Name: Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcjonalnej łączności synaptycznej w układzie nerwowym larw Drosophila przy użyciu optogenetyki i obrazowania wapnia CaMPARI. Protokół umożliwia badanie aktywności neuronalnej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Biologii Morskiej (Woods Hole, MA) jest wymienione jako instytucja, która gościła i wsparła prace nad rozwiązywaniem problemów z opisanymi technikami i protokołami.

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem Drosophila melanogaster przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Genotyp w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (uzyskany przez rekombinację RRID:BDSC_5489912 i RRID:BDSC_3207916) został użyty do sterowania ekspresją optogenetyczną i CaMPARI (używając linii w-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo uzyskany przez rekombinację RRID:BDSC_81085 z markerami na drugim chromosomie) w partnerach pre- i postsynapticznych, odpowiednio. Narzędzia badawcze użyte w tym protokołach są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie larw
<ol>
	<li>Ustaw krzyżowanie genetyczne między samkami dziewicami UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) a samcami z linii muszek zawierającej dwa systemy dwubiegunowe, na przykład z presynaptyczną neuronem interesującym, który steruje ekspresją GAL4, a postsynaptyczny neuronem interesującym sterującym LexA33,34.</li>
	<li>Ustaw krzyżowanie genetyczne w plastikowych probówkach zawierających standardowe medium z agarem kukurydzianym35,36,37,38 uzupełnione o 0,5 mM all-trans retinal (ATR) dla aktywacji CsChrimson30,33. Przygotuj równoległe probówki bez ATR jako kontrole no-ATR. 
	UWAGA: Rozpuść medium z agarem kukurydzianym bez gotowania. Pozostaw, aby ostygło bez stwardnienia. Przygotuj 40 mM roztwór stockowy ATR (proszek ATR rozcieńczony w 95% alkoholu etylowym zgodnie z instrukcjami producenta), a następnie rozcieńcz do 0,5 mM w medium i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Przykryj probówki całkowicie folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. 
	UWAGA: Utrzymuj warunki hodowli w ciągłej ciemności z powodu światłoczułego charakteru ATR i aby zapobiec niezamierzonej aktywacji neuronów. Chociaż CsChrimson jest najbardziej wrażliwy na światło czerwone (590–680 nm), może być również aktywowany przez inne widoczne długości fal31,39.</li>
	<li>Inkubować probówki w 25 °C i wyhodować larwy do trzeciego stadium.   </li>
</ol>
2. Unieruchomienie larw
<ol>
	<li>Zbierz larwy trzeciego stadium za pomocą pędzelka. Umyj larwy w trzech dołkach płytki mikro do testów zawierającej 0,1 M PBS, aby usunąć pokarm. 
	UWAGA: Nie usuwaj nadmiaru PBS; pomaga to w utrzymaniu nawodnienia.</li>
	<li>Umieść małą ilość glinki modelarskiej w każdym rogu czystego pokrycia szkieletowego (18 × 18 mm). Umieść larwę w kropli PBS na pokryciu szkieletowym i pozwól jej orientować się brzuszną stroną w dół. 
	UWAGA: Dla obrazowania rdzenia nerwowego brzusznego (VNC), zamontuj larwę na jej grzbietowej stronie, aby brzuszna powierzchnia stykała się z pokryciem szkieletowym. Ta orientacja pozwala neuronom interneuronom Basin-4 w VNC na skierowanie się w stronę obiektywu przez pokrycie szkieletowe.</li>
	<li>Umieść czysty slajd mikroskopowy nad pokryciem szkieletowym zawierającym larwy.</li>
	<li>Zabezpiecz pokrycie szkieletowe, stosując dodatkową glinkę modelarską do naroży. Wykonaj wystarczającą siłę, aby unieruchomić larwy, unikając rozerwania larw lub pokrycia szkieletowego.</li>
</ol>
3. Stymulowanie, fotokonwersja i przepływ pracy obrazowania
<ol>
	<li>Zdobądź podstawową warstwę z neuronami postsynaptycznymi ekspresującymi CaMPARI, używając jednoczesnych kanałów zielonego (488 nm, 0,8% mocy lasera) i czerwonego (~561 nm, 0,8% mocy lasera). Użyj kroku Z 1 μm, 256 × 256 pikseli rozdzielczości, przeciętnej liniowej wartości 2, dwukierunkowego skanowania i szybkości skanowania 9 na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obiektyw 40×/1.2. Przeprowadź wszystkie obrazy w ciemnym środowisku. Zachowaj identyczne parametry warstwy z przez cały eksperyment. 
	UWAGA: Oczekuj jasnych zielonych ciał komórkowych w stereotypowych pozycjach w rdzeniu nerwowym brzusznym larw i braku wykrywalnej czerwonej fluorescencji na podstawie.</li>
	<li>Stymuluj larwy ciągle przez 30 s używając jednoczesnego światła fotokonwersyjnego (405 nm, 0,5% mocy lasera) i światła stymulacji optogenetycznej (594 nm, 0,8% mocy lasera).</li>
	<li>Zdobądź warstwę po stymulacji używając tych samych parametrów, jak w krok 3.1 pod oboma kanałami czerwonymi (~561 nm) i zielonymi (488 nm). Oczekuj ciała komórkowego VNC w podobnych pozycjach, jak na podstawie. Wykryj czerwoną fluorescencje CaMPARI w neuronach

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół umożliwia jakościową i ilościową ocenę łączności synaptycznej między określonymi partnerami synaptycznymi w nienaruszonych larwach D. melanogaster. Podejście to wykorzystuje kombinację optogenetycznej stymulacji cIVda neuronów czuciowych z wizualizacja opartą na CaMPARI aktywowanych postsynaptycznych interneuronów Basin-4 w celu monitorowania aktywności synaptycznej w centralnym układzie nerwowym (OUN) niesekcjonowanych larw. Poprzednie zastosowania CaMPARI w D. melanogaster konce...

Identyfikacja precyzyjnych partnerów synaptycznych w centralnym układzie nerwowym (CNS) umożliwia śledzenie tworzenia i uszczegółowiania połączeń synaptycznych podczas rozwoju układu nerwowego. Dlatego wysiłki skupione są na wykorzystaniu woluminowej mikroskopii elektronowej (EM) do odtworzenia nie tylko pełnych konektomów w potężnych organizmach modelowych, takich jak Caenorhabditis elegans1,2 i Drosophila melanogaster3,4,5, ale także woluminów EM w skali milimetrów złożonych mózgów ssaków, w tym pierwotnej kory wzrokowej myszy6 i ludzkiej kory skroniowej7. Badania te dostarczają unikalnego wglądu w zasady organizacyjne leżące u podstaw łączności synaptycznej na poziomie anatomicznym. Jednakże funkcjonalne zidentyfikowanie partnerów synaptycznych zapewnia uzupełniające wnioski dotyczące łączności neuronowej i jest wymagane do zweryfikowania wyników anatomicznych.
Drosophila oferuje liczne zalety dla badań nad łącznością neuronową, w tym dostępność pełnych konektomów dla larw3 oraz dla żeńskiego4 i męskiego5 układu nerwowego dorosłych, oprócz dobrze scharakteryzowanych obwodów neuronowych, które regulują przewidywalne zachowania8,9,10. Sieć nocyceptywna larw reprezentuje jeden z takich odpowiednich obwodów do badania precyzyjnej łączności synaptycznej11. Rekonstrukcja EM tej sieci ujawniła szczegółowe partnerstwa synaptyczne wymagane do przetwarzania bodźców nocyceptywnych, prowadzące do charakterystycznego zachowania ucieczki zwanego wałęczeniem nocyceptywnym12,13.
W obrębie tej sieci neurony czwartej klasy rozgałęzień dendrytów (cIVda)14 pełnią funkcję pierwotnych sensorycznych nocyceptorów odpowiedzialnych za wykrywanie bólu11,12,13,15,16. Ich ciała komórkowe i dendryty znajdują się obwodowo w ścianie ciała, podczas gdy ich aksony projektują się do larwalnego brzusznego słupka nerwowego (VNC)15. Wewnątrz OUN neurony cIVda rozgałęziają swoje terminale aksoniczne w stereotypowym wzorcu i tworzą większość swoich kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-411,12,13,17. Ta zdefiniowana relacja synaptyczna ustanawia neurony cIVda i interneurony Basin-4 jako idealną parę do funkcjonalnej oceny łączności synaptycznej in vivo. Rozwój metod analizy połączeń funkcjonalnych między indywidualnie zidentyfikowanymi partnerami synaptycznymi ułatwi badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i uszczegółowiania synaps, szczególnie w genetycznie nadających się do manipulacji systemach z stereotypowymi obwodami neuronowymi.
CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)18 to genetycznie zakodowany wskaźnik fluorescencyjny ratiometryczny, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższone poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach podstawowych CaMPARI fluoreskuje na zielono; w obecności wysokich stężeń wapnia i po wystawieniu na światło fotokonwersji (~400 nanometrów (nm)), nieodwracalnie przekształca się w czerwoną fluorescencję18. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest charakterystyczny dla aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego przekazywania sygnałów synaptycznych19,20.
Oprócz CaMPARI, aktywność neuronowa może być wizualizowana za pomocą odwracalnych czujników, takich jak genetycznie zaprogramowane wskaźniki wapnia (GECI) w tym GCaMP czy RCAMP21, a także genetycznie zaprogramowane wskaźniki napięcia (GEVI) 22 takie jak Arclight23, Ace2N-mNeon24 czy VARNAM25. Podczas gdy te szybkie, odwracalne czujniki są dobrze przystosowane do monitorowania przejściowej aktywności w czasie rzeczywistym, są one podatne na artefakty ruchu podczas obrazowania in vivo. W przeciwieństwie do tego, integracyjne i nieodwracalne właściwości fotokonwersji CaMPARI umożliwiają rejestrację aktywności w określonym oknie czasowym, pozwalając na wykrycie aktywacji neuronów nawet wtedy, gdy płaszczyzny ogniskowe przesuwają się podczas obrazowania20. Ponadto, fotokonwersja CaMPARI może być dostrojona poprzez regulację intensywności fioletowego światła, umożliwiając wykrywanie zmniejszonej siły synapsy lub subprogowych wejść26. Te w

<table><tbody><tr><td>0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>Chemikalia używane w roztworze do nawadniania i montowania larw</td></tr><tr><td>All-trans-retinal (ATR)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500-500mg</td><td>Chemikalia dodawane do pokarmu w celu aktywacji narzędzi optogenetycznych</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>ZEISS&nbsp;</td><td>LSM900 Konfokalny</td><td>Mikroskop konfokalny, Obiektyw (40&times;/1.2 NA), Źródło światła/lasera (405, 488, 561 nm)</td></tr><tr><td>Pokrywki (18x18mm)</td><td>VWR</td><td>48366-205</td><td>Używane do montażu zwierząt do obrazowania</td></tr><tr><td>Etanol (95%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Używany jako rozpuszczalnik dla proszku ATR</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Open source</td><td>RRID:SCR_002285&nbsp;</td><td>Używane do analizy obrazów</td></tr><tr><td>Prism wersja 10.4.1</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>RRID:SCR_002798</td><td>Używane do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Szlabanki mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>&nbsp;48300-041</td><td>Używane do montażu zwierząt do obrazowania</td></tr><tr><td>Glina modelarska</td><td>Flinn scientific</td><td>FB0600</td><td>Używane do trzymania szkiełka pokrywowego na szlabanku mikroskopowym z larwą pośrodku</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Genesee scientific</td><td>59-204</td><td>Używane do przenoszenia larw między lokacjami</td></tr><tr><td>Standardowe medium agarowe z mąką kukurydzianą</td><td>Genesee scientific</td><td>66-123</td><td>Żywność można również przygotować używając podobnych standardowych receptur i składników</td></tr><tr><td>Standardowe plastikowe pojemniki Drosophila (wąskie pojemniki Drosophila o wymiarach 25mm x 95mm)</td><td>Genesee scientific</td><td>32-109</td><td>Można również używać większych pojemników lub butelek</td></tr><tr><td>Płytka mikroskodalna trójkomórkowa</td><td>Electron Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>71561-01</td><td>Płytka używana do separacji i czyszczenia pojedynczych larw</td></tr><tr><td>Zestawy Drosophila (genotyp: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>RRID:BDSC_54899 &amp; RRID:BDSC_32079</td><td>Uzyskane przez rekombinację RRID:BDSC_54899 i RRID:BDSC_32079</td></tr><tr><td>Zestawy Drosophila (genotyp: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>RRID:BDSC_81085</td><td>Uzyskane przez rekombinację RRID:BDSC_81085 z markerami chromosomu drugiego</td></tr></tbody></table>

charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w drosophila ośrodkowym układzie nerwowym larwalnym przy użyciu campari

Functional Characterization of Individual Pre- and Postsynaptic Partners In the Drosophila Larval Central Nervous System Using CaMPARI

Studia nad konektomem znacznie rozszerzyły zrozumienie łączności synaptycznej w układach nerwowych różnych gatunków. Chociaż charakterystyka partnerów synaptycznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (ME) zapewnia szczegółowe informacje anatomiczne, funkcjonalne aspekty sieci neuronowych wymagają uzupełniających podejść. Ostatnie badania na Drosophila ujawniły nie tylko kompletne konektome larwalnego, jak również męskiego i żeńskiego dorosłego układu nerwowego, ale także komponenty komórkowe sieci neuronowych, które regulują określone zachowania, takie jak larwalna sieć nocyceptywna. Na etapie trzeciej larwki, multidendryczne neurony sensoryczne typu cIVda (nocyceptory) ustanawiają większość kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-4. Aby ocenić funkcjonalne znaczenie tych połączeń anatomicznych, zakodowany genetycznie wskaźnik wapnia CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) został zastosowany w żywych, niesekcjonowanych larwkach trzeciej instar jako reporter zależny od aktywności do oceny łączności synaptycznej między neuronami cIVda a interneuronami Basin-4. CaMPARI jest wskaźnikiem fluorescencyjnym ratiometrycznym, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższone poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach wyjściowych, CaMPARI fluorescencja zielona; w obecności wysokich stężeń wapnia i po ekspozycji na światło fotokonwersji (~400 nm), nieodwracalnie przełącza się na czerwoną fluorescencje. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest charakterystyczny dla aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego przekazywania sygnałów synaptycznych. Przedstawiono krok po kroku metodę unieruchomienia larwek trzeciej instar na szklanym slajdzie do optogenetycznej aktywacji nocyceptorów cIVda za pomocą przesuniętego na czerwono channelrhodopsin CsChrimson, w połączeniu z jednoczesną fotokonwersją CaMPARI w neuronach Basin-4. Fotokonwersja zależna od wapnia w neuronach Basin-4, pomimo wewnętrznych ruchów i zmian płaszczyzny ogniskowej, dostarcza funkcjonalnych dowodów na łączność synaptyczną między tymi komórkami. Służy to jako dowód na zasady dla użycia CaMPARI w połączeniu z presynaptyczną stymulacją optogenetyczną w nienaruszonych, niesekcjonowanych larwkach Drosophila.

Following this protocol, functional connectivity between cIVda neurons and Basin-4 interneurons was assessed in live, undissected D. melanogaster third instar larvae using CaMPARI (Rysunek 2). Prior to any stimulation with photoconversion (PC) light or optogenetic activation, Basin-4 interneurons displayed green fluorescence due to cytosolic CaMPARI expression (Rysunek 2A). No red fluorescence was detected under baseline conditions (<strong class="xfig"...

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

Connectome studies have greatly expanded understanding of synaptic connectivity in the nervous systems of various species. While characterization of ...

Nasze badania koncentrują się na ocenie funkcjonalnej łączności synaptycznej między określonymi parami węzłów nerwowych u żywych i sekcjach larw Drosophila. Konwencjonalne metody wymagają sekcjonowania lub fizycznej stymulacji. Ten protokół wykorzystuje optogenetykę na niesektoryzowanych larwach, zmniejszając tym samym artefakty.Aby rozpocząć, stopić agarowe medium kukurydziane w mikrofalówce przez 8-10 sekund bez gotowania i pozwolić mu ostygnąć w temperaturze pokojowej bez stwardnienia. Przed całkowitym ostygnięciem, dodaj all-trans-retinal, lub ATR, do stężenia 0,5 milimolarnego, aby uzupełnić medium dla much, które wymagają aktywacji csChrimson. Przykryj pojemniki całkowicie folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.Skrzyżuj samica dziewicę noszącą geny CaMPARI i csChrimson z samcem noszącym geny GAL4 i LexA driver w plastikowych pojemnikach zawierających przygotowane medium. Przygotuj równoległe pojemniki bez ATR jako kontrole. Inkubatoruj pojemniki w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż larwy osiągną trzeci stadium.Użyj pędzelka, aby zebrać larwy trzeciego stadium. Przepłucz larwę w trzykomorowym płytce mikro spot zawierającej 0,1 molarny PBS, aby usunąć wszelkie skupiska jedzenia. Umieść małą ilość glinki modelarskiej w każdym rogu czystego pokrycia 18 x 18 milimetrów.Umieść larwę na kropli PBS na pokryciu i pozwól jej ustąpić brzuszną stroną w dół. Umieść czysty slajd mikroskopowy nad pokryciem zawierającym larwę. Zabezpiecz pokrycie, stosując glinkę modelarską do narożników, stosując tylko wystarczającą presję, aby unieruchomić larwę bez jej zmiażdżenia lub złamania szkła.Umieść slajd zawierający larwę na stole mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę obiektywu 40x/1.2. W interfejsie oprogramowania mikroskopu kliknij Live. Następnie pod panelem Z Stack kliknij Set First, a następnie Set Last, a następnie Stop, aby uzyskać podstawowe Z Stack postsynaptycznych neuronów, ekspresujących CaMPARI.Pod menu Kanał, ustaw zielony kanał 488 nanometrów z mocą lasera 0,8%. Następnie ustaw czerwony kanał 561 nanometrów na 0,8% mocy lasera. Pod menu Z Stack, ustaw wartość Interval na 1 mikrometr.W menu Nabycie, wybierz Presets, aby ustawić rozdzielczość 256 x 256 pikseli. Wartość Averaging linii 2, dwukierunkowe skanowanie i szybkość skanowania 9, umożliwiając automatyczną aktualizację czasu pikseli. Przeprowadź wszystkie zdjęcia w ciemnym środowisku, utrzymując identyczne parametry nabycia przez cały eksperyment.Ustaw światło fotokonwersji 405 nanometrów na 0,5% mocy lasera. I światło stymulacji optogenetycznej 561 nanometrów na 0,8% mocy lasera. Kliknij Live, a następnie wybierz Best Fit pod panelem Histogram.Pozwól, aby oba lasery jednocześnie stymulowały larwę przez 30 sekund, a następnie zatrzymaj stymulację. Podczas akwizycji ZStack po stymulacji za pomocą tych samych parametrów, jak w bazie, obserwuj czerwoną fluorescencje CaMPARI w neuronach stymulowanych laserem larw karmionych ATR z minimalną fotokonwersją i kontrolami. W oprogramowaniu Fiji ImageJ kliknij File, a następnie wybierz Open.W oknie opcji importu BioFormats z ustawieniami domyślnymi kliknij OK, aby otworzyć nabyte zdjęcie ZStack. Pod menu Obraz, wybierz Color, a następnie Split Channels, aby zobaczyć czerwone i zielone kanały nabytego obrazu. Do subtrakcji tła, kliknij Process, a następnie wybierz Subtract Background.W wyskakującym oknie, ustaw promień roling ball na 50 pikseli, a następnie kliknij OK i wybierz Yes w oknie Process Stack. Następnie, pod menu Analizuj, wybierz Narzędzia, a następnie wybierz ROI Manager, aby otworzyć okno ROI. Użyj narzędzia dowolnego wyboru, aby zarysować obszary zainteresowania wokół pojedynczych komórek.W oknie ROI, wybierz Dodaj, aby zapisać wybrany zarys. Następnie kliknij Measure, aby wygenerować wyniki dotyczące obszaru, średniej, odchylenia standardowego i gęstości zintegrowanej. Powtarzaj proces dla wielu komórek tej samej larwę w oddzielnych kanałach zielonym i czerwonym.Po eksporcie wyników do arkusza kalkulacyjnego, zmierzyć stosunek czerwony do zielony lub R przez G stosunku gęstości zintegrowanej dla każdej komórki i uśrednij te wartości, aby obliczyć średni stosunek R przez G na larwę zarówno dla obrazów przed jak i po stymulacji. W końcu oblicz zmianę fluorescencji lub deltę R przez G, odjąć stosunek R przez G przed stymulacją od stosunku R przez G po stymulacji, aby sprecyzować postsynaptyczną aktywność wapnia. Badania nad funkcjonalną łącznością między dendrytycznymi arborizacjami klasy IV lub neuronami cIVda a interneuronami w trzecim stadium larw wykazały, że interneurony basin-4 wykazywały zieloną fluorescencje z powodu cytozolowej ekspresji CaMPARI przed fotokonwersją i stymulacją światłem optogenetycznym.Brak czerwonej fluorescencji wykryto w warunkach bazowych, potwierdzając brak fotokonwersji przed stymulacją. Jednoczesne narażenie na światło fotokonwersji i stymulacja optogenetyczna skutkowały fotokonwersją CaMPARI z zielonej na czerwoną flu

functional-characterization-individual-pre-postsynaptic-partners

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Poznaj metodę oceny funkcjonalnej łączności synaptycznej w układzie nerwowym larw Drosophila przy użyciu optogenetyki i obrazowania wapnia CaMPARI. Protokół umożliwia badanie aktywności neuronalnej in vivo.

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

Przeglądaj więcej filmów