ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jeffowi Franklinowi (Vanderbilt University) za dostarczenie danych dotyczących zbiorów i wskazówek eksperymentalnych oraz Paolo Neviani (Extracellular Vesicle and Nanoparticle Analytics Core, Children’s Hospital of Los Angeles) za dane dotyczące częstotliwości zbiorów.

Wszystkie procedury są zgodne ze standardowymi wytycznymi Good Laboratory Practice (GLP) i Good Cell and Tissue Culture Practice.
UWAGA: Wkładka jest wstępnie złożona i wysterylizowana metodą gamma. Jest podwójnie zapakowana, a na każdym połączeniu znajdują się nakrętki luer, więc jest całkowicie zamknięta i pozostanie sterylna poza torebkami. Zobacz Rysunek 2 dla identyfikacji portu wkładki. Wszystkie kroki wykonywano w temperaturze pokojowej w komorze przepływowej.
1. Przygotowanie i sterylizacja naczynia z nakrętką zbiornika.
<ol>
	<li>Wyjmij dwa krótkie kawałki wężyka z podwójnie zapakowanej wkładki.</li>
	<li>Przymocuj wężyk do kolców wężyka na stalowej rurze z naczynia z nakrętką zbiornika.</li>
	<li>Owinąć krótki wężyk i odsłonięte końce stalowej rury folią aluminiową, aby zachować sterylność po sterylizacji. Umieść złożone elementy do worka autoklawowego.</li>
	<li>Sterylizuj autoklawem za pomocą cyklu suchego w temperaturze 121 °C przez 15–30 min. Pozostaw nakrywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przymocowanie wkładki z dziurkami do butelki zbiornika
<ol>
	<li>Przenieś 50 ml PBS z 1-litrowej butelki do 50-mililitrowej stożkowej probówki na późniejsze użycie.</li>
	<li>Wyjmij nakrywkę zbiornika z worka autoklawowego i usuń folię ochronną z długich stalowych rurek.</li>
	<li>Zdejmij nakrywkę z butelki z PBS i wkręć nakrywkę zbiornika na jej miejsce. Wyjmij wkładkę z wewnętrznej sterylnej torebki.</li>
	<li>Zdejmij folię aluminiową z jednego z kawałków wężyka na górze nakrywki zbiornika.</li>
	<li>Zdejmij nakrętkę luer z jednego z długich kawałków wężyka wkładki i przymocuj ją do wężyka zbiornika na nakrywce zbiornika. Użyj odrobiny obrotu wstecznego, aby zapobiec zaciśnięciu.</li>
	<li>Powtórz dla drugiego połączenia wężyka.</li>
	<li>Delikatnie ściśnij brązowy wężyk pompy, aby przepompować PBS przez system, aż wszystkie bąbelki powietrza zostaną usunięte.</li>
</ol>
3. Wypełnienie dodatkowej przestrzeni kapilarnej (ECS)
<ol>
	<li>Napełnij 20 ml PBS do sterylnej strzykawki za pomocą igły o dużej grubości o długości co najmniej 1,5 cala; dla bezpieczeństwa preferowana jest igla stępiona.</li>
	<li>Dezynfekuj oba boczne złącza luer za pomocą alkoholu i pozwól im wyschnąć.</li>
	<li>Przymocuj wypełnioną PBS strzykawkę do jednego bocznego portu i pustą sterylną strzykawkę do przeciwległego portu. Zamknij oba końcowe porty i otwórz oba boczne porty.</li>
	<li>Powoli wstrzykuj PBS do ECS, trzymając wkładkę pod lekko nachylonym kątem, aby zminimalizować bąbelki powietrza. Pusta strzykawka na przeciwległym bocznym porcie wypełni się powietrzem.</li>
	<li>Jeśli w ECS znajduje się powietrze, otwórz prawy końcowy port i wyciągnij płyn do pustej strzykawki, aż ECS wypełni się płynem (to wyciąga PBS z butelki zbiornika, przez włókna i do ECS).</li>
	<li>Zamknij oba suwaki bocznych portów, otwórz oba suwaki końcowych portów i sprawdź przepływ delikatnie ściskając palcami wężyk pompy.</li>
	<li>Pozostaw puste strzykawki przymocowanie do bocznych portów, aby służyły jako nakrywki. Wymień strzykawki na nowe za każdym razem, gdy były poza komorą przepływową.</li>
</ol>
4. Pokrywanie włókien i inokulacja komórek
UWAGA: Procedury dotyczące pokrywania włókien określonym białkiem matrycy i inokulacją komórek są zasadniczo takie same. Nadmiar płynu przepłynie przez włókna i do zbiornika, podczas gdy komórki lub materiał powlekający pozostaną na zewnątrz włókien w ECS. Zaleca się 1 x 108 komórek do wysiewu. Zaleca się 100–500 μg białka matrycy w 20 ml PBS dla 4 000 cm2 HFBR. Białka matrycy związane z powierzchniami włókien nie wpływają na MWCO
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór powlekający lub zawiesinę komórek w sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówce. 1 X 108 komórek w pożywce warunkowej z rozszerzenia flakonu lub 100–500 ug białka matrycy w PBS. Objętość 20 ml.</li>
	<li>Wyciągnij 20 ml komórek lub roztworu powlekającego do sterylnej strzykawki za pomocą igły o dużej grubości.</li>
	<li>Przymocuj strzykawkę zawierającą roztwór do jednego bocznego portu i pustą sterylną strzykawkę do drugiego bocznego portu.</li>
	<li>Zamknij oba końcowe porty i otwórz oba boczne porty.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj roztwór, przenosząc płyn między dwiema strzykawkami. Pozostaw 1/2 roztworu w każdej strzykawce. Zamknij oba boczne porty.</li>
	<li>Otwórz prawy końcowy

<ol>
	<li>Hahm J, Kim J, Park J. Strategies to enhance extracellular vesicle production. Tissue Eng Regen Med. 2021;18(4):513-24.</li>
	<li>Welsh JA, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2).</li>
	<li>Garcia SG, et al. Hollow fiber bioreactor allows sustained production of immortalized mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 2024;5(2):201-20.</li>
	<li>St-Denis-Bissonnette F, et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. J Extracell Vesicles. 2023;12(12).</li>
	<li>Tripp T, et al. Bioreactor-enabled extracellular vesicle production for downstream functional engineering. bioRxiv. 2025:doi:10.1101/2025.11.21.689817.</li>
	<li>Storm MP, et al. Hollow fiber bioreactors for in vivo-like mammalian tissue culture. J Vis Exp. 2016;(111).</li>
	<li>Roszkowski S. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes for regenerative medicine applications. Clin Exp Med. 2024;24(1):46.</li>
	<li>Yan L, Wu X. Exosomes produced from 3D cultures of umbilical cord mesenchymal stem cells in a hollow-fiber bioreactor show improved osteochondral regeneration activity. Cell Biol Toxicol. 2020;36(2):165-78.</li>
	<li>Cao J, et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):206.</li>
	<li>Cadwell JJS. 3-D perfusion hollow fiber bioreactors, applying histocentric principles. FiberCell Systems; 2025:https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2025/01/FiberCell-Systems-Histocentric-ArticleV1.3.pdf.</li>
	<li>Watson DC, et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 2016;105:195-205.</li>
	<li>Meuwly F, et al. Use of glucose consumption rate (GCR) as a tool to monitor and control animal cell production processes in packed-bed bioreactors. J Biotechnol. 2006;122(1):122-9.</li>
	<li>Gobin J, et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):127.</li>
	<li>Cadwell JJS, et al. Retroviral transduction and production of Palm-GRT labelled extracellular vesicles using bone marrow-derived MSC in a hollow fiber bioreactor [poster]. Presented at: ISEV; 2022:https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2022/11/2022-FiberCell-Systems-Retroviral-Transduction-and-Production-of-Palm-GRET-Labelled-Extracellular-Vesicles-using-Bone-Marrow-Derived-MSC-in-a-Hollow-Fiber-Bioreactor.pdf.</li>
	<li>Bennett A, et al. Cryoelectron tomographic analysis of an HIV-neutralizing protein and its complex with native viral gp120. J Biol Chem. 2007;282(38):27754-9.</li>
	<li>Watson DC, et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1442088.</li>
	<li>Yarlett N, et al. In vitro culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber bioreactor: applications for simultaneous pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation of test compounds. Methods Mol Biol. 2020;2052:335-50.</li>
	<li>Gerlach JC. Bioreactors for extracorporeal liver support. Cell Transplant. 2006;15 Suppl 1.</li>
	<li>Stanness KA, et al. A new model of the blood-brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 1999;10(18):3725-31.</li>
	<li>Eappen AG, et al. In vitro production of infectious Plasmodium falciparum sporozoites. Nature. 2022;612:534-9.</li>
	<li>Xue X, et al. The hollow fiber bioreactor as a stroma-supported, serum-free ex vivo expansion platform for human umbilical cord blood cells. Biotechnol J. 2014;9(7):980-9.</li>
	<li>Gupta D, Zickler AM, El Andaloussi S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 2021;178:113961.</li>
	<li>Cadwell JJS. Hollow fiber bioreactor protocol for mesenchymal stem cells. FiberCell Systems; 2022:https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2022/12/2.-Hollow-Fiber-Bioreactor-Protocol-for-Mesenchymal-Stem-Cells.pdf.</li>
</ol>

Autor jest prezesem i dyrektorem generalnym firmy FiberCell Systems Inc.

Bioreaktory z włóknami dziurawkowatymi nie są w stanie produkować białek czy przeciwciał w rzeczywistych ilościach komercyjnych. Mają jednak unikalną zdolność do hodowli stosunkowo dużej liczby komórek w wysokiej gęstości i wydzielania skoncentrowanego produktu EV w klinicznie istotnej skali. Dopiero w ostatnich latach uznano prawdziwe zalety bioreaktora histocentrycznego. Warunki wysokogatunkowej kultury perfuzyjnej prowadzą do skoncentrowanych EV, przy użyciu pożywki zgodnej z cGMP, w ilościach, które mogą być odpowiednie dla badań i potencjalnych zastosowań klinicznych. Pojedyncze zbiory z 4 000 cm2 mogą zawierać od 5 × 1012 do 1 × 1014 EV w objętości 10–20 ml. Te plony są w zakresie zgłaszanym w badaniach oceniających dawkowanie EV22.
Codzienna monitoryzacja wskaźnika poboru glukozy jest ważnym parametrem oceny wydajności kultury i jest bezpośrednim wskaźnikiem metabolizmu komórek, ich liczby i zdrowia. Ogólnie preferowane są wyższe stężenia glukozy, takie jak DMEM, które ma początkowe stężenie glukozy 4,5 g/l. Pożywkę należy wymienić na świeżą, gdy glukoza zostanie zużyta w 50%. Niektóre komórki, takie jak MSC, wydają się zużywać glukozę i wytwarzać mleczan przy stężeniach glukozy powyżej 3 g/l, a następnie przełączają się na zużywanie glutaminy i wytwarzanie amoniaku w stężeniach poniżej 3 g/l. Kompletne profilowanie metabolizmu MSC w kulturze 3D jeszcze nie zostało wykonane.
Najbardziej krytycznym parametrem dla udanej kultury w bioreaktorze jest liczba komórek inokulum. Minimalna liczba inokulum komórek dla bioreaktora C2011 o powierzchni 4000 cm2 to 1 × 108 komórek. Dla komórek nieproliferujących, takich jak MSC lub HAFSC, preferowana jest większa liczba, do 1 × 109 łącznie. Objętość zbiornika powinna być proporcjonalna do liczby komórek w kasecie. 1 × 108 komórek powinno używać zbiornika nie większego niż 125 ml. 1 × 109 komórek powinno mieć zbiornik nie większy niż 1 l. Zbyt duży zbiornik może sprawić, że komórki wejdą w fazę opóźnienia. Charakteryzuje się to brakiem zużycia glukozy przez komórki, mimo że są one żywotne, jak określono za pomocą barwienia niebieskim trypanowym. W takim przypadku zmniejsz objętość zbiornika lub zasiej więcej komórek. By uzyskać wystarczającą liczbę komórek do skutecznej kultury w bioreaktorze, może być konieczne wielokrotne zasiewanie komórek. Po prostu zasiej więcej komórek na komórki już znajdujące się w kasecie. Oceniają bioreaktora wydajność, zwracaj uwagę na wielkość inokulum komórek. 10-krotne zwiększenie liczby zasiewanych komórek może skutkować 10-krotnie większą produkcją EV.
Modyfikacje protokołu mogą obejmować zmiany w składzie pożywki, powłokach powierzchniowych, liczbie komórek, objętości zbioru, częstotliwości zbioru lub wielkości strzykawki, w zależności od typu komórek i pożądanego plonu. Ciągła kultura umożliwia łatwą, bieżącą optymalizację warunków, ponieważ zmiany można wprowadzać w trakcie kultury, a wyniki uzyskać w czasie rzeczywistym21. Rozwiązywanie problemów powinno koncentrować się na utrzymaniu sterylności i monitorowaniu aktywności metabolicznej. Upewnij się, że nie ma blokad ani zgięć w przewodach, szczególnie wokół zaciskowych suwaków. Bakteryjne zakażenie skutkuje szybkim poborem glukozy i mętnością w butelce zbiornika. Grzybicze zakażenie wyznacza się przez puchatą białą akumulację na lewym końcu kapsuli, blokującą przepływ. Użycie systemu bioreaktora z włóknami dziurawkowatymi wymaga umiejętnego postępowania i ścisłego przestrzegania protokołów. Krytyczne kroki obejmują zasiewanie odpowiedniej liczby komórek, utrzymanie sterylności podczas zbioru i staranne monitorowanie zużycia glukozy, aby zapobiec nadmiernej proliferacji lub wyczerpania składników odżywczych. Większość komórek przyczepia się do włókien, czasami w zależności od pokrytej fibronektyną macierzy białkowej, która ułatwia szybkie przyczepianie komórek. Niektóre komórki, takie jak MSC, HAFSC i kardioprogenitorzy, pozostają przyczepione do włókien i tworzą 3D sferoidy.
System HFBR wspiera wysokogatunkowe, chemicznie określone i wolne odksenogene kultury większości typów komórek, ułatwiając dużo skalową produkcję EV23. Codzienna monitoryzacja glukozy zapewnia wiarygodny wskaźnik wydajności bioreaktora. Zamknięty, perfuzyjny system jest zgodny ze standardami cGMP, a skalowanie jest możliwe za pomocą większych kaset lub nawet wielu kaset. Produkcja EV w skali gramów może być możliwa w zoptymalizowanych warunkach. Bioreaktor z włóknami dziurawkowatymi zapewnia reproduktywalną platformę dla utrzymanej produkcji i zbioru EV w kontrolowanych warunkach. Przedstawiony tutaj protokół kładzie nacisk na praktyczne rozważ

Wezyki dostęczne są coraz częściej rozpoznawane za ich role w komunikacji międzykomórkowej i zastosowaniach terapeutycznych, w tym w medycynie regeneracyjnej. Tradycyjne metody 2-D kultury komórkowej są pracochłonne i o ograniczonym wydajności, czasami wymagające setek kolb do kultury, aby uzyskać wystarczającą liczbę EV do eksperymentów lub badań na zwierzętach1,2. Skala przekładu klinicznego ogólnie wykorzystuje tradycyjne zamknięte bioreaktory z mikronośnikami lub innymi podpórkami. Systemy te są z natury niefizjologiczne, nieefektywne i mogą mieć zmienne wyniki. Bioreaktory z dziurawą włóknem zapewniają trójwymiarowe środowisko oparte na perfuzyjnym, które wspiera kultury komórek o wysokiej gęstości w kompaktowej podstawie i w skali potencjalnie odpowiedniej dla zastosowań klinicznych3,4.
HFBR oferują kompaktowy, wysokogęstościowy system kultury komórkowej, umożliwiający ciągłą produkcję skoncentrowanych EV z zmniejszonym wysiłkiem, czasem i przestrzenią w porównaniu z tradycyjną 2-D kulturą5. Umożliwiają wysokogęstościowe kultury komórek w kompaktowej przestrzeni, wspierając dużą skalę produkcji EV w dowolnym laboratorium. HFBR hoduje duże liczby komórek (1X109 do 1×1010) w małej objętości (20–60 mL), w standardowym inkubatorze CO2 i nie wymagają żadnego specjalistycznego sprzętu. Systemy te umożliwiają ciągłe, skoncentrowane zbiory EV przez tygodnie lub miesiące, ułatwiając jednocześnie użycie zredukowanego surowicy lub chemicznie określonych mediów. W HFBR komórki są zatrzymywane w małej objętości przestrzeni pozakapilarnej (ECS) oddzielonej od recylkulującego medium półprzepuszczalną membraną z dziurawą włóknem o określonym przekroju cięć molekularnych (MWCO) (Rysunek 1). Małe cząsteczki takie jak glukoza i mleczan mogą łatwo przenikać przez włókna, podczas gdy większe elementy takie jak przeciwciała czy zewnątrzkomórkowe wezyki są zatrzymywane i skoncentrowane w ECS, gdzie mogą być zbierane.
Trzy fundamentalne cechy odróżniają kulturę komórek z dziurawą włóknem od każdej innej metody: 1) wysoki stosunek powierzchni do objętości (200 cm2/mL) pozwala na podobne do in vivo gęstości komórek, 1–2 × 108komórek na mL. 2) Komórki są związane z porowatym podłożem, a nie z nieporowatym plastikowym naczyniem. Dzielenie komórek nie jest wymagane3. Przecięcie molekularne (MWCO) włókna można kontrolować. Wydzielane produkty są zatrzymywane i skoncentrowane 10–100X w porównaniu do 2-D kultury flakońskiej wewnątrz ECS kartridżu. Ponadto, specyficzne matryce białkowe, takie jak fibronektyna czy kolagen, mogą być łatwo nałożone na powierzchnię włókna bez wpływu na przepływ przez włókna.
HFBR zapewnia 3D środowisko kultury oparte na perfuzyjnym, które jest bardziej podobne do in vivo niż 2-D kultura6 i unikalnie zmniejsza zależność komórek od wsparcia surowicą i upraszcza wymagania dotyczące mediów. To wysokogęstościowe środowisko kultury może wspierać różnice w przetwarzaniu białek w porównaniu do 2-D kultury, wraz z zgłaszanymi zwiększoną bioaktywnością EV7,8,9. Bioreaktory z dziurawą włóknem są “histocentryczne”; próbują naśladować właściwości podobne do tkanki in vivo fizjologii komórek10. Dwie kluczowe cechy bioreaktora histocentrycznego to 1) wysoka gęstość komórek, pozwalająca komórkom generować własne specyficzne mikrośrodowisko oraz 2) dzielenie lub przeszczepianie komórek nie jest wymagane, pozwalając na interakcje komórka-komórka i 3D struktury takie jak sferoidy, aby rozwijać się organicznie z czasem. Ta metoda umożliwia gęstości komórek, które są trudne do osiągnięcia z konwencjonalnymi systemami 2-D kultury i może ułatwić użycie uproszczonych, wolnych od białek i chemicznie określonych mediów.
Każdy rodzaj komórek, który może być hodowany w flakonach może być hodowany w bioreaktorze z dziurawą włóknem. Linie komórek transformowanych będą proliferacyjne11. Kluczowym parametrem do monitorowania jest tempo pobierania glukozy. Monitorowanie glukozy zapewnia bezpośrednie miarę aktywności metabolicznej, umożliwiając optymalizację czasu zbioru i kontrolę gęstości komórek12. Ważne jest kontrolowanie masy komórek w kartridżu, aby tempo pobierania glukozy nie przekraczało zdolności systemu do dostarczania tlenu i usuwania CO2. Osiąga się to poprzez proste usuwanie masy komórek podczas zbioru. MSC i HA

<table><tbody><tr><td>16 gauge 1.5" needle</td><td>Stellar Scientific</td><td>SOLM-111615</td><td></td></tr><tr><td>3-way stopcock, sterile</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-48523-28</td><td></td></tr><tr><td>20mL luer lock syringe</td><td>Becton Dickenson</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>25mL serological pipette, sterile</td><td>Stellar Scientific</td><td>TC50-TAU-25</td><td></td></tr><tr><td>25mm syringe filter, sterile</td><td>Thomas Scientific</td><td>1162B74</td><td></td></tr><tr><td>38 mm reservoir cap</td><td>FiberCell Systems&nbsp;</td><td>A1006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Stellar Scientific</td><td>T50-101-PK</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT</td><td>CVS Pharmacy</td><td>Item # 376560</td><td></td></tr><tr><td>Hollow fiber bioreactor</td><td>FiberCell Systems</td><td>C2011</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibronectin, 1 mg</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr></tbody></table>

dużoskalowowa produkcja wezykuł pozakomórkowych z gęstych 3d kultur komórkowych w bioreaktorach perfuzyjnych z włóknami pustkowymi

Large-Scale Production of Extracellular Vesicles from High-Density 3D Cell Cultures in Hollow Fiber Perfusion Bioreactors

Postęp w dziedzinie badań nad egozomami jest utrudniony przez małą liczbę komórek i niską produktywność wydzielanych egzosomów w tradycyjnej 2-D kulturze komórkowej. Kultury komórek o wysokiej gęstości w bioreaktorach z dziurkowanych włóknach (HFBR) pozwalają na ciągłą produkcję wydzielonych biocząstek i zewnątrzkomórkowych pęcherzyków (EV) z dużej liczby komórek, przez dłuższy okres czasu, w wysokich stężeniach w 3D kulturze. Ten protokół opisuje metodę zbierania skoncentrowanych wydzielanych egzosomów przy zachowaniu optymalnej masy komórkowej i warunków 3D perfuzyjnej kultury, które wspierają wzrost komórek o wysokiej gęstości przez kilka tygodni lub miesięcy ciągłej produkcji w komercyjnie dostępnym HFBR. System jest kompaktowy, zamknięty, jednorazowego użytku, może być zgodny z cGMP, prosty w użyciu i pasuje do standardowego inkubatora CO2 . Niektóre komórki, takie jak komórki macierzyste mezenchymalne (MSC) i ludzkie komórki macierzyste płynu owodniowego (HAFSC), mogą wykazywać zmniejszoną proliferację w tych warunkach, co może potencjalnie wpływać na różnicowanie i fenotyp w ciągu czasu. Przedstawione wyniki pokazują typowe wydajności EV i żywotność komórek przez tygodnie lub dłużej ciągłej produkcji. Ta metoda zapewnia reproduktyjne, wysokiej jakości zbiory EV nadające się zarówno do zastosowań badawczych, jak i klinicznych.

Zgodnie z tym protokołem, kartridż o powierzchni 4,000 cm2 zasiewany proliferującymi liniami komórkowymi zużywa zazwyczaj 1–2 g glukozy na dobę. Przy zastosowaniu pożywki o wysokiej zawartości glukozy, takiej jak DMEM, przekłada się to na 1 L pożywki co 2–3 dni. Komórki osiągają maksymalną gęstość w ciągu jednego tygodnia od zasiewu. Zbiór należy rozpocząć po 5–7 dniach lub w momencie, gdy tempo poboru glukozy osiągnie 1 g na dobę, a następnie przeprowadzać go codziennie, jeśli to możliwe. W ciągu tego pierwszego tygodnia hodowli pożywkę zawierającą surowicę w ECS można zastąpić bezsurowiczą pożywką bazową, utrzymując surowicę w pożywce krążącej, jeżeli jest ona wymagana. Po osiągnięciu tempa poboru glukozy na poziomie 1 g/dobę można łatwo przejść na pożywki o obniżonej zawartości surowicy lub inne pożywki chemicznie zdefiniowane. MSC i HAFSC zużywają glukozę w znacznie wolniejszym tempie niż transformowane linie komórkowe, takie jak CHO, 293 czy hybridomy. Tworzenie sferoidów jest typowe dla MSC i HAFSC, a także dla innych typów komórek (Rycina 3). Codzinne monitorowanie poziomu glukozy dostarcza wiarygodnej miary stanu zdrowia i aktywności metabolicznej hodowli. Standardowe, komercyjnie dostępne pożywki xeno-free były z powodzeniem stosowane w przypadku MSC i HAFSC. Objętości zbiorów wynoszą około 20 mL. Optymalne są 24-godzinne odstępy między zbiorami, ponieważ stężenia EV osiągają maksimum po 24 h (Rycina 4). Typowe stężenia egzosomów w zebranej pożywce wynoszą od 1–5 × 1012 cząsteczek/mL, w zależności od typu komórek, liczby zasianych komórek i innych czynników, co może skutkować powstaniem widocznych osadów po wirowaniu (Rycina 5). Można zasiewać dużą liczbę komórek; liczba ta powinna opierać się na liczbie komórek, a nie na powierzchni hodowli (Rycina 6).
Wyniki wykazują, że produkcja EV koreluje z aktywnością metaboliczną mierzoną zużyciem glukozy, co zapewnia praktyczny parametr do monitorowania i optymalizacji wydajności hodowli. Codzienne zbieranie w odstępach 24 h maksymalizuje stężenie EV przy jednoczesnym zachowaniu stabilności hodowli. Otrzymane wyniki wspierają wykorzystanie monitorowania glukozy i kontrolowanej częstotliwości zbiorów jako kluczowych parametrów dla powtarzalnej produkcji EV w bioreaktorach z włóknami kapilarnymi.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71420/71420fig1v1.jpg" /> 
Rysunek 1: Przekrój bioreaktora z włóknami kapilarnymi. Pożywka przepływa przez wnętrza włókien, a komórki przytwierdzają się do ich zewnętrznej strony. Składniki o niskiej masie cząsteczkowej, takie jak glukoza i mleczan, mogą łatwo przenikać przez włókna. Produkty wydzielnicze, takie jak EVs, nie mogą przenikać przez włókna i stają się silnie skoncentrowane w obszarze na zewnątrz włókien, zwanym ECS (przestrzeń pozakapilarna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71420/71420fig1v1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71420/71420fig2v1.jpg" /> 
Rycina 2: Zdjęcie wkładu z oznaczonymi portami i zaciskami. Zawory zwrotne na drodze przepływu generują recyrkulację pożywki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71420/71420fig2v1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71420/71420fig3v1.jpg" /> 
Rysunek 3: Mezenchymalne komórki macierzyste, ludzkie komórki macierzyste z płynu owodniowego, progenitory serca oraz niektóre inne typy komórek tworzą sferoidy po wysianiu do kartridża w odpowiedniej liczbie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71420/71420fig3v1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71420/71420fig4v3.jpg" /> 
Rycina 4: Pomiar stężeń EV po zbiorach w różnych odstępach czasu. Po 24 h stężenie EV osiąga wartość maksymalną. Optymalny czas zbioru to 24 h. (Dane udostępnione przez Paolo Neviani, EV core, Children’s Hospital of Los Angeles). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71420/71420fig4largev3.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71420/71420fig5v1.jpg" /> 
Rycina 5: Zbiór EVs z komórek DIFI hodowanych w bioreaktorze z pustymi włóknami C2011 z jednego tygodnia. EVs wyizolowane metodą wirowania różnicowego. (dane udostępnione przez Jeffa Franklina, Vanderbilt University)18,19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71420/71420fig5v1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71420/71420fig6v2.jpg" /> 
Rysunek 6: Do bioreaktora z włóknami kapilarnymi można wprowadzić zaskakująco dużą liczbę komórek. MSC zajmują dużą powierzchnię w hodowli 2-D; w przypadku hodowli 3-D w formie sferoidów zajmują one mniej miejsca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71420/71420fig6v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Podane są instrukcje dotyczące konfiguracji i używania 3D bioreaktora z przepływowymi włóknami do produkcji pęcherzyków pozakomórkowych z MSC i innych typów komórek. Ten protokół opisuje metodę produkcji pęcherzyków pozakomórkowych w wysokich stężeniach w sposób ciągły, kontrolując jednocześnie gęstość komórek w bioreaktorach z przepływowymi włóknami.

Dużoskalowowa Produkcja Wezykuł Pozakomórkowych z Gęstych 3D Kultur Komórkowych w Bioreaktorach Perfuzyjnych z Włóknami Pustkowymi

Progress in the field of exosome research is hindered by the small cell numbers and low productivity of secreted exosomes in traditional 2-D cell culture. ...

large-scale-production-extracellular-vesicles-from-high-density-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W przeszłości wiele systemów hodowli in vitro – głównie hodowle monowarstwowe – często obarczonych było wadą polegającą na tym, że zróżnicowane komórki pierwotne miały stosunkowo krótki czas życia i ulegały dedyferencjacji podczas hodowli. W konsekwencji większość ich funkcji swoistych dla danego organu była szybko utracona. Aby zatem odtworzyć lepsze warunki dla tych komórek in vitro, wprowadzono modyfikacje i adaptacje do konwencjonalnych hodowli monowarstwowych.

Wywiad: Bioreaktory i rusztowania 3D z modyfikowaną powierzchnią w badaniach nad komórkami macierzystymi

Funkcjonalne zachowanie komórek w hodowli można poprawić poprzez hodowlę w bardziej podobnych do in vivo 3-wymiarowych środowiskach hodowli16-21. Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i działanie systemu bioreaktora z pustymi włóknami do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo.

Bioreaktory z pustych włókien do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Ten artykuł przedstawia metodę budowy i obsługi taniego, wielokanałowego systemu hodowli komórek perfuzyjnych do pomiaru dynamiki wydzielania i szybkości wchłaniania substancji rozpuszczonych w procesach komórkowych. System może również wystawiać komórki na działanie dynamicznych profili bodźców.

Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

FiberCell Systems Inc..  Instructions are provided for setting up and using a 3D perfusion hollow fiber bioreactor for extracellular vesicle production from MSC and other cell types. This protocol describes a method for producing extracellular vesicles at high concentrations on a continuous basis while controlling cell density in hollow fiber bioreactors.

Dużoskalowowa Produkcja Wezykuł Pozakomórkowych z Gęstych 3D Kultur Komórkowych w Bioreaktorach Perfuzyjnych z Włóknami Pustkowymi

Przeglądaj więcej filmów