Name: Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-24T12:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj oprogramowanie MMPS do ilościowej analizy morfologii mikrogleju w modelu neurozapalenia u gryzoni. To otwarte narzędzie Python umożliwia półautomatyczną analizę pojedynczych komórek bez wiedzy programistycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło zostało wsparte przez grant szkoleniowy Alzheimer’s Disease and Related Dementias T32 (T32AG052375) przyznany Uniwersytetowi Wirginii Zachodniej, grant Stroke CoBRE (P30GM159569) przyznany Uniwersytetowi Wirginii Zachodniej oraz grant National Institutes of Health R01NS19998 przyznany JDH i WJG.

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów lub interesów finansowych związanych z tą pracą.

Głównym celem tej metodologii jest rozszerzenie dostępności do analizy morfologii mikrogleju poprzez redukcję typowych barier technicznych, zachowując jednocześnie zalety uznanych podejść do oceny morfologicznej. MMPS umożliwia wykrywanie subtelnych zmian morfologicznych mikrogleju, zachowując kompatybilność z zaawansowanymi analizami, w tym z analizami fraktalnymi, szkieletowymi, otoczkowymi i Sholl. W porównaniu z wcześniej opublikowanymi podejściami, MMPS zapewnia dostępny graficzny interfejs użytkownika, zintegrowane obliczenia dla powszechnie stosowanych parametrów morfologicznych oraz eliminację wymagań dotyczących kodowania, zachowując jednocześnie kompatybilność z bardziej zaawansowanymi analizami poniżej.
Kilka krytycznych kroków metodologicznych wpływa mocno na dokładność analityczną i reproduktywalność. Wysokiej jakości obrazowanie immunofluorescencyjne (IF) jest niezbędne do niezawodnego generowania masek i obliczeń morfologicznych. Specyficzność przeciwciał jest głównym czynnikiem wpływającym na jakość obrazu, ponieważ niespecyficzne znaczenie zwiększa tło fluorescencyjne i zmniejsza separację sygnału między mikroglejem a otaczającą tkanką. Podobnie, nieoptymalne stężenia przeciwciał mogą zmniejszyć intensywność fluorescencji i zmniejszyć rozdzielczość obrazu. Pozyskiwanie obrazów Z-stack jest również krytyczne, ponieważ pominięcie obrazowania Z-stack może sztucznie zmienić pozorna złożoność rozgałęziania mikrogleju i rozprzestrzenianie procesów, tym samym uprzedniając obliczenia morfologiczne.
Kilka dodatkowych zagadnień jest ważnych podczas przetwarzania MMPS. Chociaż MMPS obsługuje przetwarzanie wsadowe obrazów, często lepiej jest optymalizować pojedyncze obrazy, ponieważ cechy tła i jakość barwienia mogą znacznie różnić się między obrazami. Jakość obrazu bezpośrednio wpływa na dokładność generowania masek; dlatego optymalizacja podczas przetwarzania wstępnego obrazów znacznie poprawia reproduktywalność i wytrzymałość analiz poniżej. Staranna selekcja soma mikrogleju jest również ważna, szczególnie unikanie komórek stykających się z granicami obrazu, ponieważ selekcja części komórek może sztucznie zmniejszać pomiary soma i zniekształcać generowaną maskę. Podczas przeglądu jakości maski należy odrzucić maski, które zawierają sąsiednie komórki, nadmierne tło lub granice obrazu. Z drugiej strony, mniejsze maski nie powinny być odrzucane wyłącznie dlatego, że nie uchwytują wszystkich dalszych procesów, ponieważ iteracyjny algorytm generowania masek celowo dostosowuje lokalne parametry progowania zgodnie z wielkością maski i regionalną intensywnością pikseli.
Ta metodologia jest bardzo elastyczna i może być zmodyfikowana, aby spełnić określone wymagania eksperymentalne. Ponieważ MMPS jest oprogramowaniem open source, platformę można rozwijać w celu analizy pojedynczych klatek Z-stack lub włączenia zautomatyzowanych algorytmów wykrywania komórek w celu stworzenia w pełni zautomatyzowanego potoku analizy morfologicznej. Ponadto, wygenerowane maski i kontury soma pozostają kompatybilne z pracami opartymi na ImageJ do analiz fraktalnych, otoczkowych, szkieletowych i Sholl. Ponieważ MMPS został opracowany w Python 3.11, dodatkowe analizy mogą być również bezpośrednio włączone do oprogramowania za pomocą powszechnie dostępnych naukowych pakietów Python bez konieczności korzystania z zewnętrznych platform oprogramowania.
Mimo tych zalet należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. MMPS został zweryfikowany za pomocą modelu neurozapalenia w określonej części mózgu u samców szczurów Sprague-Dawley, a różne regiony mózgu, modele chorobowe, gatunki lub płeć biologiczna mogą wpływać na wyniki morfologiczne. Stosowanie MMPS do alternatywnych paradygmatów eksperymentalnych powinno zatem zostać zweryfikowane poprzez badania pilotażowe lub wsparte porównaniami z poprzednią literaturą. Ponadto, obrazowanie oparte na IF niekompletnie uchwytuje trójwymiarowe struktury rozgałęziające, ponieważ procesy rozciągające się bezpośrednio nad lub pod płaszczyzną ogniskową mogą nie być wykryte na obrazach maksymalnej projekcji. Zwiększenie liczby analizowanych komórek może pomóc złagodzić to ograniczenie. MMPS pozostaje również zależny od jakości pozyskiwania obrazu, dlatego wymaga optymalizacji dla indywidualnych systemów obrazu, protokołów barwienia i preparatów przeciwciał. Obrazy o niskiej rozdzielczości mogą sztucznie powiększać wielkość maski z powodu rozmazania granic otaczających soma i ciasno upakowanych gałęzi. Z tego powodu, obecny protokół obejmuje wolno pływające metody IF i wiele opcji przetwarzania obrazów, aby zmaksymalizować jakość obrazu.
MMPS dodatkowo zachowuje pewną potencjalną zmienność zależną od użytkownika, ponieważ użytkownicy ręcznie wybierają komórki i obrysują soma. Jednak użycie kolokalizacji DAPI i Iba1 znacznie zmniejsza niejednoznaczność podczas selekcji komórek. Co więcej, zaślepiona analiza między użytkownikami wykazała minimalną zmienność między wcześniej nieprzygotowanymi użytkownikami, co wspiera reproduktywalność procesu analitycznego.
W przeciwieństwie do kilku wcześniej opublikowanych platform do morfologii mikrogleju, MMPS nie jest w pełni zautomatyzowany. Jednak taki projekt został wybrany, aby

Mikrogle to wrodzone komórki układu odpornościowego ośrodkowego układu nerwowego (CNS), które ciągle przeglądają otoczenie w poszukiwaniu patogenów i uszkodzeń tkankowych1. Po aktywacji mikrogle zawijają swoje wypustki i przechodzą z homeostatycznej, rozgałęzionej morfologii w ameboidny fenotyp2,3. W chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak udar niedokrwienny4,5 i choroba Alzheimera6,7, mikrogle często utrzymują stan neuroinflamacji poprzez ciągłą produkcję cytokin, rozległą degradację tkanki i fagocytozę2. Te procesy przyczyniają się do zaburzenia jednostki neuronaczyniowej, co jeszcze bardziej nasila aktywację mikrogli i uszkodzenie CNS8, co sprawia, że mikrogle są obiecującymi celami terapeutycznymi9,10.
Jedna z metod identyfikacji subtelnych różnic między subpopulacjami mikrogli w chorobach neurodegeneracyjnych polega na analizie morfologicznej. Zwykle wykonuje się ją za pomocą zwierząt Cx3CR1-GFP z mikroskopią dwufotonową in vivo11 lub poprzez oznaczanie fluorescencyjnym (IF) uznanych markerów mikrogli, takich jak jonizowana cząsteczka łącząca wapń-1 (Iba1) lub receptor purynergiczny P2Y12. Chociaż mikrogle często przechodzą między homeostatycznymi i ameboidnymi morfologiami po urazie, poprzednie badania wykazały, że mikrogle mogą również przyjąć dodatkowe fenotypy, w tym hiper-rozgałęzione mikrogle3,13, mikrogle sześciokątne3,14, mikrogle reaktywne15 i mikrogle prętowate3,16. Jednak badania morfologii mikrogli często polegają na ręcznej klasyfikacji fenotypu homeostatycznego i ameboidnego. Takie podejścia wymagają specjalistycznych pipeline'ów analitycznych, które często brakuje standaryzacji między laboratoriami i utrudniają różnicowanie podobnych morfologii, takich jak fenotypy homeostatyczne i hiper-rozgałęzione, nawet dla wyszkolonego personelu17. Ponadto analiza oparta na IF subtelnych zmian morfologicznych wymaga obrazowania wysokiej rozdzielczości, co może stwarzać dodatkowe wyzwania techniczne.
Aby zapobiec tym ograniczeniom, opracowano kilka platform analitycznych, które pół-automatycznie11 lub automatycznie18 wykrywają mikrogle i generują wiele binarnych reprezentacji komórek, zwanych "maskami", na obszarach docelowych zdefiniowanych przez użytkownika (np. 200–800 μm2). Takie podejścia zmniejszają subiektywność użytkownika, poprawiają reprodukcyjność i zwiększają efektywność analityczną. Pomimo tych postępow, wiele obecnie dostępnych platform oprogramowania ma ograniczenia, które uniemożliwiają szerokie przyjęcie, w tym brak dostępności open-source17, wymagania dotyczące doświadczenia w kodowaniu11,19,20, zależność od systemów mikroskopii dwufotonowej in vivo11,19, brak intuicyjnych interfejsów graficznych użytkownika11,21,22, wolne prędkości przetwarzania11 lub opieranie się na komercyjnych platformach oprogramowania12,19,21. Chociaż ostatnie badania zaczęły rozwiązywać kilka z tych problemów, wiele istniejących platform nadal jest słabo przystosowanych do przepływów pracy opartych na IF, które są nadal szeroko stosowane do badania morfologii mikrogli.
Prezentujemy tutaj zorientowany na użytkownika program do analizy morfologii mikrogli o nazwie Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS nie wymaga doświadczenia w kodowaniu, integruje się z uznanymi przepływami pracy opartymi na ImageJ i jest zaprojektowany specjalnie do użycia z obrazami IF. Oprogramowanie zostało opracowane w Python 3.11 i zawiera koncepcje z wcześniej opublikowanych platform morfologicznych open-source11. MMPS ma intuicyjny interfejs graficzny użytkownika, który umożliwia użytkownikom importowanie i przetwarzanie dużych partii obrazów IF przy użyciu wielu opcji przetwarzania obrazu. Platforma zawiera również ręczną selekcję komórek w celu zminimalizowania artefaktów przekształcenia wprowadzeń podczas obracania IF, a także ręczne obrysowanie somy w celu uniknięcia zawierania wypustek komórkowych w pomiarach somy. Ponadto MMPS zawiera konfigurowalne parametry generowania masek i wiele funkcji zapewniania jakości w celu poprawy dokładności maski. Oprogramowanie oblicza kilka często stosowanych parametrów morfologicznych, w tym obwód, średnią odległość centroidów, obszar maski, mimośród, okrągłość i obszar somy. Do bardziej zaawansowanych badań, wy

<table><tbody><tr><td>12-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-82</td><td>Plate used for incubation and washing of tissue sections.</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td>Used to protect fluorescent samples from light exposure.</td></tr><tr><td>Antigen Retrieval Buffer (10×)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4955-58</td><td>Used to improve antigen accessibility during immunofluorescence staining.</td></tr><tr><td>Anti-Iba1 primary antibody</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>019-19741</td><td>Primary antibody used for immunofluorescent labeling of microglia.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-710-0L</td><td>Instrument used to section frozen brain tissue at defined thicknesses.</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21428</td><td>Fluorescent secondary antibody used for visualization of rabbit primary antibodies.</td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-115</td><td>Blocking reagent used to reduce nonspecific antibody binding.</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD2000</td><td>Fluorescence microscope used for image acquisition.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) 2.16.0</td><td>NIH</td><td>fiji.sc</td><td>Image-processing platform used for downstream morphology analyses and plugins.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4959-52</td><td>Mounting medium used to preserve fluorescence and secure coverslips.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>EntirelyPets Pharmacy</td><td>MWI502017</td><td>Inhalation anesthetic used during animal procedures.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Millipore Sigma</td><td>L2630</td><td>Used to induce systemic neuroinflammation and microglial activation in rodents.</td></tr><tr><td>Matplotlib</td><td>https://pypi.org/project/matplotlib/</td><td></td><td>Python plotting library used for data visualization and figure generation.</td></tr><tr><td>MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00</td><td>This work</td><td>https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00</td><td>Open-source software platform developed for microglial morphology analysis.</td></tr><tr><td>Net wells</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3477</td><td>Inserts used to hold free-floating tissue sections during staining procedures.</td></tr><tr><td>Numpy</td><td>https://pypi.org/project/numpy/</td><td></td><td>Python library used for numerical computations within MMPS.</td></tr><tr><td>Objective lens (4×)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4922</td><td>Low-magnification objective used for anatomical orientation and region identification.</td></tr><tr><td>Objective lens (40×)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4625</td><td>High-magnification objective used for microglial morphology imaging.</td></tr><tr><td>opencv-python</td><td>https://pypi.org/project/opencv-python/</td><td></td><td>Computer vision library used for image-processing functions within MMPS.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>169650025</td><td>Fixative used for tissue perfusion and preservation prior to sectioning.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Permanent mounting medium used for slide preservation.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td>Buffer solution used for tissue washing and reagent preparation.</td></tr><tr><td>Pillow</td><td>https://pypi.org/project/Pillow/</td><td></td><td>Python imaging library used for image processing operations.</td></tr><tr><td>PyQt5</td><td>https://pypi.org/project/PyQt5/</td><td></td><td>Python GUI framework used to generate the MMPS graphical user interface.</td></tr><tr><td>Python 3.11</td><td>Python Software Foundation</td><td>python.org</td><td>Programming language environment used to develop and run MMPS.</td></tr><tr><td>R 4.3.2</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>r-project.org</td><td>Statistical software used for data analysis and graph generation.</td></tr><tr><td>Scikit-image</td><td>https://pypi.org/project/scikit-image/</td><td></td><td>Python image-analysis library used for image processing and segmentation.</td></tr><tr><td>Scipy</td><td>https://pypi.org/project/scipy/</td><td></td><td>Python scientific-computing package used for filtering and image-processing operations.</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Rats</td><td>Evingo</td><td>002</td><td>Experimental animals used for validation of the neuroinflammation model.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td>Cryoprotectant used prior to freezing brain tissue.</td></tr><tr><td>Tifffile</td><td>https://pypi.org/project/tifffile/</td><td></td><td>Python package used for reading and writing TIFF image files.</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Embedding medium used for cryosectioning frozen tissue samples.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Detergent used for membrane permeabilization during immunofluorescence.</td></tr></tbody></table>

oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (mmps): otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): An Open-Source, User-Friendly Tool for Quantitative Microglia Morphology Analysis

Mikroglia są pochodzącymi z komórek szpiku komórkami odpornościowymi ośrodkowego układu nerwowego, które pośredniczą w degradacji i przebudowie tkanek po urazie neurologicznym i stały się obiecującymi celami terapeutycznymi w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Ilościowa analiza morfologii mikroglii może ujawnić subtelne różnice między subpopulacjami mikroglii, zachowując ważne informacje in situ. Jednak wiele obecnie dostępnych platform do analizy morfologii mikroglii jest albo niedostępnych publicznie, albo wymaga specjalistycznej wiedzy komputerowej, co ogranicza ich szerokie stosowanie. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, stworzona została platforma do analizy morfologii mikroglii o nazwie Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), korzystająca z Pythona 3.11. MMPS jest kompatybilny z procesami opartymi na immunofluorescencji i nie wymaga wiedzy programistycznej do instalacji ani obsługi. Oprogramowanie semi-automatyzuje analizę morfologii pojedynczych komórek mikroglii za pomocą przystępnego graficznego interfejsu użytkownika i zawiera konfigurowalne procesy przetwarzania obrazów i generowaniu masek. Badanie polega na walidacji MMPS przy użyciu modelu neurozapalenia indukowanego lipopolisacharydem (LPS) u gryzoni. Ilościowa analiza na poziomie zwierząt wykazała, że mikroglia zwierząt leczonych LPS wykazywała znacznie większą powierzchnię somy (p < 0,01) i mniejszy obwód komórek (p < 0,05) w porównaniu z kontrolą leczoną substancją wypełniającą, co jest zgodne z cechami morfologicznymi związanymi z aktywacją mikroglii i neurozapaleniem. Ogólnie rzecz biorąc, MMPS zapewnia standaryzowaną, powtarzalną platformę do ilościowej analizy morfologii mikroglii w laboratoriach.

Opracowano otwartoźródłową, samodzielną platformę do analizy morfologii mikrogleju, nazwaną Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), aby zapewnić dostępny i ustandaryzowany proces analizy morfologii mikrogleju w oparciu o immunofluorescencję (IF). Platforma opiera się na wcześniejszych metodologiach analizy morfologicznej, nie wymaga wiedzy z zakresu programowania i posiada przystępny interfejs graficzny użytkownika. Program MMPS został zaprojektowany w celu poprawy wykrywania subtelnych rozgałęzień mikrogleju, przy jednoczesnym zastosowaniu wielu zabezpieczeń minimalizujących ryzyko przeszacowania masek mikrogleju.
MMPS zostało zwalidowane z wykorzystaniem modelu neurostanu zapalnego u gryzoni indukowanego LPS. Po obróbce tkanek i akwizycji obrazów (Rycina 1), swoistość IF potwierdzono przy użyciu przekrojów kontrolnych negatywnych, pozbawionych barwienia przeciwciałem pierwotnym (Rycina uzupełniająca 1). Przetwarzanie w MMPS rozpoczyna się od importu obrazów IF do interfejsu oprogramowania (Rycina 2A). Oprogramowanie oferuje wiele opcji przetwarzania obrazu w celu poprawy detekcji sygnału mikrogleju i separacji tła. Obowiązkowe odejmowanie tła jest wykonywane za pomocą algorytmu rolling-ball zaimplementowanego w pakiecie Scikit-image, natomiast opcjonalne filtry odszumiające i wyostrzające są dostępne poprzez filtrowanie gaussowskie oparte na SciPy. Po przetwarzaniu obrazu somy mikrogleju są zaznaczane ręcznie i identyfikowane za pomocą czerwonych znaczników wyboru (Rycina 2B). Granice som są następnie obrysowywane ręcznie w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń morfologicznych (Rycina 2C).
<img alt="Schemat procedury modelu mysiego; wstrzyknięcie LPS, perfuzja, krioprotekcja, sekcjonowanie, analiza MMPS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71566/71566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Graficzny przegląd modelu neurostanu zapalnego i procedury przetwarzania. Szczurom wstrzyknięto LPS lub PBS, a po 24 h pobrano próbki poprzez perfuzję sercową z następującą po niej dekapitacją. Wyekstrahowano mózgi i wykonano przekroje o grubości 30 µm, które następnie wykorzystano w IF dla markera mikroglei Iba1, a następnie przetworzono za pomocą MMPS. Stworzone w Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71566/71566fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające mikroglej (Iba1, DAPI) oraz analizę morfologii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71566/71566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przegląd zastosowania MMPS. (A) Przykład obrazu mikrogleju korowego (czerwony, Iba1) z jądrami komórkowymi (niebieski, DAPI) do analizy w MMPS (pasek skali = 75 µm, 40x). Po przetworzeniu obrazu za pomocą MMPS tło zostanie zredukowane, a morfologie zostaną dokładnie ocenione (B) Po przetworzeniu obrazu w MMPS somy są ręcznie zaznaczane czerwonym okręgiem do wykorzystania w kolejnych krokach szczegółowo opisanych w metodach (pasek skali = 75 µm, 40x). (C) Dwie reprezentatywne komórki mikrogleju zostały ręcznie obrysowane; poniżej przedstawiono zapisane obrazy obrysów somy. (D) Generowanie maski wybranych komórek automatycznie śledzi rozgałęzienia mikrogleju do 800 µm2, jednak wymaga to ręcznej kontroli jakości. Tutaj przedstawiono niedokładną maskę 800 µm2, a następnie dokładniejszą maskę 700 µm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71566/71566fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Po obrysowaniu somy, program MMPS iteracyjnie generuje maski w zakresie wielkości 200–800 µm2 , stosując adaptacyjne progowanie ograniczone przez zdefiniowane przez użytkownika progi minimalnej intensywności. Mniejsze maski ściślej przestrzegają zdefiniowanego progu, natomiast w przypadku większych masek ograniczenia progowe są stopniowo rozluźniane, aby zmaksymalizować uwzględnienie wypustek. Wygenerowane maski poddawane są ręcznej kontroli jakości, aby zapobiec włączeniu sąsiednich komórek, nadmiernemu uwzględnieniu tła lub ucięciu przez krawędzie obrazu lub paski skali. Jak pokazano na Rysunku 2D, maska o wielkości 800 µm2 dla reprezentatywnej komórki mikrogleju rozciągała się na sąsiednią komórkę. Odrzucenie maski 800 µm2 i wybór maski 700 µm2 pozwoliło skorygować błąd segmentacji, zachowując jednocześnie dokładne wyznaczenie granic docelowej mikroglei.
Po przetworzeniu metodą MMPS oceniono aktywację mikrogleju, wykorzystując największą zaakceptowaną maskę dla każdej komórki, ponieważ maski te najdokładniej oddawały dystalne rozgałęzienia, minimalizując jednocześnie włączanie tła. Obliczone parametry morfologiczne podsumowano w Tabeli 1 i przedstawiono na Rysunku 3. Podanie LPS istotnie zmniejszyło średnią odległość centroidu oraz obwód komórki w porównaniu z kontrolą traktowaną nośnikiem (p &lt; 0,05; Rysunek 3A,B), co jest zgodne z retrakcją wypustek mikrogleju podczas aktywacji. Nie zaobserwowano istotnych różnic w powierzchni maski, zaokrągleniu ani ekscentryczności pomiędzy grupami badawczymi (Rysunek 3C–E), pomimo wcześniejszych doniesień wiążących te parametry z fenotypami aktywowanego mikrogleju3,23. Niniejsza analiza nie posiadała mocy statystycznej pozwalającej na wykrycie subtelnych różnic w kształcie somy lub powierzchni maski, a subpopulacje mikrogleju mogą przyjmować heterogeniczne morfologie zapalne, które nie wykazują tych trendów w sposób jednolity3. Z kolei powierzchnia somy była istotnie zwiększona u zwierząt traktowanych LPS w porównaniu z grupą kontrolną z nośnikiem (p &lt; 0,01; Rysunek 3F), co dodatkowo potwierdza przebudowę morfologiczną związaną z aktywacją22.
<img alt="Wykres pudełkowy porównujący wskaźniki morfologii komórek w zależności od zastosowanego leczenia: odległość centroidu, powierzchnia, okrągłość." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71566/71566fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Porównanie parametrów morfologicznych mikrogleju. Dla wszystkich paneli przeprowadzono testy normalności (Shapiro-Wilka i Levene'a), w których we wszystkich przypadkach uzyskano wartości nieistotne (p&gt;0,05), co doprowadziło do zastosowania testów t-Studenta. Kropki reprezentują poszczególne zwierzęta (n=5 na grupę leczoną) (A) Średnia odległość centroidu była istotnie większa w grupie kontrolnej (vehicle) w porównaniu z grupą leczoną LPS. (B) Obwód komórek mikrogleju był istotnie większy w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą leczoną LPS. (C) Nie stwierdzono istotnej różnicy w powierzchni maski pomiędzy grupami leczonymi. (D) Nie stwierdzono istotnej różnicy w ekscentryczności somy pomiędzy grupami. (E) Nie ma istotnej różnicy w okrągłości somy pomiędzy grupami leczonymi. (F) Odnotowano istotny wzrost powierzchni somy w grupie LPS * p&lt;0,05, ** p&lt;0,01, *** p&lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71566/71566fig3largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Definicja</td>
			<td>Związek z aktywacją mikrogleju</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia odległość centroidów</td>
			<td>Średnia odległość najdalszej gałęzi w pozycjach: górnej, prawej, dolnej i lewej</td>
			<td>Zmniejszenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obwód</td>
			<td>Pomiar obwodu komórki</td>
			<td>Zmniejsza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pole maskowania</td>
			<td>Rzeczywisty obszar komórki, a nie obszar maski celu</td>
			<td>Zmniejszenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekscentryczność</td>
			<td>Pomiar przybliżonego wydłużenia somy komórki (0: okrągła, 1: silnie wydłużona)</td>
			<td>Zmniejszenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okrągłość</td>
			<td>Pomiar przybliżonej kolistości somy komórki (0: wydłużona, 1: kolista)</td>
			<td>Wzrosty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wielkość somy</td>
			<td>Pole powierzchni somy komórki</td>
			<td>Zwiększenia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry obliczone za pomocą programu MMPS i przewidywana zmiana w odpowiedzi na aktywację mikrogleju.Tabela podsumowuje parametry morfologiczne obliczone przez program Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), w tym obwód, średnią odległość od centroidu, powierzchnię maski, ekscentryczność, okrągłość oraz powierzchnię somy.
Następnie oceniono powtarzalność międzyużytkownikową, przekazując ten sam zestaw obrazów do niezależnej analizy osobom zaślepionym i wcześniej nieszkolonym (Supplementary Figure 2). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między użytkownikami, a wszyscy oni odtworzyli trendy morfologiczne zgodne z aktywacją mikrogleju u zwierząt traktowanych LPS.
MMPS dodatkowo umożliwia zaawansowane analizy morfologiczne w dalszych etapach. Analiza korelacyjna parametrów wygenerowanych na Rysunku 3 wykazała związki między odrębnymi cechami morfologicznymi. U szczurów traktowanych placebo zaobserwowano jedynie słabą korelację między okrągłością a obwodem mikrogleju (R2 = 0,17), natomiast u szczurów traktowanych LPS stwierdzono silniejszą korelację (R2 = 0,64), co sugeruje, że zwiększona aktywacja mikrogleju wiązała się z jednoczesnym zmniejszeniem okrągłości i obwodu (Rysunek 4A). Ponadto pole maski wykazało silne dodatnie korelacje z przeciętną odległością centroidu w obu grupach – traktowanej placebo oraz LPS (odpowiednio R2 = 0,71 i 0,88), co jest zgodne ze zmianami w złożoności rozgałęzień związanych ze stanem aktywacji mikrogleju (Rysunek 4B).
<img alt="Wykresy okrągłości względem obwodu oraz powierzchni maski względem odległości od centroidu pokazują wartości R², porównanie grup badawczych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71566/71566fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zaawansowana analiza parametrów mikrogleju. Wszystkie panele przedstawiają linie dopasowania na poziomie zwierząt, obliczone metodą zwykłych najmniejszych kwadratów, wraz z współczynnikiem determinacji (R2) oraz zacieniowanym 95% przedziałem ufności. (A) Okrągłość somy mikrogleju i całkowita długość obwodu wykazują słabą tendencję w mikrogleju z grupy nośnika (R2 = 0,17), natomiast korelacja jest silniejsza po ekspozycji na LPS (R2 = 0,64). (B) Średnia odległość od centroidu koreluje z powierzchnią mikrogleju w grupach z nośnikiem (R2 = 0,71) i LPS (R2 = 0,88). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71566/71566fig4largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Walidacja protokołu IF za pomocą kontroli negatywnej. Jeden skrawek mózgu z tego samego obszaru dla każdego szczura poddano protokołowi IF bez dodania przeciwciała pierwszorzędowego, aby potwierdzić brak autofluorescencji (pasek skali = 75 µm) (A) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej nośnikiem dla DAPI (niebieski). (B) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej nośnikiem dla Iba1 (czerwony). (C) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej nośnikiem dla DAPI (niebieski) i Iba1 (czerwony). (D) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej LPS dla DAPI (niebieski). (E) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej LPS dla Iba1 (czerwony). (F) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej LPS dla DAPI (niebieski) i Iba1 (czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71566/S1.tiff" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina dodatkowa 2: Ocena zmienności międzyużytkownikowej MMPS. Kilku oślepionych użytkowników zastosowało MMPS w tych samych próbkach z Ryciny 3, a następnie porównano wyniki na poziomie zwierząt. Dla wszystkich próbek testy normalności (Shapiro-Wilka i Levene'a) okazały się nieistotne (p&gt;0.05), co doprowadziło do zastosowania ANOVA dla pomiarów powtarzanych z post-hoc skorygowanym testem t dla par według metody Holma (p&gt;0.05). (A) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem średniej odległości centroidu (p&gt;0.05). (B) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem obwodu (p&gt;0.05). (C) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem powierzchni maski (p&gt;0.05). (D) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem ekscentryczności (p&gt;0.05). (E) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem okrągłości (p&gt;0.05). (F) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem powierzchni somy (p&gt;0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71566/S2v2.tiff" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Microglia are myeloid-derived immune cells of the central nervous system that mediate tissue degradation and remodeling following neurological injury and ...

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju, czyli MMPS, pozwala nam badać, jak ferroptoza zmienia podpopulacje mikrogleju po udarze niedokrwiennym. MMPS radzi sobie z kluczowymi węzłami w analizie mikrogleju, omijając uciążliwe wymagania dotyczące oprogramowania i wymaganą wiedzę z zakresu kodowania. Aby zacząć, otwórz repozytorium GitHub na komputerze i pobierz oprogramowanie Mapping Microglial Parameters lub MMPS jako osobny pakiet.W folderze pobrania dwukrotnie kliknij, aby uruchomić narzędzie archiwizacji, które automatycznie wypakuje skompresowany folder. Dwukrotnie kliknij ikonę aplikacji MMPS, aby zweryfikować i otworzyć pakiet MMPS. Kliknij opcję wybierz folder obrazów i przejdź przez katalog komputera, aby zlokalizować pliki projektu.Udziel uprawnień dostępu do folderu i wybierz katalog przechowywania obrazów. Następnie kliknij wybierz folder wyjściowy, a następnie wybierz katalog wyjściowy. Wybierz obraz do przetworzenia, a następnie wybierz etykietowanie obrazu.Przypisz identyfikatory zwierząt i grupy leczenia do obrazu i zapisz wejścia. Aby obliczyć rozmiar pikseli obrazu, wybierz kalibrowanie z paska skali. Wybierz punkty początkowe i końcowe paska skali oraz wprowadź znaną odległość paska skali w mikrometrach i kliknij zastosuj.Wybierz kanał fluorescencji zawierający sygnał mikrogleju. Wybierz obrazy do przetworzenia, zaznaczając pole obok każdej nazwy obrazu i przetwórz je indywidualnie, jeśli fluorescencja tła różni się między obrazami. Przejrzyj karty oryginalne, podgląd, przetworzone i maski, aby porównać etapy przetwarzania obrazu.Wybierz podgląd bieżącego obrazu, aby dostosować dodatkowe ustawienia przetwarzania. W przypadku odejmowania tła ustaw wartość kuli toczącej się między pięcioma a 150 pikselami. Aby zmniejszyć artefakty oświetlenia, użyj wartości redukcji szumów równej trzem i ustaw wartości ostrych między jednym a dwoma, aby poprawić definicję krawędzi.Po optymalizacji ustawień przetwarzania obrazu kliknij przetwórz wybrane obrazy. Następnie wybierz wskaż somas, wszystkie obrazy. Kliknij pokaż kolor C dla widoku złożenia RGB.Wybierz kanały, a następnie odznacz wszelkie nieużywane kanały, jeśli obraz jest zniekształcony w kolorze. Kliknij przyciski dostosowania wyświetlania, aby dostosować jasność kanału w widoku RGB. Wybierz somas mikrogleju wyświetlające DAPI i zjonizowany adapter wiązania wapnia, czyli IBA1, kolokalizację.Usuń niepoprawnie zaznaczony soma za pomocą klawisza backspace lub delete. Naciśnij enter lub return, aby przejść do następnego obrazu. Wybierz obrysuj somas wszystkie po zakończeniu wyboru somas.Obrysuj obwód somas każdej wybranej komórki mikrogleju z co najmniej ośmioma punktami obrysu, wykluczając wypustki komórkowe. Usuń niepoprawnie umieszczone punkty obrysu za pomocą cofnij ostatni punkt, usuń lub backspace. Naciśnij enter, return, kliknij dwukrotnie lub kliknij prawym przyciskiem myszy, aby sfinalizować obrys każdego somas.Kliknij generuj wszystkie maski po zakończeniu obrysu somas. W ustawieniach generowania masek dostosuj minimalną intensywność, aby zmniejszyć tło pikseli i zrównoważyć tłumienie tła i zachowanie gałęzi. Wybierz KA wszystkie maski, aby rozpocząć zapewnianie jakości masek i przejrzyj wszystkie maski prezentowane od największych do najmniejszych obszarów.Porównaj każdą maskę z odpowiednim mikroglejem za pomocą kart przetworzonych i maski. Aby zaakceptować maski, użyj skrótu klawiaturowego A. Aby odrzucić maski, użyj skrótu klawiaturowego R.Aby cofnąć akceptację lub odrzucenie, naciśnij B. Użyj klawiszy strzałek na klawiaturze, aby przejść przez rozmiary masek. Wybierz największą akceptowalną maskę, która dokładnie uchwyci gałęziowanie mikrogleju bez włączenia sąsiednich komórek, nadmiernego tła, krawędzi obrazu lub pasków skali. Jeśli większość jest niedokładna, użyj opcji wyczyść wszystkie maski, aby ponownie wygenerować maski z inną wartością progową.Następnie wybierz oblicz proste cechy, aby obliczyć różne parametry dla zaakceptowanych masek, a następnie kliknij OK. W przypadku dodatkowej analizy pobierz pliki pluginów fractalanalysisimagej. py, sholl. py i skeletonanalysisimagej. py. W przypadku analiz fraktalowych i powłok otworzyć i uruchomić fractalanalysisimagej. py jako plugin Fiji. Następnie wprowadź lokalizację katalogu wyjściowego. Wprowadź rozmiar pikseli i wybierz opcję największa maska tylko, aby przeanalizować największą zaakceptowaną maskę na komórkę.W przypadku analizy Sholl otwórz plik sholl. py jako plugin Fiji. Wprowadź lokalizację katalogu wyjściowego, pożądany rozmiar pikseli, rozmiar kroku.Wybierz użyj promienia somas jako promienia startowego lub wprowadź wartość stałego promienia somas, jeśli nie używane są promienie somas pochodzące z MMPS. Otwórz plik skeletonanalysisimagej. py jako plugin Fiji do analizy szkieletu.Przejrzyj i wprowadź ścieżki dla katalogu masek, katalogu wyjściowego i rozmiaru pikseli, gdy zostaniesz o to poproszony. Po zakończeniu eksportuj wszystkie wygenerowane przez pluginy wyniki jako pliki z wartości

mapping-microglial-parameters-software-mmps-an-open-source-user

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Etienne, F.  i wsp. Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania przyciągania procesów mikroglejowych w kierunku wstrzykniętego związku w wycinkach mózgu. Zawiera przegląd przygotowywania wycinków mózgu myszy, wstrzykiwania związku testowego chemoatraktantu i obrazowania znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju w celu wizualizacji ich...

Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj oprogramowanie MMPS do ilościowej analizy morfologii mikrogleju w modelu neurozapalenia u gryzoni. To otwarte narzędzie Python umożliwia półautomatyczną analizę pojedynczych komórek bez wiedzy programistycznej.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju (Wideo) | JoVE Journal

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Przeglądaj więcej filmów