ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Qiangfeng Zhang (Uniwersytet Tsinghua) i Ci Chu (laboratorium Howard Chang) za pomocne dyskusje dotyczące oryginalnego protokołu ChIRP. K.Z. był wspierany przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Chin (32170858) i Program Doskonałych Liderów Akademickich Programu Wschodnich Talentów Szanghaju (BJKJ2025057). L.Y. był wspierany przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Chin (82571836, 32070843 i 82371617).

Wszystkie roztwory zostały przygotowane z wykorzystaniem ultraczystej wody i reagentów bez nukleazy i proteazy. Wszystkie reagenty i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (Numer zgody: IACUC-1812003-4) i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi (National Research Council, 8. wydanie). Utrzymuj samce myszy C57BL/6 (w wieku 4 tygodni) w cyklu 12 h światło/12 h ciemność z dostępem do żywności i wody ad libitum. Minimalizuj cierpienie zwierząt, stosując najmniejszą liczbę zwierząt niezbędną do osiągnięcia istotności statystycznej. Zabijanie myszy odbywało się poprzez wdychanie CO₂, a następnie przez ścięcie szyjne zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi. 
1. Przygotuj bufory
<ol>
	<li>Przygotuj bufor lizaty komórkowej
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor lizaty komórkowej zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM EDTA i 1% SDS.</li>
		<li>Natychmiast przed użyciem dodaj 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteaz i specjalistyczny inhibitor RNazy. 
		UWAGA: SDS jest podrażniającym skórę i oczy środkiem. Unikaj wdychania pyłu lub aerozoli. PMSF jest wysoce toksyczny, działa jako inhibitor cholinesterazy i jest niestabilny w roztworze wodnym. Przygotuj PMSF natychmiast przed użyciem. Podczas postępowania z tymi reagentami należy nosić rękawiczki i okulary ochronne. Obsługę PMSF należy prowadzić w komorze wentylacyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor hybrydyzacji
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor hybrydyzacji zawierający 750 mM NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA i 15% formamidu.</li>
		<li>Natychmiast przed użyciem dodaj 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteaz i specjalistyczny inhibitor RNazy. 
		UWAGA: Przechowuj formamid w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. 
		UWAGA: Formamid jest teratogenny i zagrożeniem dla rozrodczości. Obsługę formamidu należy prowadzić w komorze wentylacyjnej, używając rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. Unikaj wdychania i kontaktu ze skórą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor wash
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor wash zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS i 0,5% deoxycholate sodu.</li>
		<li>Chroń bufor wash przed światłem podczas przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor proteinazy K (PK)
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor PK zawierający 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA i 0,5% SDS.</li>
		<li>Dodaj proteinazę K do końcowego stężenia 5% natychmiast przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zaprojektuj i przygotuj sondy
<ol>
	<li>Zaprojektuj sondy antysens
	<ol>
		<li>Zaprojektuj sondy oligonukleotydowe antysens, korzystając z dostępnego online projektanta sond dostępnego na stronie singlemoleculefish.com18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj sondy z biotiną
	<ol>
		<li>Zamów sondy DNA antysens zawierające modyfikację 3'-BiotinTEG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pulę sond
	<ol>
		<li>Rozcieńcz każdą sondę indywidualnie do 100 μM.</li>
		<li>Wymieszaj równe objętości wszystkich sond, aby uzyskać pulę sond. Utrzymaj ostateczne łączne stężenie oligonukleotydów na poziomie 100 μM.</li>
		<li>Przechowuj pulę sond w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Zalecane parametry projektowania sond to: (i) jedna sonda na 100 bp RNA docelowego, (ii) zawartość GC docelowego RNA na poziomie 45%, (iii) długość sondy 20 nt i (iv) odstęp 60-80 nt między sondami. 
		UWAGA: Jeśli RNA przekracza limit wielkości akceptowany przez projektanta sond, podziel sekwencję na mniejsze segmenty przed projektowaniem. Wyklucz regiony repetytywne i regiony o rozległej homologii sekwencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeprowadź zbiór komórek, dysocjację tkanki i wiązanie UV
<ol>
	<li>Przygotuj kontrole no-UV
	<ol>
		<li>Przygotuj próbki kontrolne równolegle z próbkami eksperymentalnymi.</li>
		<li>Pomiń krok wiązania UV w próbkach kontrolnych.</li>
		<li>Przeprowadź wszystkie kolejne procedury, w tym sonicację, RNA-Protein pull-down, ekstrakcję RNA i ekstrakcję białka, identycznie dla obu grup. 
		UWAGA: Użyj kontroli no-UV, aby odróżnić RNA-białko zależne od UV od niespecyficznego wiązania tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz komórki i przeprowadź wiązanie UV
	<ol>
		<li>Przepłucz hodowanych komórek
		<ol>
			<li>Przepłucz komórki trzy razy PBS, aby usun

<ol>
	<li>Mattick JS, et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(6):430-447.</li>
	<li>Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 2024;187(23):6451-6485.</li>
	<li>Ferr&#232; F, Colantoni A, Helmer-Citterich M. Revealing protein-lncRNA interaction. Brief Bioinform. 2016;17(1):106-116.</li>
	<li>Yi W, Yan J. Decoding RNA-protein interactions: Methodological advances and emerging challenges. Adv Genet (Hoboken). 2025;6(2):2500011.</li>
	<li>Elguindy MM, Mendell JT. NORAD-induced PUMILIO phase separation is required for genome stability. Nature. 2021;595(7866):303-308.</li>
	<li>Gr&#228;we C, Stelloo S, Van Hout FAH, Vermeulen M. RNA-centric methods: Toward the interactome of specific RNA transcripts. Trends Biotechnol. 2021;39(9):890-900.</li>
	<li>Chu C, Chang HY. ChIRP-MS: RNA-directed proteomic discovery. Methods Mol Biol. 2018;1861:37-45.</li>
	<li>Chu C, et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 2015;161(2):404-416.</li>
	<li>Suryo Rahmanto A, et al. K6-linked ubiquitylation marks formaldehyde-induced RNA-protein crosslinks for resolution. Mol Cell. 2023;83(23):4272-4289.e10.</li>
	<li>Sun W, et al. Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo. Nat Chem. 2023;15(1):21-32.</li>
	<li>Esteban-Serna S, McCaughan H, Granneman S. Advantages and limitations of UV cross-linking analysis of protein-RNA interactomes in microbes. Mol Microbiol. 2023;120(4):477-489.</li>
	<li>Welp LM, et al. Chemical crosslinking extends and complements UV crosslinking in analysis of RNA/DNA nucleic acid-protein interaction sites by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 2025;53(15).</li>
	<li>McHugh CA, Guttman M. RAP-MS: A method to identify proteins that interact directly with a specific RNA molecule in cells. Methods Mol Biol. 2018;1649:473-488.</li>
	<li>Lewandowski JP, et al. The Tug1 lncRNA locus is essential for male fertility. Genome Biol. 2020;21(1):237.</li>
	<li>Wang S, et al. LncRNA Tug1 maintains blood-testis barrier integrity by modulating ccl2 expression in high-fat diet mice. Cell Mol Life Sci. 2022;79(2):114.</li>
	<li>Li Y, et al. The landscape of RNA binding proteins in mammalian spermatogenesis. Science. 2024;386(6720).</li>
	<li>Xu Q, et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. J Vis Exp. 2019;(147):59681.&#160;</li>
	<li>Raj A, Van Den Bogaard P, Rifkin SA, Van Oudenaarden A, Tyagi S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 2008;5(10):877-879.</li>
	<li>Urdaneta EC, et al. Purification of cross-linked RNA-protein complexes by phenol-toluol extraction. Nat Commun. 2019;10(1):990.</li>
	<li>Van Nostrand EL, et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods. 2016;13(6):508-514.</li>
	<li>Van Nostrand EL, et al. A large-scale binding and functional map of human RNA-binding proteins. Nature. 2020;583(7818):711-719.</li>
	<li>Dun MD, Aitken RJ, Nixon B. The role of molecular chaperones in spermatogenesis and the post-testicular maturation of mammalian spermatozoa. Hum Reprod Update. 2012;18(4):420-435.</li>
	<li>Urdaneta EC, Beckmann BM. Fast and unbiased purification of RNA-protein complexes after UV cross-linking. Methods. 2020;178:72-82.</li>
	<li>Greenberg JR. Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins. Nucleic Acids Res. 1979;6(2):715-732.</li>
	<li>Rinn JL, et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 2007;129(7):1311-1323.</li>
	<li>Clemson CM, et al. An architectural role for a nuclear noncoding RNA: NEAT1 RNA is essential for the structure of paraspeckles. Mol Cell. 2009;33(6):717-726.</li>
	<li>Chen H, et al. Dissecting mammalian spermatogenesis using spatial transcriptomics. Cell Rep. 2021;37(5):109915.</li>
	<li>Hafner M, et al. CLIP and complementary methods. Nat Rev Methods Primers. 2021;1(1):20.</li>
	<li>Ramanathan M, Porter DF, Khavari PA. Methods to study RNA-protein interactions. Nat Methods. 2019;16(3):225-234.</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych.

cPDiRT został opracowany jako zmodyfikowany protokół oparty na ChIRP, który zastępuje wiązanie krzyżowe paraformaldehydem (PFA) wiązaniem krzyżowym UV w celu selektywnego wychwytywania bezpośrednich interakcji lncRNA-białko. Poprzez połączenie enzymatycznego dysocjacji świeżego tkanki jądrowej na pojedyncze komórki z wiązaniem krzyżowym UV, mapowanie bezpośrednich interakcji zostało rozszerzone z linii komórek hodowanych do tkanek naturalnych. Równoległe eksperymenty na hodowane komórki umożliwiły bezpośrednie porównanie...

Ostatnio przeprowadzone badania transkryptomiczne o wysokiej wydajności odkryły tysiące długich niekodujących RNA (lncRNA), które biorą udział w różnorodnych procesach biologicznych, od organizacji chromatyny po sygnalizację komórkową1,2. Mimo ich szerokiego występowania i funkcjonalnego znaczenia, mechanizmy molekularne większości lncRNA pozostają słabo poznane. Główną przeszkodą jest identyfikacja ich fizycznych partnerów białkowych, szczególnie białek wiążących RNA (RBP)3,4,5.
Obecne metody RNA-centryczne opierają się głównie na chemicznym skraplaniu, które wychwytuje zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie interakcje RNA-białko. W rezultacie, podejścia te są bardziej odpowiednie do globalnego mapowania interaktomu niż do identyfikacji prawdziwych bezpośrednich kontaktów6. Kompleksowe identyfikowanie białek wiążących RNA z kolejnym spektrometrią mas (ChIRP-MS) to szeroko stosowana technika do mapowania interakcji lncRNA-RBP ze względu na prosty projekt sondy i efektywny przepływ pracy7,8. Konwencjonalny ChIRP-MS używa skraplacza paraformaldehydowego (PFA), który wychwytuje zarówno bezpośrednie kontakty RNA-białko, jak i pośrednie skojarzenia pośredniczone przez czynniki mostujące9,10.
Natomiast skraplanie UV przy 254 nm oferuje kluczową zaletę. Łączy ono kowalemnie RNA i białka tylko wtedy, gdy znajdują się w odległości niemal zerowej (zazwyczaj < 1 Å)11. Proces ten zamienia wiązania wodorowe w stabilne wiązania kowalencyjne i umożliwia rygorystyczne warunki mycia w wysokiej zasadowości, które usuwają niekowalencyjnie związane pośrednie interaktory. W rezultacie, podejścia UV-oparte zapewniają większą specyficzność dla bezpośrednich interakcji RNA-białko niż metody skraplania chemicznego12,13. Niemniej, podejścia UV-oparte są nadal niedostatecznie wykorzystywane w badaniach interaktomu lncRNA pochodzących z tkanek, głównie ze względu na obawy dotyczące efektywności skraplania i ograniczonego przenikania UV.
Aby zbadać bezpośrednie interakcje lncRNA-białko w fizjologicznie istotnym kontekście, lncRNA Tug1 został wybrany jako system modelowy. Tug1 stanowi idealny punkt odniesienia do walidacji tkankowego przepływu pracy dotyczącego bezpośrednich interakcji ze względu na jego poważny fenotyp knockout i wysokie stężenie w jądrach. Genetyczne wyłączenie Tug1 powoduje całkowitą bezpłodność u samców, upośledzenie spermatogenezy i nieprawidłową morfologię plemników14. Ponadto, Tug1 wspiera funkcję komórek Sertolego i integralność bariery krew-jądro w myszy na wysokotłuszczowej diecie15. Pomimo tych dobrze ustalonych fenotypów, bezpośrednie partnerzy białkowi, którzy mediują funkcję Tug1 w jądrach – organie wyrażającym dużą liczbę RBP, które zostały niedawno eksperymentalnie opisane16 – pozostają nieznani. Ta luka w wiedzy w dużej mierze odzwierciedla fakt, że większość metod mapowania interakcji lncRNA-białko została opracowana dla układów komórkowych.
Aby zmierzyć się z tą ograniczeniem, struktura ChIRP została zmodyfikowana poprzez zastąpienie skraplania PFA skraplaniem UV w celu uchwycenia białek, które bezpośrednio współpracują z Tug1. Kandydatki do interakcji zostały niezależnie zweryfikowane przez ulepszoną immunoprecypitację z krzyżowaniem poprzez sekwencjonowanie głębokie (eCLIP-seq)17. Przepływ pracy został następnie rozszerzony na zastosowania tkankowe poprzez odizolowanie świeżej tkanki jądrowej myszy na pojedyncze komórki przed skraplaniem UV. Ten zoptymalizowany podejście został oznaczony jako cPDiRT (uchwytywanie białek bezpośrednio współpracujących z docelowymi RNA).
Zastosowanie cPDiRT do Tug1 w jądrze myszy umożliwiło mapowanie bezpośrednich interakcji w natywnym kontekście tkankowym. Równoległe eksperymenty na hodowanych komórkach zapewniły bezpośrednie porównanie profili interakcji opartych na PFA i UV. W połączeniu z niezależną walidacją eCLIP, to podejście wygenerowało wysoko-zaufaną zbiór partnerów molekularnych, które mogą przyczyniać się do funkcji Tug1 podczas spermatogenezy. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia uchwytywanie białek, które bezpośrednio współpracują z docelowym lncRNA zarówno w komórkach hodowanych, jak i w natywnych tkankach. Definiując bezpośrednie interaktomu Tug1 w jądrze, ta metoda poszerza badania mechanistyczne lncRNA niezbędnego dla płodności i zapewnia ogólną platformę do badania interakcji lncRNA-białko w tkankach rozrodczych i innych złożonych tkankach.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA Solution</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>do dysocjacji tkanki i przygotowania pojedynczej zawiesiny komórkowej</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>do oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>AffinityScript Reverse Transcriptase</td><td>Agilent</td><td>600107</td><td>do syntezy eCLIP cDNA</td></tr><tr><td>Anti-CCT3 Antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab225878</td><td>przeciwciało do eCLIP</td></tr><tr><td>Anti-PABPC1 Antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab312314</td><td>przeciwciało do eCLIP</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>do enzymatycznej dysocjacji tkanki jąder</td></tr><tr><td>Dephosphorylation reagents (T4 PNK)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td>do defosforylacji RNA eCLIP</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>do hodowli komórkowej i buforu dysocjacji tkanki</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>do wychwytywania związków probe-RNA-białko z biotinylacją</td></tr><tr><td>DynaMag-15 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12301D</td><td>do separacji magnesowych cząstek</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>do separacji magnesowych cząstek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>do chelatacji dwuwalencyjnych kationów w buforach lizy i płukania</td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td>do oczyszczania eCLIP cDNA</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>do zatrzymania trawienia trypsyną</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td>do przygotowania buforu hybrydyzacji</td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>TUOHE</td><td>LF-I</td><td>do hybrydyzacji sond i płukania cząstek</td></tr><tr><td>Low-Melting-Temperature Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>do selekcji wielkości biblioteki eCLIP</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>do selekcji wielkości biblioteki eCLIP</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>do oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>do przygotowania buforu płukania z wysokim stężeniem soli</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>GE Healthcare / Amersham</td><td>10600002</td><td>do transferu zachodów eCLIP</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85125</td><td>do detergentu buforu płukania</td></tr><tr><td>Nuclease- and protease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td>do przygotowania roztworów wolnych od nukleazy</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td>do selekcji wielkości eCLIP</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>do separacji białek SDS-PAGE</td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>do mycia i resuspensji komórek</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>inhibitor proteaz serinowych do buforu lizy komórek; dodaje się świeżo przed użyciem</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>inhibitor proteaz o szerokim spektrum do buforu lizy komórek; dodaje się świeżo przed użyciem</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850</td><td>do trawienia białek w ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>qRT-PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11704044</td><td>do ilościowego RT-PCR w celu potwierdzenia wzbogacenia RNA</td></tr><tr><td>RNase/Protease-Free DNase I Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td>do dysocjacji tkanki</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>do oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Sample Loading Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0286</td><td>do przygotowania próbek białkowych</td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>do oczyszczania eCLIP cDNA</td></tr><tr><td>Silver Stain Kit</td><td>Beyotime</td><td>P00175</td><td>do wizualizowania białek w żelach SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>do detergentu buforu płukania</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>do lizy komórek i denaturacji białek</td></tr><tr><td>Superase-in RNase Inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td>specjalizowany inhibitor RNase; dodaje się świeżo przed użyciem</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>do łączenia adapterów eCLIP</td></tr><tr><td>Tris&ndash;HCl (pH 7.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>do przygotowania buforów lizy, hybrydyzacji i płukania</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026CN</td><td>do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Ultrasonic cell crusher</td><td>ATPIO</td><td>ATPIO-650D</td><td>do lizy komórek i fragmentacji DNA</td></tr><tr><td>Ultraviolet Crosslinker</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP CL-1000</td><td>do UV crosslinking interakcji RNA-białko</td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>do degradacji białek eCLIP na membranie</td></tr></tbody></table>

metoda chirp oparta na uv do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z lncrna: od hodowanych komórek do jąder mysich

A UV-Based ChIRP Method For The Verifiable Identification of Proteins That Directly Interact With LncRNA: From Cultured Cells To Mouse Testis

Długie niekodujące RNA (lncRNA) stały się ważnymi regulatorami różnorodnych procesów biologicznych. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw funkcji większości lncRNA pozostają słabo poznane. Identyfikacja oddziałujących białek, szczególnie białek wiązających RNA (RBP), jest kluczową strategią w celu wyjaśnienia funkcji lncRNA. Wśród dostępnych metod, kompleksowa identyfikacja białek wiązających RNA (ChIRP) połączona ze spektrometrią mas jest szeroko stosowana ze względu na prosty projekt sondy i prosty przebieg. Konwencjonalna ChIRP opiera się na fiksacji paraformaldehydem (PFA), która rejestruje zarówno bezpośrednie kontakty RNA-białko, jak i pośrednie interakcje pośredniczone przez czynniki łączące. W przeciwieństwie do tego, fiksacja UV połączona ze ścisłymi warunkami płukania preferencyjnie zachowuje bezpośrednie interakcje RNA-białko. Wykorzystując lncRNA Tug1 jako model, fiksacja UV i fiksacja PFA zostały porównane w ramach ChIRP w hodowlach komórkowych, co wykazało, że metoda ChIRP oparta na UV wzbogaca bezpośrednie interakcje lncRNA-białko. Ta metoda oparta na UV została następnie rozszerzona na jądra myszy, gdzie tkanki zostały rozdrobnione do zawiesiny jednokomórkowych przed fiksacją UV, umożliwiając identyfikację białek wiążących Tug1 w naturalnym kontekście tkankowym. Porównanie z interaktoma pochodzącymi z linii komórkowych ujawniło zarówno wspólne, jak i specyficzne dla tkanki interaktory. Dwie wspólne bezpośrednie interakcje zostały niezależnie zweryfikowane przez wzmocnioną immunoprecypitację krzyżową (eCLIP). Ta metoda ChIRP oparta na UV jest określana jako cPDiRT (przechwytywanie białek bezpośrednio współpracujących z celem RNA). Razem, cPDiRT umożliwia identyfikację białek wiążących lncRNA zarówno w hodowlach komórkowych, jak i w naturalnych tkankach. Połączenie dysocjacji tkankowej i fiksacji UV zapewnia szeroko stosowalną strategię do badania bezpośrednich interakcji lncRNA-białko w różnych układach narządowych.

Aby zidentyfikować białka wiążące Tug1, do procedury ChIRP włączono sieciowanie UV, ustanawiając metodę nazwaną cPDiRT (Rysunek 1). W pierwszej kolejności przeprowadzono konwencjonalny ChIRP w komórkach GC2, aby wzbogacić białka oddziałujące z Tug1 (Rysunek 2A, B). Analiza spektrometrią mas zidentyfikowała ponad 190 białek wzbogaconych w stosunku do kontroli negatywnej (Rysunek 2C; Tabela u...

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Long non-coding RNAs (lncRNAs) have emerged as important regulators of diverse biological processes. However, the molecular mechanisms underlying the ...

W ramach naszych badań opracowano metodę cPDiRT, czyli metodę sieciowania promieniami UV służącą do bezpośredniego mapowania oddziaływań RNA i białek zarówno w hodowlach komórkowych, jak i w tkankach natywnych, takich jak jądra, co pozwoliło na opisanie mechanizmów molekularnych TUG1 w spermatogenezie. Niniejszy protokół umożliwia bezpośrednie mapowanie oddziaływań RNA-białko w szerokim zakresie systemów, od hodowli komórkowych po nienaruszone tkanki natywne. W celu rozpoczęcia procedury należy trzykrotnie przemyć komórki GC2 buforem PBS, aby usunąć pozostałości pożywki hodowlanej.Następnie dodaj do naczynia 3 ml PBS i rozprowadź go równomiernie przed usieciowaniem. Naświetlaj komórki w utrawioletsie o długości fali 254 nm w urządzeniu do sieciowania, stosując dawkę 4 000 mJ/cm². Zbierz komórki do PBS i odwiruj zawiesinę komórkową przy 3000G przez 5 minut w temperaturze 4 °C.Po odlaniu supernatantu, zważ osad i potwierdź, że jego masa wynosi co najmniej 500 miligramów na próbkę. Pobierz jądra od czterotygodniowych samców myszy C57BL6. Przemyj tkankę jądrową po usunięciu otoczek dwukrotnie, używając od 5 do 10 mililitrów DMEM.Następnie inkubować 100 mg tkanki w 10 ml DMEM zawierającego 1 mg/ml kolagenazy IV w temperaturze 37 °C. Kontynuować trawienie przez 5 do 15 minut, aż do uwolnienia kanalików jawyciej. Następnie odwirować zawiesinę przy 1000G przez jedną minutę w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.Przemyć osad 5 do 10 mililitrów DMEM. Ponownie odwirować zawiesinę przy 1000G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zawiesić osad w 0,25% trypsynie zawierającej jeden miligram na mililitr doksyrybonukleazy I. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 do 15 minut.Następnie, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, dodaj taką samą objętość DMEM uzupełnionego o 10% FBS. Przefiltruj zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm. Odwiruj komórki przy 2000G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odlej supernatant i przemyj osad 5 do 10 mililitrów PBS. Ponownie odwiruj zawiesinę przy 2000G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resuspenduj zawiesinę pojedynczych komórek w PBS i rozdziel ją równomiernie na 15-centymetrową płytkę hodowlaną.Przeprowadzić sieciowanie komórek jąder zgodnie z procedurą opisaną wcześniej dla komórek GC2. W przypadku komórek kontrolnych pominąć etap naświetlania. Zebrać zsieciowane komórki.Odwiruguj zawiesinę z prędkością 3000G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odlej nadsącz. Aby zapewnić minimalną masę osadu wynoszącą 500 miligramów, połącz komórki jądr wyizolowane z co najmniej 10 do 12 myszy. Po zważeniu osadu, ponownie zawieś go w buforze do lizy komórek, stosując proporcję 100 miligramów osadu na jeden mililitr buforu.Po wirowaniu w vortexie poddaj próbkę sonikacji przy użyciu skupiającego sonikatora lub sonikatora kąpielowego, aż lizat stanie się wizualnie przejrzysty. Następnie odmierz alikwoty o objętości około 10 µL lizatu do probówek do mikrocentryfugi w celu analizy RNA i białek. Do lizatu dodaj 30 µL uprzednio przemytych kulek magnetycznych.Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji, delikatnie mieszając. Umieść próbki na statywie magnetycznym przez około jedną minutę lub do czasu, aż roztwór stanie się klarowny. Przenieś oczyszczony lizat do nowej probówki.Umieść nową probówkę na statywie magnetycznym. Następnie przenieś lizat do innej probówki, aby usunąć pozostałe kuleczki. Do każdej próbki dodaj dwie objętości buforu hybrydyzacyjnego ogrzanego do 37 °C.Dodaj biotynilowane sondy DNA w stosunku jednego mikrolitra zapasu sondy o stężeniu 100 mikromol na jeden mililitr lizatu. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przy rotacji end-over-end przez 12 do 16 godzin w piecu do hybrydyzacji. Bezpośrednio przed użyciem przemyj 100 mikrolitrów magnetycznych kulek z streptawidyną trzykrotnie buforem do lizy komórek.Następnie należy usunąć pozostały bufor po ostatnim przemyciu. Krótko odwiruj probówki z reakcją hybrydyzacji. Następnie dodaj zhybrydyzowaną próbkę do przemytych kulek i delikatnie wymieszaj.Przenieś zawiesinę kulek z powrotem do oryginalnej probówki i inkubuj w temperaturze 37°C przy mieszaniu przez 30 do 40 minut. Po inkubacji krótko odwiruj próbki. Umieść probówki na statywie magnetycznym na jedną do dwóch minut lub do momentu, aż roztwór stanie się klarowny.Następnie odlej nadsącz. Aby wyprać kuleczki, dodaj 1 mL buforu do płukania i inkubuj probówki w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po pięciu płukaniach przenieś 1-10% kuleczek do nowej probówki w celu analizy RNA.Na koniec dodaj 40 µL 1X buforu do próbek SDS do pozostałych kulek. Gotuj próbki w temperaturze 95 °C przez 30 minut, aby uwolnić białka i odwrócić wiązania krzyżowe. Odzyskaj białka do dalszej analizy metodą spektrometrii mas.Analiza spektrometrii mas ChIRP zidentyfikowała ponad 190 białek wzbogaconych w stosunku do kontroli negatywnej w komórkach GC2. Przy dawce UV wynoszącej 4 000 millijoules per square centimeter, metoda cPDiRT-MS zidentyfikowała bardziej selektywny zestaw białek. Ponad dwie trzecie tych białek pokrywało się z białkami zidentyfikowanymi za pomocą konwencjonalnego ChIRP-MS.Większość białek zidentyfikowanych za pomocą co najmniej dwóch unikalnych peptydów została wykryta w sposób powtarzalny w powtórzeniach biologicznych zarówno w komórkach GC2, jak i w jądrach myszy. Analiza ontologii genów białek zidentyfikowanych w sposób powtarzalny ujawniła procesy biologiczne w szerokim zakresie zgodne ze znanymi funkcjami TUG1. Porównanie zbiorów danych z komórek GC2 i jąder myszy pozwoliło na zidentyfikowanie 15 białek, które uległy wspólnemu wzbogaceniu.Udoskonalona sekwencjonowanie immunoprecypitacji z sieciowaniem (cross-linking immunoprecipitation sequencing) ujawniło wyraźne i specyficzne piki wiązania białek PABPC1 i CCT3 na transkrypcie TUG1. Metoda cPDiRT pozwala badaczom na identyfikację i pomiar białek, które bezpośrednio oddziałują ze specyficznym, powiązanym RNA zarówno w komórkach hodowlanych, jak i w tkankach natywnych. Najważniejszym wyzwaniem jest osiągnięcie wydajnego sieciowania UV przy jednoczesnym zapewnieniu wysokiej specyficzności dla bezpośrednich interakcji RNA i białek.Nasz protokół będzie wspierał przyszłe badania nad zastosowaniem tego podejścia do innych cząsteczek RNA oraz tkanek w celu odtworzenia bezpośredniego działania białek wiążących RNA w procesach rozwoju i reprodukcji.

a-uv-based-chirp-method-for-verifiable-identification-proteins-that

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda ChIRP oparta na UV do weryfikowalnej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: od hodowanych komórek po jądra myszy

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten film demonstruje metodę ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do identyfikacji białek wiążących RNA w jądrach myszy. eCLIP umożliwia precyzyjną identyfikację miejsc wiązania, w których białka wiążące RNA (RBP) oddziałują ze swoimi docelowymi RNA.

Ulepszona metoda immunoprecypitacji sieciowania do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Luminescencyjna identyfikacja elementów funkcjonalnych w nieulegających translacji regionach 3' (3'UTR) (3'LIFE) to technika identyfikacji funkcjonalnej regulacji w 3'UTR przez miRNA lub inne czynniki regulacyjne. Protokół ten wykorzystuje metodologię o wysokiej przepustowości, taką jak transfekcja 96-dołkowa i testy lucyferazy, do badania przesiewowego setek domniemanych interakcji pod kątem represji funkcjonalnej.

Wykrywanie celów miRNA w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3'LIFE

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Nanjing Medical University.  Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Przeglądaj więcej filmów