Name: Zasady technologii rekombinazy specyficznej dla miejsca (SSR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:11:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj technologię rekombinazy specyficznej dla miejsca (SSR) i system Cre/lox w inżynierii genomu. Dowiedz się, jak warunkowa mutageneza umożliwia precyzyjną manipulację genami w badaniach nad funkcją genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (ssr)

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Technologia rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) umożliwia manipulację strukturą genów w celu zbadania ich funkcji i stała się nieodzownym narzędziem biologii molekularnej. Rekombinazy specyficzne dla miejsca są białkami, które wiążą się z określonymi sekwencjami docelowymi DNA. System Cre/lox został po raz pierwszy opisany w bakteriofagach w latach 80. XX wieku. Rekombinaza Cre jest topoizomerazą typu I, która katalizuje rekombinację specyficzną dla miejsca w DNA pomiędzy dwiema sekwencjami loxP (locus of X-over P1). System Cre/lox nie wymaga żadnych kofaktorów. Sekwencje loxP zawierają odrębne miejsca wiązania dla rekombinaz Cre, które otaczają kierunkową sekwencję rdzeniową, w której zachodzi rekombinacja i reorganizacja. Gdy komórki zawierają sekwencje loxP i wykazują ekspresję rekombinazy Cre, dochodzi do zdarzenia rekombinacyjnego. Dwuniciowy DNA jest przecinany w obu miejscach loxP przez rekombinazę Cre, reorganizowany, a następnie ligowany („nożyczki i klej”). Produkty zdarzenia rekombinacyjnego zależą od względnej orientacji asymetrycznych sekwencji.
Technologia SSR jest często wykorzystywana jako narzędzie do badania funkcji genów. W tej metodzie geny docelowe są flankowane sekwencjami loxP, będącymi miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę Cre (tzw. geny „floxed”). Następnie zwierzęta te krzyżuje się z osobnikami wykazującymi ekspresję rekombinazy Cre pod kontrolą promotora specyficznego dla danej tkanki. W tkankach, w których zachodzi ekspresja rekombinazy Cre, enzym ten wiąże się z sekwencjami docelowymi i wycina floxowany gen. Kontrolowana delecja genu umożliwia badanie jego funkcji w konkretnych tkankach oraz w określonych punktach czasowych. Analiza funkcji genów z wykorzystaniem technologii SSR — czyli mutogeneza warunkowa — wykazuje znaczące zalety w porównaniu z tradycyjnymi nokautami, w których delecja genu jest często letalna.

Wprowadzenie technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) oraz systemu Cre/lox doprowadziło do licznych osiągnięć w biologii molekularnej i okazało się cennym narzędziem do oceny funkcji genów u zwierząt transgenicznych. W niniejszym wywiadzie omówiono mechanizm rekombinacji specyficznej dla miejsca za pomocą rekombinazy cyklizacyjnej (Cre) oraz sposób, w jaki zastosowanie tego enzymu doprowadziło do opracowania mutagenezy warunkowej, która wykazuje znaczące zalety w porównaniu z tradycyjnymi strategiami nokautu.

Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

Technologia rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) umożliwia manipulację strukturą genów w celu badania ich funkcji i stała się nieodzownym narzędziem biologii molekularnej...

Cześć, nazywam się Frank Buchholz. Jestem liderem grupy w Max PL Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. Nasza praca jest kontynuowana.Nasza praca obejmuje dwa aspekty. Pierwszy dotyczy przesiewania RNA I. Drugi koncentruje się na opracowaniu rekombinazy specyficznej dla miejsca w celu zaawansowanej inżynierii genomu.Moje wykształcenie to biologia i biologia molekularna, a studia ukończyłem na kierunku biologia. Następnie zdobyłem stopień doktora w Europejskich Laboratoriach Biologii Molekularnej (EMBL) w Heidelbergu, a potem odbyłem staż podoktorski w San Francisco na UCSF pod kierunkiem Mike'a Bishopa, pracując nad modelami zwierzęcymi białaczki. Instytut Maxa Plancka tutaj w Dreźnie stara się łączyć, powiedzmy, przynajmniej dwa różne aspekty: biologię rozwoju i biologię komórki w ramach dążenia do tego, co można by określić jako ich główny motyw, czyli próbę zrozumienia, w jaki sposób komórki tworzą tkanki.Jest to w zasadzie nadrzędny cel instytutu tutaj w Ston. Pracujemy głównie w dwóch obszarach. Jeden z nich dotyczy przeprowadzania przesiewów RNAi w celu identyfikacji nowych funkcji wcześniej nieopisanych genów w procesach biologicznych.Kolejny obszar dotyczy inżynierii genomowej, w ramach której staramy się opracować technologie umożliwiające zaawansowaną modyfikację genomów z wykorzystaniem rekombinaz specyficznych dla miejsca. Chociaż rekombinazy specyficzne dla miejsca odkryto, powiedziałbym, w latach osiemdziesiątych – na przykład rekombinaza cre, z którą pracujemy, została odkryta na początku lat osiemdziesiątych. Jest to w rzeczywistości białko bakteriofaga. Pochodzi więc pierwotnie z bakteriofaga, czyli w zasadzie wirusa zakażającego bakterie.Jest to zatem bardzo odległe od tego, co stosuje się obecnie, jednak szybko zauważono, że enzymy te mogą pełnić niezwykle interesujące funkcje, które mogą być wykorzystane również w innych organizmach. Rekombinazy specyficzne względem miejsca są białkami wiążącymi się z DNA; wiążą się one specyficznie z określoną sekwencją DNA, a po związaniu z tymi sekwencjami docelowymi są w stanie przeciąć DNA, a następnie przearanżować te miejsca, wykonując w zasadzie proces ligacji. Zatem za pomocą tej specyficznej rekombinacji można przearanżować sekwencje DNA, podobnie jak za pomocą nożyczek i kleju, co w zasadzie pozwala łączyć sekwencje DNA w sposób, w jaki nie były one połączone wcześniej.Zatem te rekombinazy swoiste dla miejsca, jak wspomniałem, pierwotnie odkryte w bakteriach lub fagech bakteryjnych, zostały następnie przetestowane pod kątem ich działania w innych organizmach. Co ciekawe, spełniały one swoją funkcję również w innych organizmach.Zatem, jeśli w organizmie znajduje się miejsce docelowe dla rekombinazy swoistej miejsca, która została w nim np. wprowadzona metodami inżynierii genetycznej, enzymy te będą mogły spełnić swoją funkcję. Bardzo powszechne jest zastosowanie tych rekombinaz swoistych miejsca, w szczególności tych, które nie wymagają kofaktorów, takich jak rekombinaza flp lub rekombinaza cre, którą wykorzystaliśmy jako punkt wyjścia do prac, o których dzisiaj mówimy. Działają one bez udziału kofaktorów.A jeśli wyexprimi się je na przykład w organizmie zwierzęcia lub w komórkach zwierzęcych, to mogą one odnaleźć rozpoznawane sekwencje w tym organizmie, a następnie w tym miejscu dokonać wycięcia i wklejenia, usuwając określone sekwencje. Enzym ten był zatem z dużym sukcesem wykorzystywany w tak zwanej mutagenezie warunkowej, na przykład u myszy. Załóżmy więc, że mamy gen, o którym wiemy, że jest interesujący i chcemy poznać funkcję tego genu.Bardzo znanym eksperymentem jest tworzenie tzw. myszy z nokautem. W przypadku technologii, o której ostatnio mowa, przyznano w tym roku Nagrodę Nobla za umożliwienie przeprowadzenia delecji genu u myszy. Czasami jednak okazuje się, że po wyeliminowaniu genu u zwierzęcia okazuje się on genem niezbędnym do życia, co prowadzi do śmierci myszy na bardzo wczesnym etapie embriogenezy.Wskazuje to, że dany gen jest bardzo ważny, ale nie mówi nam nic o jego konkretnej funkcji. Obecnie bardzo popularną metodą ustalenia tej funkcji jest wykonanie tzw. warunkowego nokautu. W tym celu flankuje się badany gen miejscami docelowymi dla specyficznych rekombinaz.Oznacza to, że u tych myszy gen będzie ulegał ekspresji tak jak u myszy typu dzikiego. Jeśli jednak skrzyżujemy te mysze z myszą wykazującą ekspresję rekombinazy CRE, na przykład pod promotorem specyficznym dla danej tkanki, można usunąć badany gen wyłącznie w określonych komórkach, które można zdefiniować na podstawie miejsca ekspresji rekombinazy. Z tych eksperymentów wiemy również, że takie rekombinacje mogą być bardzo wydajne w usuwaniu sekwencji z całych organizmów.Było to warunkiem wstępnym dla naszej koncepcji opracowania rekombinazy, która przecinałaby w miejscu zdefiniowanym przez nas, co do tej pory stanowiło jedno z głównych ograniczeń w dalszym rozwoju rekombinaz specyficznych dla miejsca. Należało bowiem wprowadzić miejsce rozpoznawania celu do genomu komórki organizmu, którego chciano użyć. Pomyśleliśmy zatem, czy możemy przełamać tę barierę?W zasadzie wykorzystuje się do tego ewolucję molekularną. O ile mi wiadomo, obecnie rekombinazy swoiste względem miejsca nie są stosowane w terapii. Jak wspomniałem, dzieje się tak głównie dlatego, że u człowieka nie występuje miejsce docelowe, które byłoby rozpoznawane przez jakąkolwiek z naturalnie występujących rekombinaz.Muszą one zatem zostać najpierw zmodyfikowane, aby można było je wykorzystać w celach terapeutycznych. Obecnie znajdujemy się dopiero na samym początku drogi do ustalenia, czy jest to w ogóle możliwe. Czas pokaże, czy rzeczywiście zdołamy opracować te enzymy do zastosowań terapeutycznych i czy będzie to wykonalne.

principles-of-site-specific-recombinase-ssr-technology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zasady technologii rekombinazy specyficznej dla miejsca (SSR)

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Białko nukleoidowe mitochondrialne drożdży, Mgm101, jest białkiem rekombinacyjnym typu Rad52, które tworzy duże pierścienie oligomeryczne. Opisano protokół przygotowania rozpuszczalnego rekombinowanego Mgm101 przy użyciu strategii znakowania białka wiążącego maltozę (MBP) w połączeniu z chromatografią wymiany kationów i wykluczania wielkości.

Przygotowanie białka rekombinacji Mgm101 za pomocą strategii znakowania opartej na MBP

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged.  W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Liniowy kowalencyjnie zamknięty (LCC) miniwektor DNA (zarządzanie DNA) jest niewirusowym wektorem dostarczania genów, oferującym wysoką wydajność transfekcji i jest odpowiedni dla każdej aplikacji dostarczania DNA. System produkcyjny jest prosty, szybki i skalowalny in vivo. Poniższy protokół zawiera wizualne instrukcje krok po kroku dotyczące produkcji ministringów DNA.

Produkcja dwuniciowych ministringów DNA

Tutaj przedstawiamy szybką i efektywną metodę edycji genów opartą na RMCE w locus AAVS1 ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), która ulepsza poprzednio opisane systemy. Korzystając z tej techniki, linie izogeniczne mogą być szybko i niezawodnie generowane dla prawidłowych badań porównawczych, ułatwiając badania za pośrednictwem transgenezy za pomocą hPSCs.

Szybkie i wydajne wytwarzanie rekombinowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy w locus AAVS1

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i...

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Przed przystąpieniem do operacji nowy chirurg powinien przejść szkolenie z zakresu podstawowych technik i koncepcji chirurgicznych. Niniejszy artykuł przedstawi podstawowe zagadnienia chirurgiczne ze szczególnym uwzględnieniem gryzoni.

Zasady chirurgii gryzoni dla początkującego chirurga

Poznaj technologię rekombinazy specyficznej dla miejsca (SSR) i system Cre/lox w inżynierii genomu. Dowiedz się, jak warunkowa mutageneza umożliwia precyzyjną manipulację genami w badaniach nad funkcją genów.

Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

Przeglądaj więcej filmów