ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było wspierane przez fundusze National Institutes of Health (1R01AI177469), National Science Foundation (2305182), Chan Zuckerberg Initiative i Department of Defense (DoD OC220161).

Komórki OVCAR-8 pozyskano z American Type Culture Collection (ATCC). Wszystkie procedury hodowli komórkowej przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Komórki rutynowo badano pod kątem zanieczyszczenia mycoplasmami, używając zestawu do wykrywania mycoplasmas zgodnie z instrukcją producenta.
UWAGA: Wszystkie procedury należy przeprowadzać zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. Rozpuszczalniki organiczne należy obsługiwać w dygestorium chemicznym.
1. Hodowla i przygotowanie komórek OVCAR-8 na siatkowanych szkiełkach nakrywkowych
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę kompletną, uzupełniając pożywkę RPMI-1640 o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Podgrzać pożywkę do 37°C.</li>
	<li>Hodować komórki OVCAR-8 w 10 cm szalkach hodowlanych zawierających 10 mL pożywki kompletnej. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.</li>
	<li>Przesiewać komórki, gdy około 80% powierzchni hodowli jest wizualnie zajęte przez komórki adherentne, zazwyczaj co 2 dni w opisanych warunkach hodowli.
	<ol>
		<li>Odssać pożywkę z 10 cm szalki hodowlanej i jednokrotnie wypłukać komórki 5 mL 1× roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).</li>
		<li>Dodać do szalki hodowlanej 2 mL 0,25% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez około 3 min lub do momentu, aż większość komórek wyraźnie oddzieli się od powierzchni hodowli podczas obserwacji pod mikroskopem.</li>
		<li>Dodać do szalki 8 mL uprzednio ogrzanej pożywki kompletnej, aby zneutralizować trypsynę. Używając pipety serologicznej 10 mL, delikatnie pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół około 15–20 razy w celu rozproszenia komórek.</li>
		<li>Przenieść 1 mL zawiesiny do 9 mL świeżej pożywki kompletnej.</li>
		<li>Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Nanieść 10 µL resuspendowanej zawiesiny komórkowej bezpośrednio na kasetkę do liczenia bez dodatkowego rozcieńczania i przeprowadzić liczenie komórek zgodnie z instrukcją producenta. 
		UWAGA: W niniejszym protokole nie stosowano barwników do oceny żywotności komórek, takich jak błękit trypanu. Stan komórek należy oceniać wizualnie, monitorując ich morfologię i adhezję przed trypsynizacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiać komórki na szkiełka podstawowe.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia ~1 × 106 komórek/mL za pomocą pożywki kompletnej. Obliczyć wymaganą objętość zawiesiny komórkowej, korzystając ze wzoru C1V1 = C2V2, gdzie C1 to policzone stężenie komórek, V1 to wymagana objętość zawiesiny komórkowej, C2 to stężenie docelowe, a V2 to pożądana objętość końcowa.</li>
		<li>Umieścić poszczególne siatkowe szklane szkiełka podstawowe o 28 mm średnicy i oczkach siatki 50 µm w dołkach płytki 6-dołkowej. 
		UWAGA: Szkiełka podstawowe należy wysterylizować w autoklawie przed użyciem do hodowli komórkowej. Umieścić stronę z siatką skierowaną w dół, aby zminimalizować zakłócenia wzrostu komórek.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 2 mL pożywki kompletnej i 200 µL zawiesiny komórkowej (~2 × 105 komórek/dołek). Delikatnie kołysać płytką 6-dołkową ruchem w kształcie litery „X”, aby równomiernie rozłożyć komórki na powierzchni szkiełka.</li>
		<li>Inkubować komórki przez około 15–20 h, aby umożliwić ich adhezję. 
		UWAGA: Regularnie monitorować morfologię komórek pod mikroskopem, aby zapewnić prawidłowy wzrost. W przypadku słabego wzrostu komórek sprawdzić potencjalne zanieczyszczenie mycoplasmapami za pomocą zestawu do detekcji mycoplasma.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przemywanie komórek roztworem mrabczanu amonu (AF)
UWAGA: Przed każdym użyciem należy przygotować świeży roztwór AF.
<ol>
	<li>Przygotuj izotoniczny bufor płuczący AF bezpośrednio przed użyciem. Odważ 0,45 g AF i rozpuść w 50 mL wody klasy LC/MS, aby uzyskać końcowe stężenie AF wynoszące 0,14 M (0,9% w/w). Nie koryguj wartości pH5,45. 
	UWAGA: Świeżo przygotowany roztwór AF należy wykorzystać w dniu przygotowania. Do momentu użycia roztwór należy przechowywać w temperaturze lodowej (0°C–4°C).</li>
	<li>Odsącz pożywkę hodowlaną z każdego dołka płytki 6-dołkowej. Natychmiast dodaj 2 mL zimnego roztworu AF do każdego dołka.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie podnieś z dołka każde szkiełko nakrywkowe z przytwierdzonymi komórkami, utrzymując powierzchnię pokrytą komórkami skierowaną do góry. Umieść na krótko (2–3 s) szkiełko nakrywkowe w osobnym dołku wypełnionym wcześniej 2 mL zimnego 0,9% roztworu AF.</li>
	<li>Powtórz proces płukania łącznie dwa razy, używając świeżego roztworu AF do każdego płukania. Po ostatnim płukaniu wyjmij szkiełko nakrywkowe z roztworu AF i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej w dygestorium przez około 20–30 min przed analizą DESI–MSI. 
	UWAGA: Płucz komórki delikatnie, aby uniknąć ich odrywania podczas etapu mycia.</li>
</ol>
3. Wykonanie zmodyfikowanego interfejsu MS opartego na FAIMS
<ol>
	<li>Zdemontuj adapter obudowy źródła jonów elektrody FAIMS Pro, aby uzyskać dostęp do wewnętrznego obszaru elektrody. Potwierdź, że adapter jest kompatybilny ze spektrometrami mas Thermo Orbitrap wyposażonymi w konfigurację interfejsu FAIMS Pro.</li>
	<li>Usuń komponenty elektrody FAIMS, w tym wewnętrzne przewody, zespoły elektrod, pierścienie O-ring oraz wspierające struktury wewnętrzne. Zachowaj zewnętrzną powłokę obudowy, kołnierze montażowe oraz pin detekcyjny interfejsu niezbędny do rozpoznania adaptera przez spektrometr mas.</li>
	<li>Zmodyfikuj okrągły otwór, stosując standardowe procedury obróbki mechanicznej. Powiększ otwór tak, aby zapewnić wystarczający prześwit wokół wystającego zespołu wlotu Orbitrap/lejka jonowego.</li>
	<li>Wygładź i usuń zadziory z obrobionej krawędzi po cięciu. Potwierdź, że zmodyfikowany otwór umożliwia niezakłócone ustawienie adaptera obudowy na spektrometrze mas.</li>
	<li>Zmodyfikuj długość dwóch nóżek adaptera obudowy za pomocą piły. Przytnij nóżki do końcowej długości około 2 ¼ in, aby umożliwić połączenie z płytą optyczną. 
	UWAGA: Używaj odpowiednich narzędzi obróbczych i unikaj uszkodzenia integralności strukturalnej pozostałej części obudowy.</li>
	<li>Przygotuj aluminiową płytę optyczną (10 in × 12 in × 0.5 in, otwory z gwintem 1/4"-20). Ustaw płytę optyczną poziomo pod zmodyfikowanym adapterem FAIMS.</li>
	<li>Użyj dwóch wsporników montażowych, aby połączyć zmodyfikowany adapter FAIMS z płytą optyczną. Przytnij wsporniki w razie potrzeby, aby zmniejszyć masę i umożliwić właściwe ustawienie płyty optycznej względem wlotu Orbitrap.</li>
	<li>Zabezpiecz zmodyfikowany interfejs FAIMS na płycie optycznej, używając mechanicznie kompatybilnych elementów montażowych wyrównanych z układem otworów z gwintem 1/4"-20 na płycie. Zapewnij stabilne ustawienie podczas eksperymentów obrazowania. 
	UWAGA: Upewnij się, że interfejs jest sztywno zamocowany, aby zminimalizować wibracje podczas ruchu stolika i akwizycji danych.</li>
	<li>Wytocz lub wytnij płytki rowek w płycie optycznej bezpośrednio pod obszarem styku obudowy FAIMS. Dobierz rozmiar i położenie rowka tak, aby zapewnić wystarczający prześwit dla stabilnego osadzenia i wyrównania zmodyfikowanej obudowy FAIMS względem wlotu Orbitrap. 
	UWAGA: Dopasuj rozmiar rowka do podstawy adaptera obudowy FAIMS, aby poprawić powtarzalność pozycjonowania.</li>
	<li>Wyrównaj zamontowany interfejs z wlotem spektrometru mas. Potwierdź, że zachowane kołnierze montażowe są prawidłowo osadzone na urządzeniu i że płyta optyczna pozostaje w poziomie pod interfejsem.</li>
	<li>Przed instalacją rozpylacza DESI zweryfikuj, czy zmodyfikowany okrągły otwór zapewnia niezakłócony prześwit wokół zespołu wlotu Orbitrap/lejka jonowego.</li>
</ol>
4. Montaż rozpylacza DESI i interfejsu Orbitrap
<ol>
	<li>Zamontuj rozpylacz DESI w zintegrowanym układzie składającym się z dostosowanej ramy FAIMS, zmotoryzowanego stołu XYZ, regulatora gazu i płyty optycznej. Użyj zmotoryzowanego stołu sterowanego przez kontroler CONEX-MFACC.</li>
	<li>Zdefiniuj oś x jako kierunek skanowania rastrowego od lewej do prawej, a oś y jako kierunek kroku linii od góry do dołu. Ustaw pozycję osi z przed akwizycją i utrzymuj ją na stałym poziomie podczas obrazowania.</li>
	<li>Zastosuj zakres ruchu stołu wynoszący około 1 mm w kierunku x i 1 mm w kierunku y. Nie stosuj ruchu w osi z podczas akwizycji.</li>
	<li>Ustaw rozpylacz DESI pod kątem około 70° względem powierzchni próbki. Umieść próbkę bezpośrednio pod rozpylaczem i ustaw końcówkę rozpylacza jak najbliżej wlotu Orbitrap, unikając jednak kontaktu fizycznego.</li>
	<li>Podłącz metalowe uziemienie DESI do źródła uziemienia pod spektrometrem mas. Kontroluj ruch rastrowy za pomocą oprogramowania do sterowania stołem (Rycina 1). 
	UWAGA: Rozpylacz DESI użyty w tym badaniu jest dostępny wyłącznie dla użytkowników posiadających instrumenty DESI–MSI.</li>
	<li>Do ruchu i pozycjonowania stołu użyj zmotoryzowanego kontrolera stołu XYZ. Przed uruchomieniem podłącz linię napięcia, linię azotu, linię rozpuszczalnika oraz linię uziemiającą.</li>
	<li>Zainstaluj wykonaną na zamówienie rurkę transferową jonów ze stali nierdzewnej (1/16 in OD × 0.033 in ID), zaprojektowaną tak, aby pasowała do wlotu źródła jonów Orbitrap. Ustaw rurkę transferową jonów tak, aby była wyrównana bezpośrednio z wlotem Orbitrap, wystając jednocześnie na zewnątrz w stopniu umożliwiającym niezakłócony dostęp pióropusza DESI. 
	UWAGA: Dostosuj rurkę transferową jonów do konfiguracji spektrometru mas. Wykonaj rurkę transferową jonów przy użyciu odpowiednich procedur obróbki mechanicznej.</li>
	<li>Użyj rurki transferowej jonów o zgiętej geometrii, aby poprawić pozycjonowanie rozpylacza DESI względem powierzchni próbki i wlotu Orbitrap.</li>
	<li>Wyrównaj rozpylacz pod kątem około 70° względem powierzchni próbki, tak aby pióropusz rozpylania DESI przecinał obszar wlotu Orbitrap, nie dotykając powierzchni próbki.</li>
	<li>Stabilny pióropusz rozpylania definiuje się poprzez obecność stabilnych widm mas i spójnych wartości poziomu znormalizowanego (NL) podczas akwizycji. Reguluj pozycję rozpylacza, aż do zaobserwowania stabilnego sygnału jonowego.</li>
	<li>Jako warunek początkowy ustaw odległość od rozpylacza do powierzchni na około 1,0–1,5 mm. Ręcznie dokonuj precyzyjnej korekty pozycji rozpylacza, monitorując wartości NL, aby uzyskać najwyższy stabilny sygnał jonowy.</li>
</ol>
<img alt="Układ Thermo Orbitrap z adapterem FAIMS, nanoLC, rozpylaczem DESI; do analizy spektrometrią mas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71691/71691fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zintegrowany układ obrazowania spektrometrią mas (MSI) z wykorzystaniem desorpcyjnej jonizacji z rozpylania elektrosprayowego (DESI) połączony ze spektrometrem mas Orbitrap. Rozpylacz DESI jest zamontowany na zintegrowanej platformie składającej się z zmodyfikowanego adaptera do spektrometrii mobilności jonów z wysokopolową asymetryczną falą (FAIMS) , zmotoryzowanego stołu XYZ, regulatora gazu oraz płyty optycznej. Rozpuszczalnik jest dostarczany za pomocą systemu nano-chromatografii cieczowej, a gaz azotowy jest podawany pod ciśnieniem około 12 psi w celu stabilizacji rozpylania. Na rysunku przedstawiono również podłączenie napięcia jonizacji, linię rozpuszczalnika oraz pozycjonowanie rozpylacza względem wlotu do Orbitrap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71691/71691fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Konfiguracja podawania rozpuszczalnika i warunków rozpylania
<ol>
	<li>Przed analizą DESI–MSI przygotować świeży rozpuszczalnik do rozpylania składający się z metanolu/wody/kwasu mrówkowego (98:2:0.1, v/v/v). 
	UWAGA: Po optymalizacji można zastosować inne systemy rozpuszczalników kompatybilne z DESI, w tym rozpuszczalniki na bazie acetonitrylu oraz różne proporcje metanolu do wody. W niniejszym protokole jako standardowe warunki początkowe zastosowano metanol/wodę/kwas mrówkowy (98:2:0.1, v/v/v), ponieważ zapewniały one stabilne tworzenie się pióropusza, ograniczały rozprzestrzenianie się rozpuszczalnika i gwarantowały powtarzalne sygnały lipidów w dodatnim trybie jonizacji podczas eksperymentów DESI–MSI na pojedynczych komórkach. 
	OSTRZEŻENIE: Metanol jest łatwopalny i toksyczny. Kwas mrówkowy jest żrący. Rozpuszczalnikami należy posługiwać się w dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Rozpuszczalnik podawać za pomocą systemu Ultimate 3000 nano-LC pracującego jako izokratyczna pompa rozpuszczalnika z przepływem 750 nL/min dla opisanych eksperymentów. Wylot nano-LC połączyć z rozpylaczem DESI za pomocą rurki PEEK (1/16 in OD × 0.005 in ID).</li>
	<li>Zainstalować kolumnę C18 (np. nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1.7 µm, 300 µm × 150 mm) w układzie przepływowym, aby zapewnić wystarczające ciśnienie wsteczne dla stabilnego tworzenia się mgły przy niskich przepływach.</li>
	<li>Ustawić metodę spektrometru mas na dodatni tryb jonizacji z detekcją Orbitrap, napięciem rozpylania 0.85 kV, rozdzielczością Orbitrap 120,000 przy m/z 200 oraz zakresem m/z 150–1200.</li>
	<li>Ustawić znormalizowany cel AGC na 100%, maksymalny czas wtrysku na 100 ms, soczewkę RF na 45% oraz liczbę mikroskanów na 1. Wyłączyć izolację czwórpolową i fragmentację w źródle.</li>
	<li>Dostarczać azot jako gaz osłonowy z generatora azotu lub źródła ciekłego azotu pod ciśnieniem około 12 psi w celu stabilizacji pióropusza rozpylania DESI. Przyjąć 12 psi jako początkowe ciśnienie robocze i wprowadzać niewielkie korekty ręczne tylko w razie potrzeby, aby poprawić wartości NL i utrzymać stabilne widmo mas.</li>
</ol>
6. Wykonanie obrazowania rastrowego i kontroli pikseli
<ol>
	<li>Zidentyfikuj obszar zainteresowania zawierający optycznie widoczne pojedyncze komórki, korzystając z siatki na szkiełkach podstawowych jako punktu odniesienia. Wybierz odizolowane komórki z wyraźnym wizualnym oddzieleniem od sąsiednich komórek, nienaruszoną morfologią adherentną i bez oczywistego nakładania się na zanieczyszczenia lub skupiska komórek.</li>
	<li>Zdefiniuj obszar rastrowania za pomocą oprogramowania Fance Stage Controller46. Ustaw rozmiar kroku rastra na 0.01 mm, prędkość stolika na 0.01 mm/s oraz czas przebywania na 20 s.</li>
	<li>Zastosuj rastrowe skanowanie od lewej do prawej wzdłuż każdej linii, a następnie przesuń stolik do następnej linii w kierunku y. Ustaw ortogonalny rozmiar kroku między liniami rastra na 10 µm.</li>
	<li>Dostosuj prędkość stolika do szybkości akwizycji Orbitrap, aby uzyskać pożądany wymiar piksela w kierunku skanowania (np. około 2.5–6.5 µm). Oblicz wymiar piksela w kierunku skanowania, korzystając z następnej zależności: wymiar piksela w kierunku skanowania = prędkość stolika × czas akwizycji na skan.</li>
	<li>Przy prędkości stolika 0.01 mm/s (10 µm/s) wykonaj 376 skanów w czasie 102 s, aby uzyskać czas akwizycji wynoszący 0.271 s na skan i odpowiadający mu wymiar piksela w kierunku skanowania wynoszący około 2.7 µm. Zsynchronizuj ruch stolika z akwizycją widma masowego, ustawiając czas akwizycji Orbitrap nieco krócej niż połączone parametry ruchu stolika i czasu przebywania. 
	UWAGA: Ortogonalny wymiar piksela jest określony przez zaprogramowany rozmiar kroku oraz fizyczne i mechaniczne ograniczenia stolika, podczas gdy wymiar w kierunku skanowania zależy od prędkości stolika i szybkości akwizycji widma.</li>
	<li>Zbieraj dane obrazowania w wybranym zakresie mas aż do zakończenia skanowania zdefiniowanego obszaru rastra. Dla obszaru obrazowania o wymiarach 1 mm × 1 mm, akwizycjonowanego z krokiem linii 0.01 mm i prędkością stolika 0.01 mm/s, całkowity czas akwizycji wynosi około 4–5 h.</li>
	<li>Generuj pliki danych RAW podczas akwizycji i przerwij proces po osiągnięciu określonych współrzędnych rastra x–y oraz odpowiadającego im czasu trwania metody instrumentu. W opisanych tutaj warunkach dodatniego trybu jonizacji każda linia rastra generuje zazwyczaj plik RAW o rozmiarze około 50 MB, co daje łącznie około 5 GB danych dla 101 linii rastra.</li>
</ol>
7. Rejestracja obrazów optycznych i MS
<ol>
	<li>Po przemyciu i wysuszeniu AF oraz przed akwizycją DESI, należy zarejestrować obrazy komórek w wybranym obszarze siatki w świetle przechodzącym, używając mikroskopu wyposażonego w obiektyw 10×.</li>
	<li>Pliki RAW należy przekonwertować na pliki mzML za pomocą programu msConvert z pakietu ProteoWizard48. Następnie pliki mzML należy przekonwertować na format imzML przy użyciu imzML Converter49.</li>
	<li>Należy zastosować ustawienia konwersji centroid/profile zgodne z formatem pozyskanych danych. Pliki imzML należy przesłać bezpośrednio do METASPACE (https://metaspace2020.eu)50 w celu wizualizacji obrazów.</li>
	<li>Przed wizualizacją nie należy stosować normalizacji, usuwania hotspotów ani dodatkowych korekt przetwarzania obrazu. Obrazy optyczne i MS należy wyrównać ręcznie, wykorzystując punkty orientacyjne siatki jako odniesienia pozycyjne.</li>
	<li>Obraz optyczny należy przeskalować, korzystając z znanych wymiarów obrazu i odstępów siatki. Następnie należy ręcznie nałożyć obraz MS, aby ocenić zgodność między optycznie widocznymi pozycjami komórek a zlokalizowanymi sygnałami jonowymi.</li>
	<li>Lokalizację na poziomie pojedynczej komórki potwierdza wizualna zgodność między odizolowanymi komórkami na obrazie w świetle przechodzącym a odpowiadającymi im rozkładami jonów w MS.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wishart DS. Metabolomics for Investigating Physiological and Pathophysiological Processes. Physiol Rev. 2019;99:1819-75.</li>
	<li>Ma B, et al. Spatially resolved&#160;visualization of reprogrammed metabolism in hepatocellular carcinoma by mass spectrometry imaging. Cancer Cell Int. 2023;23:177.</li>
	<li>Kelley AR. Mass Spectrometry-Based Analysis of Lipid Involvement in Alzheimer&#8217;s Disease Pathology&#8212;A Review. Metabolites. 2022;12:510.</li>
	<li>Krestensen KK, Heeren RMA, Balluff B. State-of-the-art mass spectrometry imaging applications in biomedical research. Analyst. 2023;148:6161-87.</li>
	<li>Wije Munige S, et al. Developing a Cell Quenching Method to Facilitate Single Cell Mass Spectrometry Metabolomics Studies. JACS Au. 2025;5:2379-87.</li>
	<li>R&#246;mpp A, Spengler B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 2013;139:759-83.</li>
	<li>McDonnell LA, Heeren RMA. Imaging mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 2007;26:606-43.</li>
	<li>Bhusal D, Wije Munige S, Peng Z, Yang Z. Exploring Single-Probe Single-Cell Mass Spectrometry: Current Trends and Future Directions. Anal Chem. 2025;97:4750-62.</li>
	<li>Lan Y, Zou Z, Yang Z. Single Cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. Trends Anal Chem. 2024;174:117657.</li>
	<li>Liu R, Yang Z. Single cell metabolomics using mass spectrometry: Techniques and data analysis. Anal Chim Acta. 2021;1143:124-34.</li>
	<li>Shen X, et al. Advances in Sampling and Analytical Techniques for Single-Cell Metabolomics: Exploring Cellular Heterogeneity. Rapid Commun Mass Spectrom. 2025;39:e10045.</li>
	<li>Chen D, Colwell N, Yang Z. Ambient high-spatial-resolution mass spectrometry imaging: recent advances in technologies and metabolomics studies. Trends Anal Chem. 2026;198:118767.</li>
	<li>Bodzon-Kulakowska A, Suder P. Imaging mass spectrometry: Instrumentation, applications, and combination with other visualization techniques. Mass Spectrom Rev. 2016;35:147-69.</li>
	<li>Zhang H, et al. Single-cell mass spectrometry imaging: emerging advancements and future insights. Anal Chim Acta. 2026;1382:344825.</li>
	<li>Mondal S, et al. Mass Spectrometry Imaging of Lumpectomy Specimens Deciphers Diacylglycerols as Potent Biomarkers for the Diagnosis of Breast Cancer. Anal Chem. 2023;95:8054-62.</li>
	<li>Ajith A, et al. Mass Spectrometry Imaging Deciphers Dysregulated Lipid Metabolism in the Human Hippocampus Affected by Temporal Lobe Epilepsy. ACS Chem Neurosci. 2021;12:4187-94.</li>
	<li>Mondal S, et al. Mass Spectrometric Imaging of Anionic Phospholipids Desorbed from Human Hippocampal Sections: Discrimination between Temporal and Nontemporal Lobe Epilepsies. ACS Chem Neurosci. 2024;15:983-93.</li>
	<li>Banerjee S, et al. Early detection of unilateral ureteral obstruction by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Sci Rep. 2019;9:11007.</li>
	<li>Wheeler K, et al. Frontiers in mass spectrometry-based spatial metabolomics: Current applications and challenges in the context of biomedical research. Trends Anal Chem. 2024;175:117713.</li>
	<li>Colwell N, et al. Achieving Single-Cell Resolution via Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging (DESI-MSI) on Different Platforms. Anal Chem. 2026;98:10629-38.</li>
	<li>Bergman H-M, Lanekoff I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 2017;142:3639-47.</li>
	<li>Pan N, Yang Z, Rao W. Single-Cell MS and High-Spatial-Resolution MS Imaging Under Ambient Conditions Using a Novel Sampling Device. LCGC North Am. 2015;33:414-19.</li>
	<li>Cairns JL, et al. Mass-Guided Single-Cell MALDI Imaging of Low-Mass Metabolites Reveals Cellular Activation Markers. Adv Sci. 2025;12:2410506.</li>
	<li>Keller C, et al. Comparison of Vacuum MALDI and AP-MALDI Platforms for the Mass Spectrometry Imaging of Metabolites Involved in Salt Stress in Medicago truncatula. Front Plant Sci. 2018;9:1238.</li>
	<li>Krestensen KK, et al. Molecular Profiling of Glioblastoma Patient-Derived Single Cells Using Combined MALDI-MSI and MALDI-IHC. Anal Chem. 2025;97:3846-54.</li>
	<li>Zhu X, Xu T, Peng C, Wu S. Advances in MALDI Mass Spectrometry Imaging Single Cell and Tissues. Front Chem. 2022;9:782432.</li>
	<li>Solon EG, Schweitzer A, Stoeckli M, Prideaux B. Autoradiography, MALDI-MS, and SIMS-MS Imaging in Pharmaceutical Discovery and Development. AAPS J. 2009;12:11-26.</li>
	<li>Zhang H, Shi X, Lu H, Li L. Delineation of Subcellular Molecular Heterogeneity in Single Cells via Ultra-low Flow Rate Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry (u-DESI-MS). Anal Chem. 2025;97:9985-91.</li>
	<li>Marques C, et al. Global and Spatial Metabolomics of Individual Cells Using a Tapered Pneumatically Assisted nano-DESI Probe. J Am Soc Mass Spectrom. 2023;34:2518-24.</li>
	<li>Pan N, et al. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Anal Chem. 2014;86:9376-80.</li>
	<li>Zhu Y, Liu R, Yang Z. Redesigning the T-probe for Mass Spectrometry Analysis of Online Lysis of Non-adherent Single Cells. Anal Chim Acta. 2019;1084:53-59.</li>
	<li>Nguyen TD, et al. Single-Cell Mass Spectrometry Enables Insight into Heterogeneity in Infectious Disease. Anal Chem. 2022;94:10567-72.</li>
	<li>Sun M, Tian X, Yang Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Anal Chem. 2017;89:9069-76.</li>
	<li>Rao W, Pan N, Yang Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. J Am Soc Mass Spectrom. 2015;26:986-93.</li>
	<li>Rao W, Pan N, Yang Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. J Vis Exp. 2016;(112):e53911.</li>
	<li>Cooks RG, Ouyang Z, Takats Z, Wiseman JM. Ambient Mass Spectrometry. Science. 2006;311:1566-70.</li>
	<li>Green FM, et al. The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution. Analyst. 2010;135:731-37.</li>
	<li>Eberlin LS, et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging. Biochim Biophys Acta. 2011;1811:946-60.</li>
	<li>Wu V, et al. High Resolution Ambient MS Imaging of Biological Samples by Desorption Electro-Flow Focussing Ionization. Anal Chem. 2022;94:10035-44.</li>
	<li>Towers MW, et al. Development of Low-Flow High-Resolution Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 2026;37:152-62.</li>
	<li>Forbes TP, Brewer TM, Gillen G. Desorption Electro-Flow Focusing Ionization of Explosives and Narcotics for Ambient Pressure Mass Spectrometry. Analyst. 2013;138:5665-73.</li>
	<li>Hansen CFM, Dobrovolskis L, Janfelt C. Design and Implementation of a Desorption Electro-flow Focusing Sprayer on an Orbitrap Mass Spectrometer for DESI Mass Spectrometry Imaging at High Spatial Resolution and at High Speed. J Am Soc Mass Spectrom. 2025;36:473-82.</li>
	<li>Eliuk S, Makarov A. Evolution of Orbitrap Mass Spectrometry Instrumentation. Annu Rev Anal Chem. 2015;8:61-80.</li>
	<li>Perry RH, Cooks RG, Noll RJ. Orbitrap mass spectrometry: instrumentation, ion motion and applications. Mass Spectrom Rev. 2008;27:661-99.</li>
	<li>Zhang X-C, et al. Combination of Droplet Extraction and Pico-ESI-MS Allows the Identification of Metabolites from Single Cancer Cells. Anal Chem. 2018;90:9897-903.</li>
	<li>Lanekoff IT, et al. An Automated Platform for High-Resolution Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 2012;84:8351-56.</li>
	<li>Tian Y, Wei R, Meng Y, Zare RN. Comparison of Mass Spectrometry Imaging by Desorption Electrospray Ionization (DESI) and Desorption Electro-Flow Focusing Ionization (DEFFI). Metabolites. 2026;16:219.</li>
	<li>Chambers MC, et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nat Biotechnol. 2012;30:918-20.</li>
	<li>Race AM, Styles IB, Bunch J. Inclusive sharing of mass spectrometry imaging data requires a converter for all. J Proteomics. 2012;75:5111-12.</li>
	<li>Palmer A, et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 2017;14:57-60.</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów interesu do ujawnięcia.

To protokoll umożliwia środowiskowe pojedyncze DESI–MSI za pomocą spektrometrów mas Orbitrap o wysokiej rozdzielczości masowej poprzez integrację precyzyjnej kontroli stopnia, nanoskalowej dostawy rozpuszczalnika, optycznego celowania oraz wysokorozdzielczej analizy masowej. Połączenie tych elementów pozwala na przełamanie wielu barier technicznych, które historycznie ograniczały zastosowanie DESI–MSI na poziomie pojedynczych komórek. W szczególności, skoordynowany kontrola stabilności rozpylenia, transmisji jonów i czasu akwizycji umożliwia niezawodne wykrywanie sygnałów molekularnych z bardzo małych objętości próbek odpowiadających pojedynczym komórkom. Centralnym czynnikiem wpływającym na wydajność tego przepływu pracy jest stabilność i ograniczenie rozpylenia DESI. Na skalę mikrometrów, małe zakłócenia w szybkości przepływu rozpuszczalnika, ciśnieniu gazu lub pozycjonowaniu dyszy mogą znacząco zmienić efektywny obszar pobierania próbek. Zastosowanie nanoskalowej dostawy rozpuszczalnika w połączeniu z odpowiednim przeciwciśnieniem poprawia stabilność rozpylenia i zmniejsza rozprzestrzenianie się rozpuszczalnika, zwiększając w ten sposób wierność przestrzenną. Ponadto, utrzymanie stałej odległości dyszy od powierzchni i kąta jest kluczowe dla reprodukowalnej wydajności jonizacji. Nawet niewielkie odchylenia w geometrii mogą prowadzić do znacznych różnic w intensywności sygnału, szczególnie przy analizie heterogenicznych próbek komórkowych. W praktyce, optymalizacja warunków rozpylenia DESI była wykonywana empirycznie poprzez monitorowanie całkowitego prądu jonów, stabilności spektrum oraz wartości NL (zazwyczaj około 105–106) podczas akwizycji. Odtwarzalna jakość sygnału została osiągnięta poprzez iteracyjną regulację pozycji dyszy, stabilności przepływu rozpuszczalnika, ciśnienia gazu oraz ujednolicenia rozpylenia DESI względem wlotu Orbitrap.
Efektywność transmisji jonów reprezentuje kolejne kluczowe ograniczenie na skalę pojedynczych komórek, ponieważ obfitość analitów jest naturalnie niska w pojedynczych komórkach. Na tych skalach przestrzennych, efektywna transmisja jonów może stać się większym ograniczeniem praktycznym niż wydajność jonizacji w niektórych implementacjach, ponieważ tylko bardzo mała frakcja dezorbowanych jonów dociera do wlotu spektrometru mas. Dlatego też, efektywny transfer jonów z regionu pobierania do wlotu spektrometru mas jest zasadniczy. Zmodyfikowany adapter obudowy FAIMS stosowany w tym protokole zapewnia interfejs między źródłem rozpylenia DESI a spektrometrem mas Thermo, umożliwiając kompatybilność z wieloma modelami urządzeń, w tym platformami Orbitrap Tribrid, Exploris i Astral. Integracja zmodyfikowanego adaptera obudowy FAIMS z płytą optyczną zapewnia również stabilność mechaniczną, minimalizując niedopasowanie podczas dłuższych eksperymentów obrazowania. Synchronizacja ruchu stopnia i akwizycji spektrum masowego jest również kluczowa dla osiągnięcia wysokiej rozdzielczości przestrzennej. W DESI–MSI, wymiar piksela w kierunku skanowania jest rządzony relacją między prędkością stopnia a szybkością akwizycji, podczas gdy ortogonalny wymiar jest definiowany przez zaprogramowaną wielkość kroku. Dokładna kontrola tych parametrów umożliwia precyzyjne pobieranie próbek. Ponieważ wiele komórek ssaków zazwyczaj waha się od około 5–20 µm średnicy, wymiary pikseli zbliżające się do kilku mikrometrów są wymagane, aby zminimalizować nakładanie się sygnałów między sąsiednimi komórkami i poprawić lokalizację cech molekularnych do poszczególnych regionów komórkowych. Jednakże, nominalny rozmiar piksela niekoniecznie odpowiada prawdziwemu śladowi pobierania próbek, ponieważ oddziaływanie rozpylenia rozpuszczalnika z powierzchnią próbki może wprowadzić boczne rozprzestrzenianie się i częściowe nakładanie się sygnałów między sąsiednimi pikselami. Podane wymiary pikseli powinny zatem być interpretowane w kontekście efektywnej rozdzielczości przestrzennej, a nie ściśle geometrycznych definicji. Dostosowana rura transferu jonów użyta w tym badaniu została zaprojektowana zgodnie z geometrią standardowej rury transferu jonów, aby zachować charakterystyki transmisji jonów, umożliwiając integrację z konfiguracją źródła DESI.
Wysoka moc rozdzielania mas i dokładność masy zapewniana przez spektrometry masowe Orbitrap są zasadnicze dla rozdzielania złożonej mieszanki metabolitów i lipidów obecnych w pojedynczych komórkach. Wiele wykrytych cech molekularnych zostało wstępnie skomentowane za pomocą dokładnych pomiarów masy i analizy METASPACE. Ponieważ wiele kandydatów może odpowiadać jednej zmierzonej wartości m/z, dodatkowe walidacje MS/MS oraz ortogonalne strategie potwierdzania molekularnego mogą dalsze wzmocnić identyfikację molekularną w przyszłych badaniach. W trybie jonów dodatnich, widma DESI są często zdominowanie przez gatunki fosfolipidów o bliskich lub izobarycznych wartościach m/z. Wysokorozdzielcze wykrywanie Orbitrap umożliwia różnicowanie tych gatunków, poprawiając w ten sposób specyficzność molekularną i zmniejszając niejednoznaczność spektralną. Ta zdolność jest szczególnie ważna dla analiz na poziomie pojedynczych komórek, gdzie poleganie na ograniczonej liczbie jonów może prowadzić do błędnej interpretacji heterogeniczności komórkowej. Ta adaptacyjność sugeruje, że podobne strategie mogą być stosowane do innych platform spektrometri

Metabolomika stara się kompleksowo scharakteryzować małe metabolity cząsteczkowe, które odzwierciedlają stan funkcjonalny systemów biologicznych1,2,3,4,5. Ponieważ metabolity są bezpośrednim produktem aktywności enzymatycznej, zapewniają dynamiczne odczytywanie fenotypu komórkowego i regulacji biochemicznej. Jednak konwencjonalne przepływy metabolomiki zwykle polegają na metodach ekstrakcji masowej, które uśredniają sygnały dla tysięcy do milionów komórek, co zasłania niejednorodność komórkową6,7,8.
Metabolomika pojedynczych komórek radzi sobie z tą ograniczeniem, umożliwiając profilowanie molekularne na poziomie pojedynczych komórek, ujawniając różnorodność metaboliczną w złożonych populacjach i poprawiając rozumienie mechanizmu postępu choroby, reakcji na leki i różnicowania komórkowego. Spektrometria mas (MS) jest niezbędnym narzędziem do analizy molekularnej próbek biologicznych. Ostatnie osiągnięcia w technikach MS, w tym przygotowanie próbek, instrumentacja i analiza danych, umożliwiają przeprowadzanie badań metabolomiki MS na poziomie pojedynczych komórek9,10,11,12.
Imaging MS (MSI), które umożliwia przestrzennie rozdzieloną analizę molekularną próbek biologicznych, integruje precyzyjny ruch próbki, zminimalizowane pobieranie próbek, wydajną jonizację i wizualizacje danych poprzez uzyskanie pełnego widma masowego w każdej zdefiniowanej współrzędnej przestrzennej na powierzchni próbki12,13,14. Obrazy MS są rekonstruowane poprzez nakreślenie intensywności wybranych wartości stosunku masy do ładunku (m/z) wzdłuż współrzędnych x–y, zachowując w ten sposób informacje przestrzenne o chemikaliach w złożonych systemach biologicznych12,13,15,16,17,18. Uzyskanie przestrzennie rozdzielonej metabolomiki pojedynczych komórek wymaga platform analitycznych zdolnych do zachowania lokalizacji molekularnej, zachowując jednocześnie wystarczającą czułość i rozdzielczość masową, aby wykryć gatunki o niskiej obfitości9,12,19,20.
Imaging MSI pojedynczych komórek stawia dodatkowe wyzwania, ponieważ pojedyncze komórki zazwyczaj mają średnicę od 5 do 20 μm8,21. Na tej skali przestrzennej, obfitość analitów na jedno zdarzenie pobierania próbek jest niezwykle ograniczona. Dlatego wiele czynników, w tym dokładna kontrola ruchu próbki, zminimalizowane pobieranie próbek, wysoka wydajność jonizacji i wydajne przenoszenie jonów, są równie istotne, aby uzyskać interpretowalne informacje molekularne z pojedynczych komórek14,22. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)–MSI, technika oparta na próżni rutynowo używana do badań MSI o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, wymaga depozycji matrycy i operacji w próżni; jednak krystalizacja matrycy w MALDI może wprowadzić delokalizację i zmienność analitów na skalę pojedynczych komórek23,24,25,26,27. W przeciwieństwie do tego, podejścia do ambient MSI pracują w warunkach otoczenia, a próbki zachowują stany chemiczne zbliżone do naturalnych, ponieważ wymagana jest mała lub żadna przygotowanie próbki. Wśród metod ambient MSI, DESI28, nano-DESI21, nano-DESI wspomagane pneumatycznie29, i Single-probe8,30,31,32,33,34,35, zostały wcześniej użyte do badań MSI pojedynczych komórek. Chociaż techniki oparte na mikropłynowej ekstrakcji, w tym nano-DESI, nano-DESI wspomagane pneumatycznie i Single-probe, zapewniają wysokie pobieranie próbek i wydajność jonizacji, polegają one na utrzymaniu stabilnego mostka płynnego na końcówce sondy pobierającej, podczas gdy zakłócenie mostka płynnego, takie jak zmiany w morfologii powierzchni lub zatkanie sondy, może wpływać na jakość eksperymentów MSI5,8,21,30,35.
DESI to

<table><tbody><tr><td>&minus;80 &deg;C zamrażarka</td><td>Eppendorf New Brunswick</td><td>U700</td><td>Przechowywanie próbek biologicznych przed przygotowaniem.</td></tr><tr><td>6" pionowy wspornik do płyt zaciskowych, otwory 1/4"-20 (2 sztuki)</td><td>Millipore Sigma</td><td>VB01A</td><td>Mechaniczne wsparcie i stabilizacja niestandardowego zespołu montażu dysz</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Chemical</td><td>240744</td><td>Rozpuszczalnik organiczny do przygotki i optymalizacji rozpuszczalnika zgodnego z DESI</td></tr><tr><td>Formian amonu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>401152500</td><td>Przygotowanie buforu do płukania formianiem amonu w celu izotonicznego mycia komórek przed DESI&ndash;MSI</td></tr><tr><td>Mikroskop Brightfield</td><td>Fisher Scientific</td><td>12575252</td><td>Optyczne obrazowanie i wizualizację przyczepionych komórek przed nabywaniem DESI&ndash;MSI</td></tr><tr><td>Kolumna C18</td><td>Waters</td><td>186009259</td><td>Generacja ciśnienia przeciwprądowego w linii do stabilnego formowania rozpylacza DESI w nano-flow</td></tr><tr><td>Drut miedziowy</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>Połączenie elektryczne i uziemienie podczas produkcji montażu dysz</td></tr><tr><td>Sprayer DESI XS</td><td>Waters</td><td>700014033</td><td>Źródło jonizacji DESI w środowisku do eksperymentów DESI&ndash;MSI z pojedynczymi komórkami</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Devcon</td><td>20945</td><td>Stabilizacja mechaniczna i utrwalenie niestandardowych komponentów montażu dysz</td></tr><tr><td>Adapter obudowy źródła jonów FAIMS Pro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>98100-20046</td><td>Modyfikacja i produkcja niestandardowego interfejsu DESI zgodnego z Orbitrapem</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Ward&rsquo;s Science</td><td>470301-120</td><td>Modyfikator kwasowy do przygotki rozpuszczalnika do sprayera DESI</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-4 Optima</td><td>Rozpuszczalnik organiczny do przygotki rozpuszczalnika do sprayera DESI</td></tr><tr><td>Regulator gazu</td><td>Millipore Sigma</td><td>23831-U</td><td>Regulacja ciśnienia gazu osłaniającego azotem podczas działania DESI</td></tr><tr><td>Szklana pokrywka z kratką</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Podłoże do hodowli komórek i odniesienie pozycyjne do rejestracji obrazu optycznego do MS</td></tr><tr><td>Przewód uziemiający</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>Połączenie uziemiające do sprayera DESI i zespołu interfejsu</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>HeraCell</td><td>51026282</td><td>Utrzymanie kultur komórek ssaków w kontrolowanych warunkach temperatury i CO2</td></tr><tr><td>Woda klasy LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6500</td><td>Przygotowanie buforu do mycia formianiem amonu i rozpuszczalnika do sprayera DESI</td></tr><tr><td>Platforma METASPACE</td><td>METASPACE</td><td>https://metaspace2020.eu</td><td>Oparte na chmurze wizualizację obrazu MS i przestrzenną analizę danych metabolomiki</td></tr><tr><td>Modyfikowany interfejs FAIMS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>98100-20046</td><td>Niestandardowy interfejs do łączenia sprayera DESI z widmami masowymi Orbitrap</td></tr><tr><td>Stojaczek XYZ z napędem</td><td>Newport Corporation</td><td>CONEX-MFACC</td><td>Kontrolowane ruch rasterowy podczas nabywania DESI&ndash;MSI</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania mykoplazm MycoAlert PLUS</td><td>Lonza</td><td>LT07-703</td><td>Routynowe monitorowanie kontaminacji mykoplazmą w hodowanych komórkach</td></tr><tr><td>System nanochromatografii cieczowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5200.0355</td><td>System dostarczania rozpuszczalnika nano-flow do generacji sprayera DESI</td></tr><tr><td>Podłoże optyczne</td><td>Thorlabs</td><td>MB1012</td><td>Platforma podtrzymująca mechanicznie sprayer DESI i zmodyfikowany zespół interfejsu</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UVPD</td><td>Wysokorozdzielczy spektrometr masowy Orbitrap do nabywania danych DESI&ndash;MSI</td></tr><tr><td>Rura PEEK</td><td>IDEX</td><td>1535</td><td>Połączenie linii rozpuszczalnika między systemem nano-LC a sprayerem DESI</td></tr><tr><td>Penicylina z streptomycyną</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Dodatek antybiotyczny do pożywki do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>Bufor słony fosforanowy (PBS)</td><td>VWR</td><td>0780-50L</td><td>Roztwór do mycia hodowanych komórek podczas przesadzania</td></tr><tr><td>Pożywka RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Pożywka do hodowli komórek ssaków do utrzymania komórek OVCAR-8</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące stolcem</td><td>Lasken Group</td><td>Wersja 6</td><td>Sterowanie oprogramowaniem skanowania rasterowego, ruchu stołka i parametrów nabywania obrazów</td></tr><tr><td>Rura ze stali nierdzewnej</td><td>MicroGroup</td><td>316H16H</td><td>Niestandardowa rura do przenoszenia jonów (1/16" OD, 0,033" ID) do integracji z interfejsem Orbitrap</td></tr><tr><td>Strzykawka, 250 &micro;L</td><td>Hamilton</td><td>1725LTN250UL</td><td>Ładowanie rozpuszczalnika i dostarczanie nano-flow rozpuszczalnika</td></tr><tr><td>Syntetyczne surowicowe surowica bydlęca (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH3006603</td><td>Dodatek surowicowy do przygotki pełnej pożywki do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek TC20</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1450102EDU</td><td>Automatyczne liczenie hodowanych komórek przed wysiewem na pokrywkach</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowania tkanki, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td>Rozrost i utrzymanie adhezywnych kultur komórek OVCAR-8</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td>Enzymatyczne oderwanie adhezywnych komórek podczas przesadzania</td></tr><tr><td>Żywica UV</td><td>Prime Dental</td><td>6.03</td><td>Produkcja i stabilizacja niestandardowych komponentów montażu spray

obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy orbitrap

Single-Cell Mass Spectrometry Imaging Using Desorption Electrospray Ionization Coupled To Orbitrap Mass Spectrometers

Dezorpcyjna elektrorozpyłowa ionizacja - obrazowanie spektrometrią masową (DESI - MSI) umożliwia obrazowanie molekularne w warunkach środowiskowych bez macierzy z minimalną przygotowaniem próbki. Ten protokół opisuje przepływ pracy dla jednokomórkowego MSI komórek OVCAR-8 za pomocą DESI sprzężonego z widmometriami masowymi Orbitrap. System integruje rozpylacz DESI, zmodyfikowany interfejs widmometru masowego, zmotoryzowaną podstawę XYZ oraz podstawę optyczną do obrazowania o wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Komórki są hodowane na siatkowanych szklanych okrągach, myte roztworem formianu amonu, aby zmniejszyć zakłócenia soli, suszone i analizowane w warunkach środowiskowych. Rozpuszczalnik jest dostarczany ciągle za pomocą systemu nano-chromatografii cieczowej, a gaz do rozpylania azotu jest regulowany, aby utrzymać stabilność rozpylania. Protokół opisuje również skanowanie rasterowe, kontrolę pikseli i rejestrację obrazu optycznego do spektrometrii masowej dla lokalizacji jednokomórkowej. Wysoka rozdzielczość masy i dokładność masy zapewniona przez wykrywanie Orbitrap umożliwia rozróżnienie blisko spokrewnionych gatunków molekularnych i wspiera jednokomórkową analizę metabolomową. Ten protokół zapewnia adaptacyjną strategię wdrażania jednokomórkowego MSI o wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą wielu platform widmometrii masowej Orbitrap.

Prawidłowe wykonanie niniejszego protokołu pozwala na uzyskanie zbiorów danych DESI–MSI, w których optycznie zidentyfikowane pojedyncze komórki odpowiadają przestrzennie zlokalizowanym sygnałom jonów molekularnych (Rysunek 2). Obrazy mikroskopii w świetle przechodzącym, pozyskane przed analizą DESI–MSI, umożliwiają wizualną identyfikację pojedynczych komórek OVCAR-8 i ułatwiają rejestrację obrazów optycznych z obrazami MS przy użyciu siatki na szkiełku podstawowym jako punktu odniesienia pozycji. Reprezentatywne obrazy jonowe DESI–MSI wykazują zlokalizowane rozkłady jonów, które korelują przestrzennie z pojedynczymi komórkami zidentyfikowanymi na odpowiadającym im obrazie w świetle przechodzącym (Rysunek 2A–2D).
<img alt="Fluorescencja skupisk komórkowych; analiza obrazu; siatka mikroskopowa; intensywność emisji; mapowanie spektralne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71691/71691fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Porównanie mikroskopii w polu jasnym i MSI komórek OVCAR-8. (A) Obraz mikroskopii w polu jasnym komórek OVCAR-8 uzyskany przy powiększeniu 10×. (B–D) Obrazy MS uzyskane przy użyciu DESI–MSI z rozmiarem piksela 5.5 µm × 10 µm. Reprezentatywne rozkłady jonów przedstawiono dla (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 oraz (D) m/z 788.616. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71691/71691fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Pojedyncze komórki generują pełne widma mas zawierające liczne jony związane z lipidami oraz małe cząsteczki. Zamiast polegać na pojedynczym markerze molekularnym, każda komórka wykazuje wielojonowy profil molekularny, który pełni funkcję chemicznego odcisku palca. Reprezentatywne obrazy jonowe dla m/z 317.111, m/z 808.562 oraz m/z 788.616 wykazują heterogeniczne rozkłady molekularne w sąsiadujących komórkach, co wskazuje na mierzalną heterogenność metaboliczną na poziomie pojedynczej komórki (Rycina 2B–2D). Adnotacje oparte na METASPACE sugerują, że jony wykryte przy m/z 808.562 i m/z 788.616 były związane przede wszystkim z gatunkami lipidów takimi jak fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina, podczas gdy m/z 317.111 odpowiadało kilku kandydackim małym cząsteczkom oraz gatunkom związanym z dipeptydami. Wyniki te dowodzą, że platforma umożliwia detekcję przestrzennie zlokalizowanych cech molekularnych z optycznie zidentyfikowanych pojedynczych komórek w warunkach otoczenia. Dodatkowe wyniki, w tym wstępnie adnotowane gatunki, gatunki zidentyfikowane za pomocą MS/MS, reprezentatywne obrazy MS oraz widma mas, przedstawiono w poprzednich badaniach20.
Zintegrowana platforma DESI–MSI składa się z rozpylacza DESI, zmodyfikowanego adaptera FAIMS, zmotoryzowanego stołu XYZ oraz płyty optycznej zamontowanej obok wlotu Orbitrap (Rysunek 1). Układ ten zapewnia stabilne podawanie rozpuszczalnika, kontrolowany ruch stołu oraz wyrównanie strumienia rozpylania DESI z wlotem spektrometru mas w celu przeprowadzenia eksperymentów obrazowania pojedynczych komórek w warunkach otoczenia. Spersonalizowana rurka transferowa jonów pokazana na Rysunku 3 umożliwia transmisję jonów między obszarem źródła DESI a wlotem Orbitrap. Zakrzywiona geometria kapilary ułatwia pozycjonowanie rozpylacza DESI względem powierzchni próbki i obszaru wlotowego, zapewniając jednocześnie niezakłócony transfer jonów.
<img alt="Igła do wstrzykiwania chromatograficznego z podziałką linijki, używana do wprowadzania próbki w chemii analitycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71691/71691fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Dostosowana rurka transferowa jonów do MSI Orbitrap. Fotografia rurki transferowej jonów wykonanej na zamówienie, służącej do połączenia rozpylacza DESI ze spektrometrem mas Orbitrap Fusion Lumos. Na rysunku przedstawiono geometrię zgiętej kapilary transferowej oraz zespół montażowy wykorzystywany do transmisji jonów podczas eksperymentów MSI pojedynczych komórek w warunkach otoczenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71691/71691fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek 4 przedstawia zmodyfikowany adapter FAIMS zintegrowany z płytą optyczną i zmotoryzowaną platformą XYZ. Widok z góry (Rysunek 4A) ilustruje rozmieszczenie platformy z próbką i zmodyfikowanego adaptera względem wlotu Orbitrap, natomiast widok z dołu (Rysunek 4B) pokazuje wsporniki montażowe i zespół platformy służące do podtrzymywania platformy obrazowania. Stabilność mechaniczna zintegrowanego zespołu jest istotna dla utrzymania spójnego ruchu rastrowego i minimalizacji dryftu pozycyjnego podczas akwizycji obrazu.
<img alt="Schemat Thermo Orbitrap Fusion Lumos, zmodyfikowany adapter FAIMS, układ optyczny, elementy stolika XYZ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71691/71691fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Zmodyfikowany adapter do spektrometrii mobilności jonów z wysokopolowym asymetrycznym przebiegiem falowym (FAIMS) zintegrowany z płytą optyczną i zmotoryzowanym stolikiem XYZ. (A) Widok z góry zmodyfikowanego adaptera zamontowanego obok wlotu Orbitrap i stolika z próbką. (B) Widok z dołu przedstawiający zmodyfikowane wsporniki, płytę optyczną oraz zespół zmotoryzowanego stolika XYZ wykorzystywany do podparcia i wyrównania platformy obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71691/71691fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wysoka rozdzielczość masy zapewniana przez detekcję Orbitrap umożliwia rozróżnienie blisko położonych i izobarycznych gatunków lipidów, co poprawia specyficzność molekularną oraz kontrast obrazu w porównaniu z systemami o niższej rozdzielczości masy. Małe wymiary pikseli można osiągnąć poprzez synchronizację prędkości przesuwu stolika i szybkości akwizycji widm. Na przykład, wymiary pikseli tak małe jak 2.7 µm × 10 µm zostały osiągnięte przy użyciu platform Orbitrap z szybką akwizycją oraz zoptymalizowanych parametrów rastrowania42. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości przestrzennej umożliwia molekularne wyodrębnienie ściśle przylegających do siebie komórek, minimalizując jednocześnie nakładanie się sygnałów między sąsiednimi regionami komórkowymi.
Pomocne eksperymenty DESI–MSI charakteryzują się stabilnymi warunkami rozpylania, spójną intensywnością jonów wzdłuż linii rastra oraz lokalizacją przestrzenną sygnałów cząsteczkowych, które odpowiadają poszczególnym komórkom na obrazie optycznym. Nieoptymalnie przeprowadzone eksperymenty mogą skutkować rozproszonym rozkładem jonów, niską intensywnością sygnału, niespójnymi wzorami rastra lub utratą lokalizacji komórkowej z powodu niestabilnego tworzenia się mgiełki, niewłaściwego ustawienia rozpylacza, nadmiernego rozprzestrzeniania się rozpuszczalnika lub przemieszczania się próbki podczas akwizycji. Staranna optymalizacja ustawienia rozpylacza, szybkości przepływu rozpuszczalnika, prędkości przesuwu stolika oraz pozycjonowania próbki poprawia wierność przestrzenną i stabilność sygnału jonowego podczas eksperymentów obrazowania pojedynczych komórek.

Ten protokół opisuje spektrometrię masową pojedynczych komórek obrazowania komórek OVCAR-8 z wykorzystaniem jonizacji z desorpcji i elektrozrygowania połączonych ze spektrometrami masowymi Orbitrap do metabolomiki wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

Desorption electrospray ionization&#8211;mass spectrometry imaging (DESI&#8211;MSI) enables ambient, matrix-free molecular imaging with minimal sample ...

single-cell-mass-spectrometry-imaging-using-desorption-electrospray

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Spektrometria mas z jonizacją metodą desorpcji (DESI-MS) to metoda otoczenia, za pomocą której próbki, w tym tkanki biologiczne, mogą być obrazowane przy minimalnym przygotowaniu próbki. Poprzez rasterowanie próbki poniżej sondy jonizacyjnej, ta technika oparta na rozpylaniu zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, aby dostrzec interesujące cechy molekularne w obrębie skrawków tkanki.

Obrazowanie tkanek biologicznych metodą spektrometrii mas z desorpcją i jonizacją metodą elektrorozpylania

Unieśmiertelnione linie komórek rakowych mogą być hodowane jako hodowle komórek 3D, co jest cennym modelem dla badań biologicznych. Protokół ten opisuje obrazowanie hodowli komórkowych 3D za pomocą spektrometrii mas, w tym ulepszenia platformy przygotowania próbek. Celem tego protokołu jest poinstruowanie użytkowników, jak przygotować hodowle komórek 3D do analizy obrazowania metodą spektrometrii mas.

Strategie przygotowania próbek do obrazowania spektrometrią mas modeli 3D kultur komórkowych

Tutaj prezentujemy protokoły do wykonywania zarówno obrazowania tkanek za pomocą spektrometrii mas otoczenia (MSI), jak i analizy MS na żywo (SCMS) in situ przy użyciu pojedynczej sondy, która jest zminiaturyzowanym wielofunkcyjnym urządzeniem do analizy MS.

Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Źródło obrazowania spektrometrią mas (MSI) działające pod ciśnieniem atmosferycznym zostało opracowane przez sprzężenie desorpcji laserowej w średniej podczerwieni i post-jonizacji elektrorozpylania. Egzogenna matryca lodowa została wykorzystana jako matryca pochłaniająca energię, aby ułatwić rezonansową desorpcję materiału związanego z tkanką. Ten manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do wykonywania IR-MALDESI MSI u noworodków całego ciała.

Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)

Charakterystyka proteomu łożysk mikronaczyniowych oka jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia wielu patologii oczu u ludzi. Badanie to demonstruje skuteczną, szybką i solidną metodę ekstrakcji białek i przygotowania próbek z małych naczyń krwionośnych, wykorzystującą krótkie tylne tętnice rzęskowe świń jako naczynia modelowe do analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem spektrometrii mas do charakterystyki biomolekuł, szczególnie dlatego, że jest wrażliwa na izomerię. Protokół ten opisuje tandemowy eksperyment IMS (IMS/IMS), który pozwala na izolację cząsteczki i wygenerowanie profili ruchliwości jej fragmentów.

Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

University of Oklahoma.  This protocol describes single-cell mass spectrometry imaging of OVCAR-8 cells using desorption electrospray ionization coupled to Orbitrap mass spectrometers for high-spatial-resolution metabolomic analysis.

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

Przeglądaj więcej filmów