Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

Cześć, nazywam się Frank Buchholz. Jestem liderem grupy w Max PL Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. Nasza praca jest kontynuowana.

Nasza praca obejmuje dwa aspekty. Pierwszy dotyczy przesiewania RNA I. Drugi koncentruje się na opracowaniu rekombinazy specyficznej dla miejsca w celu zaawansowanej inżynierii genomu.

Moje wykształcenie to biologia i biologia molekularna, a studia ukończyłem na kierunku biologia. Następnie zdobyłem stopień doktora w Europejskich Laboratoriach Biologii Molekularnej (EMBL) w Heidelbergu, a potem odbyłem staż podoktorski w San Francisco na UCSF pod kierunkiem Mike'a Bishopa, pracując nad modelami zwierzęcymi białaczki. Instytut Maxa Plancka tutaj w Dreźnie stara się łączyć, powiedzmy, przynajmniej dwa różne aspekty: biologię rozwoju i biologię komórki w ramach dążenia do tego, co można by określić jako ich główny motyw, czyli próbę zrozumienia, w jaki sposób komórki tworzą tkanki.

Jest to w zasadzie nadrzędny cel instytutu tutaj w Ston. Pracujemy głównie w dwóch obszarach. Jeden z nich dotyczy przeprowadzania przesiewów RNAi w celu identyfikacji nowych funkcji wcześniej nieopisanych genów w procesach biologicznych.

Kolejny obszar dotyczy inżynierii genomowej, w ramach której staramy się opracować technologie umożliwiające zaawansowaną modyfikację genomów z wykorzystaniem rekombinaz specyficznych dla miejsca. Chociaż rekombinazy specyficzne dla miejsca odkryto, powiedziałbym, w latach osiemdziesiątych – na przykład rekombinaza cre, z którą pracujemy, została odkryta na początku lat osiemdziesiątych. Jest to w rzeczywistości białko bakteriofaga. Pochodzi więc pierwotnie z bakteriofaga, czyli w zasadzie wirusa zakażającego bakterie.

Jest to zatem bardzo odległe od tego, co stosuje się obecnie, jednak szybko zauważono, że enzymy te mogą pełnić niezwykle interesujące funkcje, które mogą być wykorzystane również w innych organizmach. Rekombinazy specyficzne względem miejsca są białkami wiążącymi się z DNA; wiążą się one specyficznie z określoną sekwencją DNA, a po związaniu z tymi sekwencjami docelowymi są w stanie przeciąć DNA, a następnie przearanżować te miejsca, wykonując w zasadzie proces ligacji. Zatem za pomocą tej specyficznej rekombinacji można przearanżować sekwencje DNA, podobnie jak za pomocą nożyczek i kleju, co w zasadzie pozwala łączyć sekwencje DNA w sposób, w jaki nie były one połączone wcześniej.

Zatem te rekombinazy swoiste dla miejsca, jak wspomniałem, pierwotnie odkryte w bakteriach lub fagech bakteryjnych, zostały następnie przetestowane pod kątem ich działania w innych organizmach. Co ciekawe, spełniały one swoją funkcję również w innych organizmach.

Zatem, jeśli w organizmie znajduje się miejsce docelowe dla rekombinazy swoistej miejsca, która została w nim np. wprowadzona metodami inżynierii genetycznej, enzymy te będą mogły spełnić swoją funkcję. Bardzo powszechne jest zastosowanie tych rekombinaz swoistych miejsca, w szczególności tych, które nie wymagają kofaktorów, takich jak rekombinaza flp lub rekombinaza cre, którą wykorzystaliśmy jako punkt wyjścia do prac, o których dzisiaj mówimy. Działają one bez udziału kofaktorów.

A jeśli wyexprimi się je na przykład w organizmie zwierzęcia lub w komórkach zwierzęcych, to mogą one odnaleźć rozpoznawane sekwencje w tym organizmie, a następnie w tym miejscu dokonać wycięcia i wklejenia, usuwając określone sekwencje. Enzym ten był zatem z dużym sukcesem wykorzystywany w tak zwanej mutagenezie warunkowej, na przykład u myszy. Załóżmy więc, że mamy gen, o którym wiemy, że jest interesujący i chcemy poznać funkcję tego genu.

Bardzo znanym eksperymentem jest tworzenie tzw. myszy z nokautem. W przypadku technologii, o której ostatnio mowa, przyznano w tym roku Nagrodę Nobla za umożliwienie przeprowadzenia delecji genu u myszy. Czasami jednak okazuje się, że po wyeliminowaniu genu u zwierzęcia okazuje się on genem niezbędnym do życia, co prowadzi do śmierci myszy na bardzo wczesnym etapie embriogenezy.

Wskazuje to, że dany gen jest bardzo ważny, ale nie mówi nam nic o jego konkretnej funkcji. Obecnie bardzo popularną metodą ustalenia tej funkcji jest wykonanie tzw. warunkowego nokautu. W tym celu flankuje się badany gen miejscami docelowymi dla specyficznych rekombinaz.

Oznacza to, że u tych myszy gen będzie ulegał ekspresji tak jak u myszy typu dzikiego. Jeśli jednak skrzyżujemy te mysze z myszą wykazującą ekspresję rekombinazy CRE, na przykład pod promotorem specyficznym dla danej tkanki, można usunąć badany gen wyłącznie w określonych komórkach, które można zdefiniować na podstawie miejsca ekspresji rekombinazy. Z tych eksperymentów wiemy również, że takie rekombinacje mogą być bardzo wydajne w usuwaniu sekwencji z całych organizmów.

Było to warunkiem wstępnym dla naszej koncepcji opracowania rekombinazy, która przecinałaby w miejscu zdefiniowanym przez nas, co do tej pory stanowiło jedno z głównych ograniczeń w dalszym rozwoju rekombinaz specyficznych dla miejsca. Należało bowiem wprowadzić miejsce rozpoznawania celu do genomu komórki organizmu, którego chciano użyć. Pomyśleliśmy zatem, czy możemy przełamać tę barierę?

W zasadzie wykorzystuje się do tego ewolucję molekularną. O ile mi wiadomo, obecnie rekombinazy swoiste względem miejsca nie są stosowane w terapii. Jak wspomniałem, dzieje się tak głównie dlatego, że u człowieka nie występuje miejsce docelowe, które byłoby rozpoznawane przez jakąkolwiek z naturalnie występujących rekombinaz.

Muszą one zatem zostać najpierw zmodyfikowane, aby można było je wykorzystać w celach terapeutycznych. Obecnie znajdujemy się dopiero na samym początku drogi do ustalenia, czy jest to w ogóle możliwe. Czas pokaże, czy rzeczywiście zdołamy opracować te enzymy do zastosowań terapeutycznych i czy będzie to wykonalne.