ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Centrum Biologii Nowotworów i Terapii Precyzyjnej Uniwersytetu Medycznego w Chinach w ramach Programu Centra Badawczych Obszarów Priorytetowych w ramach Projektu Higher Education Sprout Ministerstwa Edukacji (MOE) na Tajwanie (CBPTC-PROJ-5-2).
Dziękujemy Centrum Biologii Nowotworów i Terapii Precyzyjnej za zapewnienie finansowania oraz wsparcia akademickiego.

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Perou, C. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).</li><li>Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer.">Triple-negative breast cancer.</a> N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+Clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+distant+recurrence+and+clinical+outcomes+in+patients+with+metastatic+triple-negative+breast+cancer:+High+incidence+of+central+nervous+system+metastases.">Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases.</a> Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).</li><li>Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+landscape+of+triple-negative+breast+cancer+-+expanded+options,+evolving+needs.">Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs.</a> Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).</li><li>Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+function+of+tumor-associated+macrophages+as+a+key+determinant+of+tumor+progression+control:+A+review.">Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review.</a> J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+tools+and+targets+in+cancer+therapy.">Macrophages as tools and targets in cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).</li><li>Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd24a+knockout+results+in+an+enhanced+macrophage-+and+cd8&#x207A;+t+cell-mediated+anti-tumor+immune+responses+in+tumor+microenvironment+in+a+murine+triple-negative+breast+cancer+model.">Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8&#x207A; t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model.</a> J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).</li><li>Majeti, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+is+an+adverse+prognostic+factor+and+therapeutic+antibody+target+on+human+acute+myeloid+leukemia+stem+cells.">CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells.</a> Cell. 138 (2), 286-299 (2009).</li><li>Barkal, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24+signalling+through+macrophage+siglec-10+is+a+target+for+cancer+immunotherapy.">CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy.</a> Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24-siglec+axis+is+an+innate+immune+checkpoint+against+metaflammation+and+metabolic+disorder.">CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder.</a> Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).</li><li>Chan, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+novel+role+of+CD24+as+an+oncogenesis+regulator+and+therapeutic+target+for+triple-negative+breast+cancer.">Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).</li><li>Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+CD24+function+on+tumor+and+immunotherapy.">Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy.</a> Front Immunol. 15, 1367959 (2024).</li><li>Weiskopf, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+critical+effectors+of+antibody+therapies+for+cancer.">Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer.</a> MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+antibody-dependent+cellular+phagocytosis+for+effective+macrophage-based+cancer+immunotherapy.">Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy.</a> Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Denardo, D. G., Ruffell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+regulators+of+tumour+immunity+and+immunotherapy.">Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).</li><li>Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+3d+imaging+of+phagocytosis+by+mouse+macrophages.">Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages.</a> J Vis Exp. (140), e57566 (2018).</li></ol>

Autorzy nie wykazują żadnego konfliktu interesów.

Kilka etapów w niniejszym protokole ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Po pierwsze, jakość i czystość izolacji PBMC bezpośrednio wpływają na wydajność uzyskiwania makrofagów oraz efektywność ich różnicowania. Staranne warstwowanie rozcieńczonej krwi nad gradientem Ficoll oraz wirowanie z wyłączonym hamulcem są niezbędne dla zachowania interfejsu warstwy leukocytarnej (buffy coat). Niepełna liza RBC lub zbyt długa inkubacja z buforem lizującym obniży żywotność PBMC. Po drugie, polary...

Rak piersi jest najczęściej diagnozowanym nowotworem złośliwym u kobiet na całym świecie, odpowiadając za około 2,3 miliona nowych przypadków rocznie1. Choroba ta jest klinicznie heterogenna i klasyfikowana jest co najmniej na cztery główne podtypy molekularne w zależności od statusu receptorów hormonalnych — receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PR) — oraz ekspresji onkogenu ludzkiego receptora czynnika wzrostu naskórka 2 (HER2)2. Guzy luminalne typu A wykazują ekspresję ER i/lub PR bez nadekspresji HER2 (ER/PR+ i HER2−); guzy luminalne typu B koekspresują ER/PR oraz HER2 (ER/PR+ i HER2+); guzy HER2+ charakteryzują się wysoką ekspresją HER2 niezależnie od statusu receptorów hormonalnych; natomiast potrójnie ujemny rak piersi (TNBC) cechuje brak ekspresji wszystkich trzech markerów (ER−, PR− i HER2−)2,3. Wśród tych podtypów TNBC stanowi najbardziej problematyczną klinicznie formę i odpowiada za około 15%–20% wszystkich przypadków raka piersi. Pacjentki z TNBC wykazują najbardziej agresywny przebieg choroby, z najgorszym rokowaniem i najkrótszym 5-letnim przeżyciem całkowitym, co wynika ze słabej odpowiedzi na konwencjonalną chemioterapię oraz braku skutecznych terapii celowanych3,4. Ponadto TNBC wykazuje znacząco wysoką skłonność do przerzutów do narządów wewnętrznych, w szczególności do płuc w ciągu 5 lat od diagnozy, a pacjentki z zaawansowanym lub przerzutowym TNBC (mTNBC) mają medianę przeżycia, która rzadko przekracza 2 lata5,6. Statystyki te podkreślają krytyczną i niezaspokojoną potrzebę opracowania nowych strategii terapeutycznych dla TNBC.
Mikrośrodowisko guza (TME) odgrywa kluczową rolę w progresji raka piersi i unikaniu odpowiedzi immunologicznej. Makrofagi związane z guzem należą do najliczniejszych komórek odpornościowych w TME i zostały ostatnio uznane za krytyczne mediatory wrodzonej odporności przeciwnowotworowej7,8,9. Choć historycznie makrofagi związane z guzem dzielono na prozapalne stany „M1” i pronowotworowe „M2”, ten binarny model nie oddaje rzeczywistego zakresu heterogeniczności makrofagów. Zamiast tego makrofagi te zajmują dynamiczne spektrum funkcjonalne, ewoluując w odpowiedzi na różnorodne sygnały biochemiczne w TME. W tym złożonym krajobrazie komórki nowotworowe aktywnie neutralizują aktywność makrofagów poprzez różne strategie unikania odpowiedzi immunologicznej, w szczególności poprzez nadekspresję sygnałów typu „don’t eat me” (nie jedz mnie). Oś CD47/SIRPα była pierwszym zidentyfikowanym w tym kontekście wrodzonym punktem kontrolnym odporności6,10, a ostatnio CD24 wyłonił się jako nowy i potężny sygnał antyfagocytyczny11,12. CD24 jest małą i silnie glikozylowaną glikoproteiną mucynową zakotwiczoną w błonie komórkowej za pomocą wiązania glikozylofosfatydyloinozytoli13. Jest on ekspresowany w różnych liniach komórek odpornościowych w warunkach fizjologicznych, ale często wykazuje nadekspresję w guzach litych, w tym w raku piersi, jajnika, trzustki i raku jelita grubego14. W komórkach nowotworowych CD24 wiąże się z receptorami hamującymi lektyny wiążące kwas sjalowy z immunoglobuliny 10 (Siglec-10) ekspresowanymi na makrofagach. Interakcja ta wywołuje fosforylację domen motywu hamującego opartego na tyrozynie (ITIM) w ogonie cytoplazmatycznym Siglec-10, aktywując fosfatazy SHP-1 i SHP-2, które tłumią kaskadę sygnałową fagocytozy11. Wykazano, że blokowanie interakcji CD24/Siglec-10 za pomocą przeciwciała monoklonalnego znacząco zwiększa fagocytozę ludzkich guzów wykazujących ekspresję CD24 przez makrofagi. Nasze ostatnie badanie wykazało również, że nokaut CD24a w komórkach raka piersi zwiększa ich podatność na fagocytozę przez makrofagi w mysim modelu potrójnie ujemnego raka piersi9.
Przeciwciałozależna fagocytoza komórkowa (ADCP) jest kluczowym mechanizmem, dzięki któremu przeciwciała kierują makrofagi do fagocytowania komórek nowotworowych15,16. Po związaniu z antygenami wykazywanymi przez nowotwór, region Fc przeciwciała angażuje receptory Fcγ (FcγRs) na makrofagach, wyzwalając wewnątrzkomórkowe kaskady sygnałowe, które prowadzą do reorganizacji cytoszkieletu, tworzenia kubka fagocytowego i pochłonięcia komórki docelowej17.
W niniejszym badaniu opracowano i zwalidowano protokół obrazowania żywych komórek w trybie time-lapse do pomiaru fagocytozy komórek raka piersi przez makrofagi indukowanej przez przeciwciała. Metoda ta wykorzystuje makrofagi pochodzące z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców ludzkich, różnicowane za pomocą czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF), a następnie stymulowane lipopolisarydem (LPS) i interferonem gamma (IFN-γ). Analiza cytometryczna potwierdziła nadekspresję CD80 w populacji CD11b⁺ po stymulacji (Rysunek 1), co potwierdza klasycznie aktywowany fenotyp. Stan aktywacji ten nadaje silną zdolność do fagocytozy zapośredniczonej przez przeciwciała, co czyni tę metodę odpowiednią do oceny fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP). Jako komórki docelowe wykorzystano komórki raka piersi CD24-dodatnie znakowane GFP, które przed kokulturą zostały opsonizowane terapeutycznym monoklonalnym przeciwciałem anty-CD24. Zdarzenia fagocytarne rejestrowano przez okres 16 h za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Aby umożliwić ilościową ocenę równolegle z dynamiczną wizualizacją, przeprowadzono oddzielny test końcowy w identycznych warunkach kokultury, co pozwoliło na rygorystyczny pomiar fagocytozy po usunięciu niezinternalizowanych komórek docelowych. Niniejszy protokół stanowi ustandaryzowaną, powtarzalną i wizualnie informatywną platformę do oceny ADCP zapośredniczonej przez przeciwciało anty-CD24. Co istotne, integracja obrazowania time-lapse z komplementarną strategią ilościową opartą na pomiarze końcowym umożliwia jednoczesną ocenę kinetyki i skali fagocytozy. Metodę tę można zaadaptować do badania innych celów immunoterapeutycznych skierowanych przeciwko makrofagom. Protokół ten jest najbardziej odpowiedni do oceny ADCP zapośredniczonej przez terapeutyczne przeciwciała monoklonalne przeciwko antygenom powierzchniowym komórek nowotworowych. Nadaje się on do porównawczego przesiewu kandydackich przeciwciał, charakterystyki zależności dawka-odpowiedź oraz badań mechanistycznych nad oddziaływaniem Fc–FcγR, w tym wpływu blokady sygnałów typu „don’t-eat-me” (np. CD47–SIRPα). Ponieważ test wykorzystuje pierwotne ludzkie makrofagi, jest on również odpowiedni do badań translacyjnych wymagających oceny zmienności międzyosobniczej dawców przed etapem rozwoju klinicznego.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Generowanie i walidacja za pomocą cytometrii przepływowej makrofagów stymulowanych IFN-γ/LPS pochodzących z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Panel górny: Mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) są izolowane od zdrowych dawców metodą wirowania w gradiencie gęstości z użyciem roztworu Ficoll przy 400 × g przez 30 min w 20°C, przy czym wszystkie odczynniki są uprzednio wyrównane do temperatury 20°C ± 2°C. Izolowane PBMC są hodowane w medium ImmunoCult-SF uzupełnionym o 100 ng/mL czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF) przez 7 dni w celu indukcji różnicowania makrofagów (Dzień 0–7), z uzupełnieniem medium w Dniu 5. W Dniu 8 zróżnicowane makrofagi są stymulowane 100 ng/mL IFN-γ oraz 1 µg/mL LPS przez 48 h (Dzień 8–10). Następnie komórki są poddawane analizie cytometrycznej. Panel dolny: Analiza cytometrii przepływowej makrofagów. Komórki barwiono panelem powierzchniowym składającym się z CD11b-FITC, CD80-PE i CD206-PerCP-Cy5.5, a następnie dodano DAPI przed akwizycją w celu wykluczenia martwych komórek. Strategia bramkowania: W pierwszej kolejności wybrano bramkę dla komórek żywych (DAPI⁻), a następnie zidentyfikowano komórki CD11b⁺ na wykresie CD11b-FITC względem FSC-A, aby potwierdzić tożsamość makrofagów. Żywe zdarzenia CD11b⁺ analizowano następnie na wykresie kropkowym CD80 względem CD206, aby potwierdzić populację CD80⁺CD206⁻ indukowaną stymulacją IFN-γ/LPS. Po prawej: Reprezentatywny wykres kropkowy CD11b-FITC względem FSC-A wykazujący, że 99,8% bramkowanych komórek było CD11b⁺, co potwierdza tożsamość makrofagów. Po lewej: Większość komórek CD11b⁺ znalazła się w bramce CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2%), co wskazuje na oczekiwany fenotyp prozapalny w zastosowanych warunkach stymulacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Użytkownicy powinni wziąć pod uwagę kilka ograniczeń podczas stosowania tej techniki. Po pierwsze, zmienność dawców w przypadku makrofagów pochodzących z PBMC może wprowadzać znaczące różnice w wynikach fagocytozy, dlatego zaleca się wykorzystanie wielu dawców (n ≥ 3) z raportowaniem danych poszczególnych dawców obok wyników zbiorczych. Po drugie, format kokultury 2D nie odtwarza mikrośrodowiska guza, a uzyskane wyniki powinny zostać zwalidowane w modelach 3D lub in vivo przed wyciągnięciem wniosków klinicznych. Po trzecie, 16-godzinne okno obrazowania rejestruje wczesne zdarzenia fagocytarne, ale nie odzwierciedla procesów długoterminowych, takich jak prezentacja antygenu czy wtórna aktywacja immunologiczna. Zatem połączone zastosowanie obrazowania w czasie rzeczywistym i kwantyfikacji końcowej zapewnia komplementarne ramy, które zwiększają zarówno interpretowalność, jak i powtarzalność pomiarów ADCP.

<table><tbody><tr><td>Roztwór stokowy kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) 0,5 M</td><td>Sigma-Aldrich (lub odpowiednik)</td><td>E7889 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowany do przygotowania 10 mM roboczego roztworu EDTA w PBS do odrywania komórek</td></tr><tr><td>płytki 24-dołkowe do hodowli tkanek (poddane obróbce TC)</td><td>Corning (lub odpowiednik)</td><td>3524</td><td>Stosowane do kokultury makrofagów i komórek nowotworowych podczas testu fagocytozy</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD206 przeciwko ludzkiemu antygenowi (cytometria przepływowa)</td><td>BioLegend (lub odpowiednik)</td><td>321122 (lub odpowiednik)</td><td>Marker alternatywnego fenotypu makrofagów</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-CD24 przeciwko ludzkiemu antygenowi</td><td>Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)</td><td>MA1-91384 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowane do opsonizacji komórek nowotworowych w celu wywołania fagocytozy zależnej od przeciwciał</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system obrazowania żywych komórek z komorą kontroli parametrów środowiskowych (np. Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (lub odpowiednik)</td><td>Automatyczny mikroskop BioTek Lionheart FX</td><td>Umożliwia długoterminowe obrazowanie time-lapse w kontrolowanej temperaturze i &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; warunki</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania służące do zautomatyzowanego obrazowania żywych komórek (np. Gen5)</td><td>Agilent Technologies (lub odpowiednik)</td><td>N/A</td><td>Służy do akwizycji i analizy danych obrazowania poklatkowego (time-lapse)</td></tr><tr><td>Wirówka (rotor z koszyczkami wahadłowymi)</td><td>Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)</td><td>Wirówka Multifuge X4R Pro z rotorem TX-1000 (lub odpowiednikiem)</td><td>Stosowane do izolacji PBMC oraz w etapach płukania komórek</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkubator (37&amp;deg;C, 5% &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)</td><td>Forma Direct Heat &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Inkubator (lub odpowiednik)</td><td>Zapewnia warunki fizjologiczne dla hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; zasilanie gazem z regulatorem</td><td>Agilent Technologies (lub odpowiednik)</td><td>Ze względu na brak treści źródłowej, nie mogę wykonać tłumaczenia. Proszę o dostarczenie tekstu do przetłumaczenia.</td><td>Materiały i odczynniki &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do kontroli warunków środowiskowych inkubatora i systemu obrazowania</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (15 ml i 50 ml)</td><td>Corning (lub odpowiednik)</td><td>352070 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowane do izolacji, przemywania i odwirkowywania PBMC</td></tr><tr><td>probówki do pobierania krwi powlekane EDTA (vacutainery)</td><td>BD Biosciences (lub odpowiednik)</td><td>367863 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowane do pobierania próbek krwi pełnej od dawców</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (lub odpowiednik)</td><td>17144003 (lub odpowiednik)</td><td>Medium do gradientowej wirowania w celu izolacji PBMC</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy (np. FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (lub odpowiednik)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Stosowane do analizy fenotypowej makrofagów</td></tr><tr><td>Kulek kompensacyjnych (cytometria przepływowa)</td><td>Biolegend (lub odpowiednik)</td><td>424602</td><td>Stosowane do kontroli kompensacji jednobarwnej</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD11b przeciwko ludzkiemu białku znakowane FITC (cytometria przepływowa)</td><td>BioLegend (lub odpowiednik)</td><td>101205 (lub odpowiednik)</td><td>Marker stosowany do identyfikacji makrofagów</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD80 znakowane PE (cytometria przepływowa)</td><td>BioLegend (lub odpowiednik)</td><td>375410 (lub odpowiednik)</td><td>Marker związany z fenotypem aktywowanych makrofagów</td></tr><tr><td>linia komórkowa raka piersi (MDA-MB-468) wykazująca ekspresję GFP</td><td>ATCC (lub odpowiednik)</td><td>HTB-132 (lub odpowiednik)</td><td>Komórki docelowe użyte w teście fagocytozy; GFP umożliwia wizualizację</td></tr><tr><td>pożywka do makrofagów ImmunoCult-SF</td><td>STEMCELL Technologies (lub odpowiednik)</td><td>10961 (lub ekwiwalent)</td><td>Pożywka bezsurowicza stosowana do różnicowania makrofagów</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)</td><td>12100046</td><td>Stosowane do hodowli i resuspensji komórek nowotworowych</td></tr><tr><td>Przeciwciało kontrolne izotypowe (IgG)</td><td>Bio X Cell (lub odpowiednik)</td><td>BE0297 (lub odpowiednik)</td><td>Kontrola negatywna dla testu fagocytozy zależnej od przeciwciał</td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (lub odpowiednik)</td><td>L2630 (lub odpowiednik)</td><td>Bodziec stosowany do aktywacji makrofagów w połączeniu z IFN-&amp;gamma;</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki interferon gamma (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (lub odpowiednik)</td><td>78020 (lub odpowiednik)</td><td>Cytokina stosowana do aktywacji makrofagów</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (lub odpowiednik)</td><td>78057 (lub odpowiednik)</td><td>Czynnik wzrostu stosowany do różnicowania makrofagów</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura lub pipety serologiczne</td><td>Jetbiofil (lub odpowiednik)</td><td>GSP010010 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowane do manipulacji cieczami podczas izolacji PBMC oraz hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>PBS (bez Ca2+)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-wolny)</td><td>Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)</td><td>BP399-500 (lub odpowiednik)</td><td>Bufor stosowany do przemywania komórek i etapów rozcieńczania</td></tr><tr><td>szalki Petriego (100 mm, bez)&amp;ndash;(przetraktowane w celu hodowli tkankowej)</td><td>Corning (lub odpowiednik)</td><td>430591</td><td>Stosowane do różnicowania makrofagów poprzez selekcję przez adhezję</td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek (erytrocytów)</td><td>BioLegend (lub odpowiednik)</td><td>420301 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowane do usuwania erytrocytów podczas izolacji PBMC</td></tr><tr><td>Barwnik do utrwalania Viability 405/452</td><td>Miltenyi Biotec (lub odpowiednik)</td><td>130-130-404 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowane do oceny żywotności komórek podczas analizy cytometrycznej</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (lub odpowiednik)</td><td>D9542 (lub odpowiednik)</td><td>Stosowane do wykluczania martwych komórek w cytometrii przepływowej</td></tr></tbody></table>

obrazowanie time-lapse fagocytozy komórek trzykrotnie ujemnego raka piersi znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym przez makrofagi indukowaną przeciwciałami

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

Przeciwciałozależna fagocytoza komórkowa jest kluczowym mechanizmem, dzięki któremu makrofagi pochłaniają upropzonizowane przeciwciałami komórki nowotworowe. Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek w czasie (time-lapse), służącą do wizualizacji przeciwciałozależnej fagocytozy przez makrofagi komórek potrójnie ujemnego raka piersi wykazujących ekspresję CD24 i znakowanych zieloną białkiem fluorescencyjnym. Makrofagi są otrzymywane z mononuklearnych komórek krwi obwodowej człowieka, różnicowane przy użyciu czynnika stymulującego kolonie makrofagów oraz polaryzowane za pomocą interferonu gamma i lipopolisacharydu w celu uzyskania fenotypu prozapalnego. Komórki nowotworowe są upsonizowane przeciwciałem monoklonalnym anty-CD24 przed kokulturą z makrofagami w określonym stosunku efektor do celu. Zdarzenia fagocytarne są rejestrowane przez okres 16 h przy użyciu zautomatyzowanego mikroskopu wyposażonego w system kontroli środowiskowej w celu utrzymania warunków fizjologicznych. Obrazowanie przeprowadzane jest w kanałach jasnego pola i fluorescencji, co umożliwia identyfikację komórek nowotworowych oraz monitorowanie ich internalizacji przez makrofagi. Reprezentatywne obrazy time-lapse demonstrują postępujące pochłanianie fluorescencyjnych komórek nowotworowych w czasie. W celu umożliwienia oceny ilościowej przeprowadzany jest równolegle test końcowy w identycznych warunkach kokultury, w którym przed obrazowaniem usuwane są niezinternalizowane komórki nowotworowe, co pozwala na dokładny pomiar zdarzeń fagocytarnych. Metoda ta zapewnia standaryzowane i powtarzalne podejście do wizualizacji przeciwciałozależnej fagocytozy makrofagów in vitro. Co istotne, integracja obrazowania time-lapse z kwantyfikacją opartą na punkcie końcowym umożliwia komplementarną ocenę kinetyki i skali fagocytozy. Protokół ten wspomaga ocenę przeciwciał terapeutycznych oraz immunoterapii nowotworów skierowanych przeciwko makrofagom w kontrolowanych warunkach in vitro.

Prawidłową generację i polaryzację makrofagów z PBMC potwierdzono za pomocą oceny morfologicznej oraz analizy cytometrycznej (Rycina 1). PBMC wyizolowane metodą wirowania w gradiencie gęstości hodowano w medium z dodatkiem M-CSF, co do 7. dnia doprowadziło do uzyskania komórek przylegających o charakterystycznej morfologii makrofagów. Po stymulacji IFN-γ oraz LPS komórki wykazały fenotyp zgodny z aktywacją w zastosowanych warunkach. Analiza cytometryczna wykazała, że 99,8% wybranych komórek ...

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek w technice time-lapse w celu wizualizacji zależnej od przeciwciał fagocytozy komórek raka piersi potrójnie ujemnego znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym, z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z monocytów krwi obwodowej oraz mikroskopu zautomatyzowanego.

Obrazowanie time-lapse fagocytozy komórek trzykrotnie ujemnego raka piersi znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym przez makrofagi indukowaną przeciwciałami

Przeciwciałozależna fagocytoza komórkowa jest kluczowym mechanizmem, dzięki któremu makrofagi pochłaniają upośpione przeciwciałami komórki nowotworowe. Niniejszy protokół opisuje...

time-lapse-imaging-antibody-driven-macrophage-phagocytosis-green

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film demonstruje test do monitorowania niezależnych zdarzeń fagocytozy krwinek czerwonych (RBC) za pośrednictwem makrofagów. Mysie immunoglobuliny G (IgG) opsonizowane ludzkie erytrocyty są inkubowane z mysimi makrofagami i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Erytrocyty są pochłaniane przez makrofagi poprzez tworzenie miseczki fagocytarnej i ukierunkowane na degradację lizosomalną.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

Obrazowanie time-lapse fagocytozy komórek trzykrotnie ujemnego raka piersi znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym przez makrofagi indukowaną przeciwciałami

Przeglądaj więcej filmów