Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

W ramach naszych badań opracowano metodę cPDiRT, czyli metodę sieciowania promieniami UV służącą do bezpośredniego mapowania oddziaływań RNA i białek zarówno w hodowlach komórkowych, jak i w tkankach natywnych, takich jak jądra, co pozwoliło na opisanie mechanizmów molekularnych TUG1 w spermatogenezie. Niniejszy protokół umożliwia bezpośrednie mapowanie oddziaływań RNA-białko w szerokim zakresie systemów, od hodowli komórkowych po nienaruszone tkanki natywne. W celu rozpoczęcia procedury należy trzykrotnie przemyć komórki GC2 buforem PBS, aby usunąć pozostałości pożywki hodowlanej.

Następnie dodaj do naczynia 3 ml PBS i rozprowadź go równomiernie przed usieciowaniem. Naświetlaj komórki w utrawioletsie o długości fali 254 nm w urządzeniu do sieciowania, stosując dawkę 4 000 mJ/cm². Zbierz komórki do PBS i odwiruj zawiesinę komórkową przy 3000G przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

Po odlaniu supernatantu, zważ osad i potwierdź, że jego masa wynosi co najmniej 500 miligramów na próbkę. Pobierz jądra od czterotygodniowych samców myszy C57BL6. Przemyj tkankę jądrową po usunięciu otoczek dwukrotnie, używając od 5 do 10 mililitrów DMEM.

Następnie inkubować 100 mg tkanki w 10 ml DMEM zawierającego 1 mg/ml kolagenazy IV w temperaturze 37 °C. Kontynuować trawienie przez 5 do 15 minut, aż do uwolnienia kanalików jawyciej. Następnie odwirować zawiesinę przy 1000G przez jedną minutę w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.

Przemyć osad 5 do 10 mililitrów DMEM. Ponownie odwirować zawiesinę przy 1000G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zawiesić osad w 0,25% trypsynie zawierającej jeden miligram na mililitr doksyrybonukleazy I. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 do 15 minut.

Następnie, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, dodaj taką samą objętość DMEM uzupełnionego o 10% FBS. Przefiltruj zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm. Odwiruj komórki przy 2000G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odlej supernatant i przemyj osad 5 do 10 mililitrów PBS. Ponownie odwiruj zawiesinę przy 2000G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resuspenduj zawiesinę pojedynczych komórek w PBS i rozdziel ją równomiernie na 15-centymetrową płytkę hodowlaną.

Przeprowadzić sieciowanie komórek jąder zgodnie z procedurą opisaną wcześniej dla komórek GC2. W przypadku komórek kontrolnych pominąć etap naświetlania. Zebrać zsieciowane komórki.

Odwiruguj zawiesinę z prędkością 3000G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odlej nadsącz. Aby zapewnić minimalną masę osadu wynoszącą 500 miligramów, połącz komórki jądr wyizolowane z co najmniej 10 do 12 myszy. Po zważeniu osadu, ponownie zawieś go w buforze do lizy komórek, stosując proporcję 100 miligramów osadu na jeden mililitr buforu.

Po wirowaniu w vortexie poddaj próbkę sonikacji przy użyciu skupiającego sonikatora lub sonikatora kąpielowego, aż lizat stanie się wizualnie przejrzysty. Następnie odmierz alikwoty o objętości około 10 µL lizatu do probówek do mikrocentryfugi w celu analizy RNA i białek. Do lizatu dodaj 30 µL uprzednio przemytych kulek magnetycznych.

Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji, delikatnie mieszając. Umieść próbki na statywie magnetycznym przez około jedną minutę lub do czasu, aż roztwór stanie się klarowny. Przenieś oczyszczony lizat do nowej probówki.

Umieść nową probówkę na statywie magnetycznym. Następnie przenieś lizat do innej probówki, aby usunąć pozostałe kuleczki. Do każdej próbki dodaj dwie objętości buforu hybrydyzacyjnego ogrzanego do 37 °C.

Dodaj biotynilowane sondy DNA w stosunku jednego mikrolitra zapasu sondy o stężeniu 100 mikromol na jeden mililitr lizatu. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przy rotacji end-over-end przez 12 do 16 godzin w piecu do hybrydyzacji. Bezpośrednio przed użyciem przemyj 100 mikrolitrów magnetycznych kulek z streptawidyną trzykrotnie buforem do lizy komórek.

Następnie należy usunąć pozostały bufor po ostatnim przemyciu. Krótko odwiruj probówki z reakcją hybrydyzacji. Następnie dodaj zhybrydyzowaną próbkę do przemytych kulek i delikatnie wymieszaj.

Przenieś zawiesinę kulek z powrotem do oryginalnej probówki i inkubuj w temperaturze 37°C przy mieszaniu przez 30 do 40 minut. Po inkubacji krótko odwiruj próbki. Umieść probówki na statywie magnetycznym na jedną do dwóch minut lub do momentu, aż roztwór stanie się klarowny.

Następnie odlej nadsącz. Aby wyprać kuleczki, dodaj 1 mL buforu do płukania i inkubuj probówki w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po pięciu płukaniach przenieś 1-10% kuleczek do nowej probówki w celu analizy RNA.

Na koniec dodaj 40 µL 1X buforu do próbek SDS do pozostałych kulek. Gotuj próbki w temperaturze 95 °C przez 30 minut, aby uwolnić białka i odwrócić wiązania krzyżowe. Odzyskaj białka do dalszej analizy metodą spektrometrii mas.

Analiza spektrometrii mas ChIRP zidentyfikowała ponad 190 białek wzbogaconych w stosunku do kontroli negatywnej w komórkach GC2. Przy dawce UV wynoszącej 4 000 millijoules per square centimeter, metoda cPDiRT-MS zidentyfikowała bardziej selektywny zestaw białek. Ponad dwie trzecie tych białek pokrywało się z białkami zidentyfikowanymi za pomocą konwencjonalnego ChIRP-MS.

Większość białek zidentyfikowanych za pomocą co najmniej dwóch unikalnych peptydów została wykryta w sposób powtarzalny w powtórzeniach biologicznych zarówno w komórkach GC2, jak i w jądrach myszy. Analiza ontologii genów białek zidentyfikowanych w sposób powtarzalny ujawniła procesy biologiczne w szerokim zakresie zgodne ze znanymi funkcjami TUG1. Porównanie zbiorów danych z komórek GC2 i jąder myszy pozwoliło na zidentyfikowanie 15 białek, które uległy wspólnemu wzbogaceniu.

Udoskonalona sekwencjonowanie immunoprecypitacji z sieciowaniem (cross-linking immunoprecipitation sequencing) ujawniło wyraźne i specyficzne piki wiązania białek PABPC1 i CCT3 na transkrypcie TUG1. Metoda cPDiRT pozwala badaczom na identyfikację i pomiar białek, które bezpośrednio oddziałują ze specyficznym, powiązanym RNA zarówno w komórkach hodowlanych, jak i w tkankach natywnych. Najważniejszym wyzwaniem jest osiągnięcie wydajnego sieciowania UV przy jednoczesnym zapewnieniu wysokiej specyficzności dla bezpośrednich interakcji RNA i białek.

Nasz protokół będzie wspierał przyszłe badania nad zastosowaniem tego podejścia do innych cząsteczek RNA oraz tkanek w celu odtworzenia bezpośredniego działania białek wiążących RNA w procesach rozwoju i reprodukcji.