Name: In Vivo Fenotypienie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw rybki zebra z wykorzystaniem analizy behawioralnej i obrazowania wysoko-zawartościowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Odkryj wysokoprzepustowe fenotypowanie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw Danio rerio z wykorzystaniem obrazowania wysoko-zawartościowego i analizy behawioralnej. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie związków neuroprotekcyjnych w modelu choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Su Guo (University of California, San Francisco) za dostarczenie transgennych danioszek oraz dr Daeseok Eom, dr Michael Parsons i Eddie Hallo (University of California, Irvine) za dostarczenie embrionów dzikiego typu i poradztwo dotyczącego hodowli danioszek i utrzymania ryb. Dziękujemy również pracownikom Robert A. Mah Molecular Innovation Center i Falling Leaves Innovation Building (University of California, Irvine) za zapewnienie infrastruktury dla centrum hodowlano-badawczego.

<ol>
	<li>Haynes, E. M., Ulland, T. K., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+discovery:+the+role+of+imaging+established+and+emerging+non-mammalian+models+in+neuroscience.">A model of discovery: the role of imaging established and emerging non-mammalian models in neuroscience.</a> Front Mol Neurosci. 15, 867010 (2022).</li><li>Yang, W., Chen, X., Li, S., Li, X. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+large+animal+models+for+investigating+neurodegenerative+diseases.">Genetically modified large animal models for investigating neurodegenerative diseases.</a> Cell Biosci. 11 (1), 218 (2021).</li><li>Dodiya, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish-based+Parkinson&#8217;s+disease+models:+unveiling+genetic+mechanisms+and+therapeutic+pathways.">Zebrafish-based Parkinson&#8217;s disease models: unveiling genetic mechanisms and therapeutic pathways.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 24 (12), 900-920 (2025).</li><li>Wasel, O., Freeman, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+genetic+zebrafish+models+to+define+mechanisms+of+and+treatments+for+dopaminergic+neurodegeneration.">Chemical and genetic zebrafish models to define mechanisms of and treatments for dopaminergic neurodegeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (17), (2020).</li><li>Kozol, R. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+over+form:+modeling+groups+of+inherited+neurological+conditions+in+zebrafish.">Function over form: modeling groups of inherited neurological conditions in zebrafish.</a> Front Mol Neurosci. 9, 55 (2016).</li><li>Jang, H., Kim, S. H., Koh, Y., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+brain+organoids:+toward+mature+neural+circuitry+with+an+intact+cytoarchitecture.">Engineering brain organoids: toward mature neural circuitry with an intact cytoarchitecture.</a> Int J Stem Cells. 15 (1), 41-59 (2022).</li><li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases.">Use of rodents as models of human diseases.</a> J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Hasani, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+of+freely-moving+zebrafish.">Whole-brain imaging of freely-moving zebrafish.</a> Front Neurosci. 17, 1127574 (2023).</li><li>Mattern, K., von Trotha, J. W., Erfle, P., K&#x00F6;ster, R. W., Dietzel, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroExaminer:+an+all-glass+microfluidic+device+for+whole-brain+in+vivo+imaging+in+zebrafish.">NeuroExaminer: an all-glass microfluidic device for whole-brain in vivo imaging in zebrafish.</a> Commun Biol. 3 (1), 311 (2020).</li><li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+selective+plane+illumination+microscopy.">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy.</a> Front Neural Circuits. 7, 65 (2013).</li><li>Noda, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-related+motor+function+and+dopaminergic+neuronal+loss+in+C57BL/6+mice.">Aging-related motor function and dopaminergic neuronal loss in C57BL/6 mice.</a> Mol Brain. 13 (1), 46 (2020).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae.">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135 (2), 249-260 (2015).</li><li>Schallert, T., Tillerson, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+degeneration+of+dopamine+neurons+in+parkinsonism:+optimizing+behavioral+assessment+of+outcome.">Intervention strategies for degeneration of dopamine neurons in parkinsonism: optimizing behavioral assessment of outcome.</a> Cent Nerv Syst Dis. , 131-151 (2000).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Nipu, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylene+blue+at+recommended+concentrations+alters+metabolism+in+early+zebrafish+development.">Methylene blue at recommended concentrations alters metabolism in early zebrafish development.</a> Commun Biol. 8 (1), 120 (2025).</li><li>Ohnesorge, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effect+of+tricaine+(MS-222)-induced+anesthesia+on+brain-wide+neuronal+activity+of+zebrafish+larvae.">Assessment of the effect of tricaine (MS-222)-induced anesthesia on brain-wide neuronal activity of zebrafish larvae.</a> Front Neurosci. 18, 1456322 (2024).</li><li>Schroeder, A. B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+open-source+software+for+image+visualization,+processing,+and+analysis.">The ImageJ ecosystem: open-source software for image visualization, processing, and analysis.</a> Protein Sci. 30 (1), 234-249 (2021).</li><li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).</li><li>Kim, G. H. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+screen+reveals+renin-angiotensin+system+inhibitors+as+neuroprotective+via+mitochondrial+restoration+in+dopamine+neurons.">A zebrafish screen reveals renin-angiotensin system inhibitors as neuroprotective via mitochondrial restoration in dopamine neurons.</a> eLife. 10, (2021).</li><li>Kim, G. H. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dopamine+neuron+imaging-based+small+molecule+screen+identifies+novel+neuroprotective+compounds+and+targets.">In vivo dopamine neuron imaging-based small molecule screen identifies novel neuroprotective compounds and targets.</a> Front Pharmacol. 13, 837756 (2022).</li><li>Aponte, P. M., Gutierrez-Reinoso, M. A., Garcia-Herreros, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+gap:+animal+models+in+next-generation+reproductive+technologies+for+male+fertility+preservation.">Bridging the gap: animal models in next-generation reproductive technologies for male fertility preservation.</a> Life (Basel). 14 (1), (2023).</li><li>Fen, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+for+cell-based+screening+methods+in+drug+discovery.">A review for cell-based screening methods in drug discovery.</a> Biophys Rep. 7 (6), 504-516 (2021).</li></ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów finansowych.

Ten protokół oferuje skalowalny, in vivo pipeline do ilościowego określania utraty neuronów DA i przesiewowego badania związków neuroprotekcyjnych z wykorzystaniem systemu chemogenetycznego NTR–MTZ w transgenicznych rybach zebrafish. Znormalizowany, oparty na płytkach przepływ pracy został specjalnie opracowany dla zespołów badawczych na poziomie licencjackim, gdzie częstotliwość zmian operatorów jest wysoka, a doświadczenie badacza zmienia się między terminami akademickim. Każdy krok przepływu pracy został ustrukturyzow...

Badania nad odkrywaniem leków w neurodegeneracji napotykają na znaczącą przeszkodę efektywności z powodu wysokich kosztów i niskiego przepływu tradycyjnych modeli ssaków1,2, co wymaga starannego planowania eksperymentu i zatrudnienia dużej liczby osób. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie standaryzowanego, wysoko wydajnego podejścia z wykorzystaniem transgenicznego modelu ryby zebra na Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry), w którym nitroreduktaza-mCherry jest specyficznie wyrażana w dopaminergicznych (DA) neuronach w celu badania utraty neuronów DA i niedoborów lokomocji. Podstawą zastosowania tej techniki jest potrzeba rygorystycznych, skalowalnych i ekonomicznie opłacalnych modeli in vivo do badań nad neurodegeneracją3,4,5. Podczas gdy kultury komórkowe in vitro pozwalają na szybkie badanie leków, brakuje im kompletnego układu neuronowego i kontekstu całego organizmu, które są niezbędne dla istotności translacyjnej6. Natomiast modele gryzoni zapewniają doskonały kontekst fizjologiczny, ale są drogie i czasochłonne w przypadku początkowego wysoko wydajnego przesiewowego badania związków neuroprotekcyjnych7,8.
Ryby zebra posiadają szybki rozwój larw, optyczną przezroczystość, która umożliwia in vivo pełne obrazowanie mózgu oraz silne zachowanie ścieżek genetycznych istotnych dla chorób, szczególnie związanych z neurodegeneracją9,10,11. Protokół specyficznie integruje standaryzowane hodowlę, chemogenetyczną ablacje za pomocą metronidazolu (MTZ) oraz obrazowanie wysokiej zawartości sparowane z funkcjonalnym śledzeniem zachowania. Pomiar aktywności ruchowej bezpośrednio dostarcza mocnej korelacji behawioralnej do utraty neuronów DA, ponieważ utrata neuronów dopaminy jest związana z nieprawidłowościami zachowania12,13,14. Standaryzowany, oparty na płytkach format minimalizuje wariancję eksperymentalną pomiędzy operatorami, a wysoki przepływ systemu larw ryby zebra umożliwia duże wielkości prób, co razem zapewnia wystarczającą moc statystyczną do wykrycia efektów neuroprotekcyjnych. Dzięki temu protokół jest dobrze przystosowany do zastosowań wymagających skalowalnego i powtarzalnego przesiewu, w tym w ustawieniach, gdzie doświadczenie badacza może się różnić.

<table><tbody><tr><td>Adult zebrafish diet, 0.5 mm pellets</td><td>Zeigler</td><td>AH271</td><td>Stosowane do karmienia dorosłych rybek Danio w trakcie rutynowych prac hodowlańczych</td></tr><tr><td>Agarose, low melting point (LMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Stosowane do osadzania larw w studzienkach dla stabilnego pozycjonowania podczas wykonywania obrazów</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>ULINE</td><td>S-20197</td><td>Stosowane do ochrony światłoczułych odczynników takich jak MTZ podczas przygotowywania i inkubacji</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td>RRID: SCR_007358</td><td>Stosowane do opcjonalnej zautomatyzowanej analizy obrazów fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Conical tubes, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>Stosowane do przygotowywania odczynników i obsługi próbek</td></tr><tr><td>Conical tubes, 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Stosowane do przygotowywania odczynników i przechowywania roztworów</td></tr><tr><td>Crossing tanks (1.0 L)</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Stosowane do kontrolowanego hodowania rybek Danio i zbierania zarodków</td></tr><tr><td>Danio rerio (AB wild type)</td><td>&mdash;</td><td>&mdash;</td><td>Nie-transgeniczna linia kontrolna używana do walidacji specyficzności efektów zależnych od nitroreduktazy</td></tr><tr><td>Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))</td><td>&mdash;</td><td>&mdash;</td><td>Transgeniczna linia rybek Danio ekspresująca nitroreduktazę-mCherry w neuronach dopaminergicznych dla ukierunkowanej chemogenetycznej ablacji</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous (&ge;99.9%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-500ML</td><td>Rozpuszczalnik dla PTU, MTZ i związków badawczych</td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td>RRID: SCR_000441</td><td>Oprogramowanie do śledzenia zachowań używane do ilościowej oceny ruchów larw</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>RRID: SCR_003070</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazów używane do ilościowej oceny fluorescencji</td></tr><tr><td>Fine-tipped forceps or 0.25 mm probe</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI0118</td><td>Stosowane do orientacji larw podczas osadzania w agarozie</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>11845460</td><td>Stosowane do wykonywania obrazów neuronów dopaminergicznych za pomocą fluorescencji mCherry</td></tr><tr><td>Gemma Micro 150 ZF (diet for juveniles, 100&ndash;200 &mu;m)</td><td>Skretting</td><td>10818945</td><td>Stosowane do karmienia młodych rybek Danio</td></tr><tr><td>Gemma Micro 75 ZF (diet for larvae, 50&ndash;100 &mu;m)</td><td>Skretting</td><td>10818935</td><td>Stosowane do karmienia larw rybek Danio</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>RRID: SCR_002798</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej używane do analizy danych i wykresów</td></tr><tr><td>Heat block (42&deg;C and 70&deg;C capable)</td><td>Thermo Fisher</td><td>88870001</td><td>Stosowane do topienia i utrzymywania agarozy w kontrolowanych temperaturach</td></tr><tr><td>High-resolution camera (top-down mount compatible)</td><td>Basler</td><td>88-327</td><td>Stosowane do rejestracji aktywności ruchowej larw</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl), 0.1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA48-500</td><td>Stosowane do regulacji pH podczas przygotowywania tricaine</td></tr><tr><td>Incubator (28.5&deg;C, 14 h light:10 h dark photoperiod)</td><td>Millipore</td><td>Z763314</td><td>Utrzymuje kontrolowane warunki środowiskowe dla rozwoju rybek Danio</td></tr><tr><td>Instant Ocean sea salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td>Stosowane do przygotowania wody niebieskiego jaja (BEW)</td></tr><tr><td>Light diffuser sheet (or equivalent)</td><td>Edmund Optics</td><td>27-103</td><td>Stosowane do zapewnienia jednolitego oświetlenia i minimalizacji oślepiającego światła podczas nagrywania zachowań</td></tr><tr><td>Light pad</td><td>Lightcraft</td><td>LC2004LED</td><td>Zapewnia dolne oświetlenie podczas śledzenia ruchu</td></tr><tr><td>Metronidazole (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761-100G</td><td>Stosowane do chemogenetycznej ablacji neuronów dopaminergicznych</td></tr><tr><td>Methylene blue, 1% aqueous solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Dodawane do BEW aby zapobiec wzrostowi mikroorganizmów w zarodkach</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>Stosowane do porcjowania odczynników i przechowywania</td></tr><tr><td>Micropipette, P200</td><td>Gilson</td><td>FP10005S</td><td>Stosowane do obsługi larw i przygotowywania roztworów</td></tr><tr><td>Petri dishes, 100 mm</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>Stosowane do zbierania zarodków i inkubacji</td></tr><tr><td>Pipette tips, 200 &mu;L</td><td>RAININ</td><td>30389188</td><td>Stosowane z mikropipetami do obsługi płynów i transferu larw</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), &ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td>Stosowane do przygotowywania buforów i roztworów wodnych</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH), 0.1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td>Stosowane do regulacji pH podczas przygotowywania tricaine</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td>Stosowane do manipulacji larw i orientacji podczas osadzania</td></tr><tr><td>Temperature-controlled heat mat (25&deg;C&ndash;28&deg;C)</td><td>Vivosun</td><td>V-SHMDT</td><td>Utrzymuje stabilną temperaturę podczas nagrywania zachowań</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Stosowane jako środek znieczulający dla larw rybek Danio</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Stosowane w przygotowaniu buforowanego roztworu tricaine</td></tr><tr><td>Water purification system</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7003T0</td><td>Stosowane do uzdatniania wody do przygotowywania roztworów</td></tr><tr><td>Zebrafish holding tanks</td><td>Aquaneering</td><td>

in vivo fenotypienie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw rybki zebra z wykorzystaniem analizy behawioralnej i obrazowania wysoko-zawartościowego

In Vivo Phenotyping of Dopaminergic Neurodegeneration in Zebrafish Larvae Using Behavioral Analysis and High-Content Imaging

Badania nad odkrywaniem leków w neurodegeneracji są ograniczone przez wysokie koszty i niską wydajność tradycyjnych modeli ssaków. Ten wąski przesmyk jest szczególnie zauważalny w badaniach nad chorobą Parkinsona, gdzie rygorystyczne i skalowalne badania nad neurodegeneracją dopaminergiczną (DA) pozostają powolne i wymagające dużych zasobów. Aby zaradzić tej luki, przedstawiamy standaryzowaną, wysokowydajną metodę fenotypową wykorzystującą transgenny model rybki labiryntowej wyrażającej nitroreduktazę w neuronach dopaminergicznych, aby badać utratę neuronów DA w ciągu pięciu dni po zapłodnieniu. Rybki labiryntowe oferują kluczowe zalety dla przekładowej neurobiologii, w tym szybki rozwój larw, optyczną przezroczystość umożliwiającą in vivo obrazowanie całego mózgu, silne zachowanie genów i szlaków istotnych dla choroby Parkinsona oraz nienaruszony układ nerwowy niedostępny w modelach hodowanych w kulturze komórkowej. Nasz protokół integruje ablacje chemogenne i obrazowanie wysoko zawartościowe, aby generować szybkie zbiory danych do przesiewów. Neurony DA są selektywnie ablatowane za pomocą metronidazolu (MTZ), powodując specyficzną i dostosowywalną neurodegenerację. Leczenie MTZ powoduje zależne od dawki zmniejszenie lokomocji zgodne z fenotypami przypominającymi bradykinezę, zapewniając mocne korelacje behawioralne z utratą komórek DA. Ponieważ choroba Parkinsona jest zasadniczo zaburzeniem ruchowym, łączymy pomiary anatomiczne z funkcjonalnymi odczytami behawioralnymi. Aktywność ruchowa jest rejestrowana bezpośrednio na płytce i ilościowo określana za pomocą zautomatyzowanego śledzenia, wyodrębniając metryki, w tym całkowitą przebytą odległość, częstotliwość zanurzeń i inicjację wybuchów. Rybki labiryntowe zapewniają wydajny i skalowalny system modelowy, w którym setki larw może być badanych jednocześnie przy minimalnym potraktowaniu. Zoptymalizowaliśmy protokół wysokowydajnego przesiewu leków na płytkach, zaprojektowany w celu zminimalizowania wariancji eksperymentalnej w badaniach licencjackich. Ta standaryzowana, płytkowa forma przesiewowa związków kandydujących do neuroprotekcji lub ratowania funkcji zapewnia, że dane zebrane przez różnych badaczy pozostają statystycznie porównywalne i skuteczne w identyfikowaniu kandydatów neuroprotekcyjnych, poprawiając reproduktywalność. Razem, ta metodologia zapewnia mocny, skalowalny rama dla badań nad neurodegeneracją.

Leczenie MTZ powoduje zależną od dawki utratę neuronów dopaminergicznych i zaburzenia sprawności ruchowej
Aby określić optymalne parametry ablacji neuronów DA indukowanej przez MTZ, oceniono natężenie fluorescencji, traktowane jako wskaźnik przeżywalności neuronów DA, oraz dystans lokomocyjny dla stężeń MTZ wynoszących 3, 4,5 i 9 mM po 24-godzinnej inkubacji. Każda grupa badawcza składała się z n = 10 poszczególnych larw Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) wraz z dopasowaną grupą kon...

Ten protokół zapewnia standaryzowaną, wysokowydajną metodę przesiewowego badania związków z wykorzystaniem in vivo rybek zebrafish w celu ilościowego określenia utraty neuronów dopaminergicznych i deficytów zachowania ruchowego, umożliwiając wydajne przesiewanie związków neuroprotekcyjnych.

In Vivo Fenotypienie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw rybki zebra z wykorzystaniem analizy behawioralnej i obrazowania wysoko-zawartościowego

Drug discovery research in neurodegeneration is constrained by the high cost and low throughput of traditional mammalian models. This bottleneck is ...

Nasze badania dotyczą degeneracji neuronów dopaminergicznych w chorobie Parkinsona oraz poszukiwania nowych związków neuroprotekcyjnych. Luka badawcza, którą wypełnia nasz protokół, znajduje się pomiędzy tradycyjnymi, pozbawionymi kontekstu modelami komórkowymi a powolnymi modelami opartymi na gryzoniach. Nasz model z wykorzystaniem rybek zebrafish zapewnia bardzo szybką i skalowalną metodę realizacji tych wymagających procesów odkrywania leków w schorzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona.W pierwszej kolejności należy przelać wodę z akwarium zawierającą homozygoticzne embriony transgenicznych danio pręgowanych przez filtr siatkowy o oczkach 400 µm. Następnie należy hodować je w 100-mililitrowej szalce Petri zawierającej 30 ml niebieskiej wody do jaj (blue egg water, BEW), inkubując w temperaturze 28,5 °C w cyklu 14 godzin światła i 10 godzin ciemności. Od 24 do 36 godzin po zapłodnieniu należy przygotować mieszaninę zawierającą BEW oraz 60 µl 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) o końcowym stężeniu 200 µM. Embriony należy przenieść do tej mieszaniny, aby zachować przezroczystość larw. W trzeciej dobie po zapłodnieniu, przy stałych ustawieniach mikroskopu, należy przep

in-vivo-phenotyping-dopaminergic-neurodegeneration-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten artykuł opisuje behawioralną reakcję danio pręgowanego na toksyczne związki poprzez monitorowanie lokomocji larw. W protokole przeanalizowano również przykład reakcji larw danio pręgowanego na zanieczyszczenie środowiska.

Test lokomocji larw: wysokoprzepustowa metoda badania neurobehawioralnej toksyczności związku w larwach danio pręgowanego

Źródło: Schramm, P. et al. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo neuronów móżdżku u transgenicznych larw danio pręgowanego, które wyrażają białka fluorescencyjne w neuronach Purkinjego. Proces polega na znieczuleniu larw, unieruchomieniu ich w agarozie i ostrożnym usunięciu pigmentowanej skóry w celu zwiększenia penetracji...

Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Prezentujemy komorę behawioralną przeznaczoną do oceny zdolności poznawczych. Przedstawiamy dane pokazujące, że raz zdobyty danio pręgowany pamięta zadanie 8 tygodni później. Pokazujemy również, że zegmunowany z hiperglikemią ma zmienioną wydajność poznawczą, co wskazuje, że ten paradygmat ma zastosowanie w badaniach oceniających funkcje poznawcze i pamięć.

Zadanie behawioralne trójkomorowego wyboru z wykorzystaniem danio pręgowanego jako systemu modelowego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Niniejszy protokół opisuje wstrzykiwanie domózgowo-komorowe (ICV) dorosłej danio pręgowanej neurotoksycznej 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) w brzuszne międzymózgowie (Dn) oraz ocenę upośledzenia i późniejszej regeneracji zachowania podczas pływania po zmianie za pomocą testu otwartego zbiornika, któremu towarzyszy analiza za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Ocena lokomotoryczna indukowanego przez 6-hydroksydopaminę modelu choroby Parkinsona u dorosłych ryb danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Protokół ten ustanawia paradygmat fenotypowania behawioralnego u larw danio objętych zabiegiem MPTP, aby ocenić deficyty ruchowe i niemotoryczne podobne do choroby Parkinsona.

Profilowanie fenotypowe fenotypów behawioralnych podobnych do parkinsońskiego wywołanych MPTP u larw danio pręgowanego na podstawie eksperymentu behawioralnego

Odkryj wysokoprzepustowe fenotypowanie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw Danio rerio z wykorzystaniem obrazowania wysoko-zawartościowego i analizy behawioralnej. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie związków neuroprotekcyjnych w modelu choroby Parkinsona.

In Vivo Fenotypienie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw rybki zebra z wykorzystaniem analizy behawioralnej i obrazowania wysoko-zawartościowego (Wideo) | JoVE Journal

In Vivo Fenotypienie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw rybki zebra z wykorzystaniem analizy behawioralnej i obrazowania wysoko-zawartościowego

Przeglądaj więcej filmów