, wybierz Color, a następnie Split Channels, aby zobaczyć czerwone i zielone kanały nabytego obrazu. Do subtrakcji tła, kliknij Process, a następnie wybierz Subtract Background.
W wyskakującym oknie, ustaw promień roling ball na 50 pikseli, a następnie kliknij OK i wybierz Yes w oknie Process Stack. Następnie, pod menu Analizuj, wybierz Narzędzia, a następnie wybierz ROI Manager, aby otworzyć okno ROI. Użyj narzędzia dowolnego wyboru, aby zarysować obszary zainteresowania wokół pojedynczych komórek.
W oknie ROI, wybierz Dodaj, aby zapisać wybrany zarys. Następnie kliknij Measure, aby wygenerować wyniki dotyczące obszaru, średniej, odchylenia standardowego i gęstości zintegrowanej. Powtarzaj proces dla wielu komórek tej samej larwę w oddzielnych kanałach zielonym i czerwonym.
Po eksporcie wyników do arkusza kalkulacyjnego, zmierzyć stosunek czerwony do zielony lub R przez G stosunku gęstości zintegrowanej dla każdej komórki i uśrednij te wartości, aby obliczyć średni stosunek R przez G na larwę zarówno dla obrazów przed jak i po stymulacji. W końcu oblicz zmianę fluorescencji lub deltę R przez G, odjąć stosunek R przez G przed stymulacją od stosunku R przez G po stymulacji, aby sprecyzować postsynaptyczną aktywność wapnia. Badania nad funkcjonalną łącznością między dendrytycznymi arborizacjami klasy IV lub neuronami cIVda a interneuronami w trzecim stadium larw wykazały, że interneurony basin-4 wykazywały zieloną fluorescencje z powodu cytozolowej ekspresji CaMPARI przed fotokonwersją i stymulacją światłem optogenetycznym.
Brak czerwonej fluorescencji wykryto w warunkach bazowych, potwierdzając brak fotokonwersji przed stymulacją. Jednoczesne narażenie na światło fotokonwersji i stymulacja optogenetyczna skutkowały fotokonwersją CaMPARI z zielonej na czerwoną flu
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę funkcjonalnej walidacji łączności synaptycznej w układzie nerwowym larwy Drosophila poprzez połączenie aktywacji optogenetycznej z obrazowaniem wapnia opartym na CaMPARI. Podejście to umożliwia badaczom ocenę zależnej od aktywności sygnalizacji synaptycznej pomiędzy zidentyfikowanymi neuronami sensorycznymi a interneuronami w nienaruszonych, niepodzesekcjonowanych larwach trzeciego stadium rozwojowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Funkcjonalna konektomika
- Optogenetyka
- Obrazowanie wapniowe
Wstęp
- Badania konektomu pozwoliły na zmapowanie połączeń synaptycznych u różnych gatunków, w tym u Drosophila.
- Mikroskopia elektronowa dostarcza szczegółowych danych anatomicznych, lecz nie zapewnia informacji funkcjonalnych.
- Niedawne badania nad Drosophila pozwoliły zidentyfikować kluczowe sieci neuronalne leżące u podstaw konkretnych zachowań, takich jak nocycepcja.
- Neurony sensoryczne klasy IV odpowiedzialne za arboryzację dendrytyczną (cIVda) tworzą główne kontakty synaptyczne z interneuronami Basin-4 do trzeciego stadium larwalnego.
Cel badania
- W celu funkcjonalnej oceny łączności synaptycznej między nocyceptorami cIVda a interneuronami Basin-4 u larw Drosophila.
- Aby wykazać przydatność CaMPARI jako reportera zależnego od aktywności w żywych, nieprzeciętych larwach.
- W celu opracowania protokołu dowodzącego zasady działania, łączącego stymulację optogenetyczną z fotokonwersją CaMPARI.
Zastosowane metody
- Immobilizacja larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym na szkiełkach przedmiotowych.
- Optogenetyczna aktywacja nocyceptorów cIVda przy użyciu przesuniętej w stronę czerwieni kanałorodopsyny CsChrimson.
- Równoczesna fotokonwersja CaMPARI w interneuronach Basin-4 w celu wykrycia napływu wapnia.
- Obrazowanie fluorescencyjne w celu monitorowania zmiany barwy CaMPARI jako odczytu aktywności synaptycznej.
Główne wyniki
- Obserwowano zależną od wapnia fotokonwersję CaMPARI w interneuronach Basin-4 po optogenetycznej stymulacji neuronów cIVda.
- Metoda ta dostarczyła funkcjonalnych dowodów na istnienie połączeń synaptycznych pomimo wewnętrznych ruchów larw i zmian płaszczyzny ogniskowania.
- Zastosowane podejście pozwoliło na walidację danych funkcjonalnych z połączeniami anatomicznymi zidentyfikowanymi w badaniach konektomu.
Wnioski
- Fotokonwersja oparta na CaMPARI jest wiarygodnym wskaźnikiem aktywacji synaptycznej u nienaruszonych larw Drosophila.
- Protokół ten umożliwia funkcjonalną walidację danych konektomicznych in vivo.
- Metodę tę można szeroko stosować do badania funkcji sieci neuronalnych u organizmów podatnych na modyfikacje genetyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Funkcjonalna walidacja łączności synaptycznej ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka przy wyborze celu terapeutycznego oraz pogłębiania zrozumienia mechanizmów w procesie odkrywania leków opartym na neurobiologii. Podejście oparte na metodzie CaMPARI umożliwia bezpośrednią ocenę zależnego od aktywności przesyłania sygnałów między określonymi partnerami neuronalnymi w układach nienaruszonych, wypełniając lukę między anatomiczną konektomiką a funkcjonalnymi danymi o znaczeniu praktycznym. Metody te zwiększają pewność prognostyczną w punktach zwrotnych walidacji celu i wczesnej fazy odkrywania, wspierając decyzje dotyczące portfolio w obszarze OUN oraz potokach badań nad rozwojem neurologicznym.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcjonalnej łączności synaptycznej wykraczające poza mapowanie anatomiczne.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie fizjologicznie istotnych interakcji neuronalnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i modulacji szlaków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia opracowanie zwalidowanych, zależnych od aktywności wskaźników dla testów neuronalnych.
- Zapewnia ilościowe, ratiometryczne wyniki odpowiednie dla powtarzalnych procesów przesiewowych.
- Umożliwia solidną standaryzację testów poprzez integrację stymulacji optogenetycznej z obrazowaniem funkcjonalnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje funkcjonalne dane synaptyczne z obwodami neuronalnymi istotnymi dla danej choroby w modelach przedklinicznych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez powiązanie punktów końcowych konektomicznych i funkcjonalnych.
- Minimalizuje ryzyko strategii biomarkerów translacyjnych poprzez potwierdzenie wzorców aktywności neuronalnej in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu, przez opracowanie testów, aż po badania przedkliniczne, zapewniając wielokrotnego użytku platformę do funkcjonalnej konektomiki w systemach podatnych na manipulacje genetyczne.
- Biologia odkrywcza: Weryfikuje funkcję synaptyczną i zaangażowanie szlaków w nienaruszonych obwodach neuronalnych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników dla badań nad związkami chemicznymi lub perturbacjami genetycznymi.
- Analityka: Umożliwia ratiometryczny pomiar aktywności zależnej od wapnia w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy dane anatomiczne i funkcjonalne, aby pomóc w wyborze modeli istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny przepływ pracy, który można dostosować do różnych celów i obwodów neuronalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje odczyty funkcjonalne i wspiera powtarzalność między eksperymentami.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji typu go/no-go i priorytetyzuje cele o potwiersionej istotności funkcjonalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój programów dotyczących OUN i rozwoju neurologicznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu optogenetyki, obrazowania wapnia oraz genetycznych systemów modelowych.
- Wymaga infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej oraz precyzyjnych systemów dostarczania światła.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności testów i interpretacji danych.
- Adaptacja do innych systemów modelowych zależy od podatności genetycznej i dostępności optycznej.
- W celu uzyskania wiarygodnych wyników należy kontrolować ruchy wewnętrzne oraz zmiany płaszczyzny ogniskowania podczas obrazowania żywych komórek.
