Name: Rozmazy metafazowe DNA-FISH w celu odróżnienia dodatkowego DNA chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-04T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę DNA-FISH na rozmazach metafazowych do rozróżniania ekstrachromosomalnego DNA od regionów HSR w liniach komórek nowotworowych człowieka. Protokół umożliwia wizualizację amplifikacji onkogenów z rozdzielczością pojedynczej komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez NIH R00HG011467 i CPRIT RR23004 dla G.S.E. Obrazowanie dla tego projektu było wspierane przez Integrated Microscopy Core w Baylor College of Medicine, z finansowaniem od NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). Autorzy dziękują Dr. Pawłowi Stankiewicz za jego wcześniejsze porady. Autorzy dziękują również Dr. Paulowi Mischelowi (Stanford University) za dostarczenie linii komórek GBM39ec i GBM39hsr.

Wszystkie procedury hodowli komórek ludzkich przeprowadzano zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
1. Zatrzymanie komórek w fazie metafazowej za pomocą Colcemid (N-metylo-N-deacetyl-kolchicyna)
<ol>
	<li>Rozpocznij od około 2,0 × 106–2,0 × 107 komórek nowotworowych lub innych hodowanych komórek. Zbyt mała liczba komórek da mniejszą liczbę rozmazów metafazowych, podczas gdy zbyt dużo komórek może prowadzić do niewystarczającego fiksowania. 
	UWAGA: Krótszy czas inkubacji powoduje mniejszą liczbę komórek zatrzymanych w metafazie w momencie pobrania. Dłuższy czas inkubacji powoduje bardziej zagęszczone chromosomy o krótszych ramionach, co utrudnia analizę. Dla linii komórek nowotworowych o czasie podwojenia rzędu 24 h okresy inkubacji od 45 min do nocnej dają odpowiednie rozmazy metafazowe. Optymalizacja czasu inkubacji dla komórek o wolniejszym czasie podwojenia. Inkubacja przez 2 h jest na ogół wystarczająca, aby uzyskać odpowiednią liczbę rozmazów metafazowych o długości chromosomów nadających się do analizy.</li>
	<li>Oblicz ilość Colcemid potrzebną do osiągnięcia stężenia końcowego 10 µL/mL w odpowiednim pożywku do hodowli komórek. 
	UWAGA: Utrzymuj komórki w wzroście logarytmicznym przez przesadzanie lub wysiewając je co najmniej 24 h przed zatrzymaniem metafazy. Traktuj komórki Colcemidem, gdy kultury osiągną 70%–90% konfluencji.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór Colcemid 1:1 sterylną ultraczystą wodą. Dodaj odpowiednią objętość do kultury i inkubujej przez 45 min do nocy w inkubatorze do hodowli komórek.</li>
</ol>
2. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj świeży fiksator Carnoy'a (3:1 metanol: kwas octowy). Trzymaj fiksator na lodzie przez cały czas trwania fiksacji.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór 0,075 M KCl i rozgrzej go w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbierz komórki jako pelet i zapisz liczbę komórek. Użyj tej wartości do obliczenia końcowej objętości resuspendacji. 
	UWAGA: Oddziel komórki adhezywne przez trypsynizację. Przenieś komórki w zawiesinie bezpośrednio do 15 mL rurek do wirowania. Usuń Colcemid i pożywkę zawierającą Colcemid zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi niebezpiecznych odpadów.</li>
	<li>Przepłucz komórki PBS.</li>
	<li>Lekko resuspenduj komórki w 10 mL ciepłego 0,075 M KCl i mieszaj delikatnie przez inwersję. To hipotoniczne leczenie powoduje spęcznienie komórek, pozwalając im na pękanie i dyfuzję chromosomów podczas przygotowania slajdów.</li>
	<li>Inkubować komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Powoli dodaj 2 mL zimnego fiksatora Carnoy'a, delikatnie mieszając zawiesinę przez inwersję.</li>
	<li>Pozwól komórkom stać przez 5 min.</li>
	<li>Wiruj przez 5 min przy 500 × g w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Ostrożnie aspirat nadstan lub usuń go pipetą.</li>
	<li>Powoli dodaj 10 mL zimnego fiksatora Carnoy'a w 0,5 mL przyrostach, delikatnie mieszając po każdym dodaniu.</li>
	<li>Pozwól komórkom stać przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wiruj przez 5 min przy 650 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.10–2.13 dwa razy</li>
	<li>Podczas ostatniego płukania pozostaw komórki zawieszone w fiksatorze Carnoy'a. 
	PAUZA: Przechowuj fiksowaną suszpenzję komórek w temperaturze -20 °C lub przejdź natychmiast do sekcji 3. 
	UWAGA: Dla próbek zawierających mniej niż około 3 × 106 komórek, wykonaj fiksację w 1,5 mL mikrocentryfugowych rurach zamiast większych stożkowych rurek. Zmniejsz objętości 0,075 M KCl i fiksatora Carnoy'a 10-krotnie, zachowując wszystkie czasy inkubacji, temperatury i warunki wirowania.</li>
</ol>
3. Upuszczanie na blat
<ol>
	<li>Pobierz próbkę z -20 °C i rozmroź ją do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Wiruj przez 7 min przy 800 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Etykietuj szklane slajdy i umieść je na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą liczby komórek uzyskanej przed fiksacją, oblicz objętość fiksatora Carnoy'a potrzebną do resuspendacji pelletu w końcowej koncentracji około 5 × 106 komórek/mL. Po wirowaniu, ostrożnie usuń nadstan pipetą, pozostawiając obliczoną objętość fiksatora powyżej pelletu.</li>
	<li>Resuspenduj fiksowane komórki w fiksatorze Carnoy'a za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Przenieś około 300 µL zawiesiny fiksowany

<ol>
	<li>Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006;22:447-455.</li>
	<li>Bagci O, Kurtg&#246;z S. Amplification of cellular oncogenes in solid tumors. N Am J Med Sci. 2015;7:341-346.</li>
	<li>Schimke RT, et al. Gene amplification and drug resistance in cultured animal cells. Cancer Treat Rev. 1984;11:9-17.</li>
	<li>Baker TM, Waise S, Tarabichi M, Van Loo P. Aneuploidy and complex genomic rearrangements in cancer evolution. Nat Cancer. 2024;5:228-239.</li>
	<li>Ohshima K, et al. Integrated analysis of gene expression and copy number identified potential cancer driver genes with amplification-dependent overexpression in 1,454 solid tumors. Sci Rep. 2017;7:641.</li>
	<li>Pecorino LT, Verhaak RGW, Henssen A, Mischel PS. Extrachromosomal DNA (ecDNA): An origin of tumor heterogeneity, genomic remodeling, and drug resistance. Biochem Soc Trans. 2022;50:1911-1920.</li>
	<li>Cox D, Yuncken C, Spriggs AI. Minute chromatin bodies in malignant tumours of childhood. Lancet. 1965;286:55-58.</li>
	<li>Kohl NE, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell. 1983;35:359-367.</li>
	<li>Giollant M, et al. Characterization of double minute chromosomes&#39; DNA content in a human high-grade astrocytoma cell line using comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 1996;98:265-270.</li>
	<li>Stephens PJ, et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell. 2011;144:27-40.</li>
	<li>Zhang CZ, et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 2015;522:179-184.</li>
	<li>Lange JT, et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 2022;54:1527-1533.</li>
	<li>Turner KM, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 2017;543:122-125.</li>
	<li>Wu S, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575:699-703.</li>
	<li>Deshpande V, et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 2019;10:392.</li>
	<li>Levan A, Levan G. Have double minutes functioning centromeres? Hereditas. 1978;88:81-92.</li>
	<li>St&#246;ber MC, et al. Intercellular extrachromosomal DNA copy-number heterogeneity drives neuroblastoma cell state diversity. Cell Rep. 2024;43:114711.</li>
	<li>Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Amplified dihydrofolate reductase genes in unstably methotrexate-resistant cells are associated with double minute chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:5669-5673.</li>
	<li>Kim H, et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 2020;52:891-897.</li>
	<li>Schlesinger HR, et al. Establishment and characterization of human neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 1976;36:3094-3100.</li>
	<li>Balaban-Malenbaum G, Gilbert F. Double minute chromosomes and the homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line. Science. 1977;198:739-741.</li>
	<li>Gilbert F, et al. Homogeneously staining region in a retinoblastoma cell line: Relevance to tumor initiation and progression. J Natl Cancer Inst. 1981;67:301-306.</li>
	<li>Quinn LA, Moore GE, Morgan RT, Woods LK. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979;39:4914-4924.</li>
	<li>Montgomery KT, Biedler JL, Spengler BA, Melera PW. Specific DNA sequence amplification in human neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:5724-5728.</li>
	<li>Singer MJ, et al. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:7921-7926.</li>
	<li>Shimizu N. Gene amplification and the extrachromosomal circular DNA. Genes (Basel). 2021;12:1533.</li>
	<li>Carroll SM, et al. Double minute chromosomes can be produced from precursors derived from a chromosomal deletion. Mol Cell Biol. 1988;8:1525-1533.</li>
	<li>Alitalo K, et al. Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene (c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:1707-1711.</li>
	<li>George DL, Powers VE. Amplified DNA sequences in Y1 mouse adrenal tumor cells: Association with double minutes and localization to a homogeneously staining chromosomal region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1597-1601.</li>
	<li>Storlazzi CT, et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome Res. 2010;20:1198-1206.</li>
	<li>Biedler JL, Meyers MB, Spengler BA. Homogeneously staining regions and double minute chromosomes, prevalent cytogenetic abnormalities of human neuroblastoma cells. In: Fedoroff S, Hertz L, editors. Advances in Cellular Neurobiology. Academic Press; New York, NY; 1983. p. 267-307.</li>
	<li>Shoshani O, et al. Chromothripsis drives the evolution of gene amplification in cancer. Nature. 2021;591:137-141.</li>
	<li>Nathanson DA, et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 2014;343:72-76.</li>
	<li>Song K, et al. Plasticity of extrachromosomal and intrachromosomal BRAF amplifications in overcoming targeted therapy dosage challenges. Cancer Discov. 2022;12:1046-1069.</li>
	<li>Kang X, et al. Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with the DNA damage pathway in tumors. Cell. 2025;188:3405-3421.e27.</li>
	<li>Pommier Y, Nussenzweig A, Takeda S, Austin C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23:407-427.</li>
	<li>Coquelle A, et al. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. Cell. 1997;89:215-225.</li>
	<li>Coquelle A, et al. A new role for hypoxia in tumor progression: Induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex double minutes and homogeneously staining regions. Mol Cell. 1998;2:259-265.</li>
	<li>Mandahl N, Mertens F, Mitelman F. Gene amplification in neoplasia: A cytogenetic survey of 80,131 cases. Genes Chromosomes Cancer. 2024;63:e23214.</li>
	<li>Roepman P, et al. Clinical validation of whole genome sequencing for cancer diagnostics. J Mol Diagn. 2021;23:816-833.</li>
	<li>Ho SS, Urban AE, Mills RE. Structural variation in the sequencing era. Nat Rev Genet. 2020;21:171-189.</li>
	<li>Rajkumar U, et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 2019;21:428-435.</li>
	<li>Purshouse K, Pollard SM, Bickmore WA. Imaging extrachromosomal DNA (ecDNA) in cancer. Histochem Cell Biol. 2024;162:53-64.</li>
	<li>Shapiro DN, et al. Detection of N-myc gene amplification by fluorescence in situ hybridization: Diagnostic utility for neuroblastoma. Am J Pathol. 1993;142:1339-1346.</li>
	<li>Krupina K, et al. Chromothripsis and ecDNA initiated by N4BP2 nuclease fragmentation of cytoplasm-exposed chromosomes. Science. 2025;390:1156-1163.</li>
	<li>Trask BJ, Hamlin JL. Early dihydrofolate reductase gene amplification events in CHO cells usually occur on the same chromosome arm as the original locus. Genes Dev. 1989;3:1913-1925.</li>
	<li>Biedler JL, Spengler BA. A novel chromosome abnormality in human neuroblastoma and antifolate-resistant Chinese hamster cell lines in culture. J Natl Cancer Inst. 1976;57:683-695.</li>
	<li>Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75:5553-5556.</li>
	<li>Gapski GR, et al. Synthesis of a fluorescent derivative of amethopterin. J Med Chem. 1975;18:526-528.</li>
	<li>Verma RS, Babu A. Tissue culture techniques and chromosome preparation. In: Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. Pergamon Press; 1989. p. 4-45.</li>
	<li>Moorhead PS, et al. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res. 1960;20:613-616.</li>
	<li>Ohara H, Terasima T. Colcemid effects on mitotic synchrony and synchronized cells. Cell Struct Funct. 1976;1:187-195.</li>
	<li>Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Loss and stabilization of amplified dihydrofolate reductase genes in mouse sarcoma S-180 cell lines. Mol Cell Biol. 1981;1:1084-1093.</li>
	<li>Marsden CG, Dragon JA, Wallace SS, Sweasy JB. Base excision repair variants in cancer. Methods Enzymol. 2017;591:119-157.</li>
	<li>Nichols A, et al. Chromosomal tethering and mitotic transcription promote ecDNA nuclear inheritance. Mol Cell. 2025;85:2839-2853.e8.</li>
	<li>Henegariu O, et al. Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled chromosome spreading, chemical aging, and gradual denaturing. Cytometry. 2001;43:101-109.</li>
	<li>Lichter P, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet. 1988;80:224-234.</li>
	<li>Pinkel D, et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:9138-9142.</li>
	<li>Sumner AT, Evans HJ, Buckland RA. New technique for distinguishing between human chromosomes. Nature New Biol. 1971;232:31-32.</li>
	<li>Howe B, Umrigar A, Tsien F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. 2014;e50203.</li>
	<li>Cavalli G, Misteli T. Functional implications of genome topology. Nat Struct Mol Biol. 2013;20:290-299.</li>
	<li>Kosak ST, Groudine M. Form follows function: The genomic organization of cellular differentiation. Genes Dev. 2004;18:1371-1384.</li>
	<li>Sehgal P, Chaturvedi P. Chromatin and cancer: Implications of disrupted chromatin organization in tumorigenesis and its diversification. Cancers (Basel). 2023;15:466.</li>
	<li>Misteli T. Beyond the sequence: Cellular organization of genome function. Cell. 2007;128:787-800.</li>
	<li>Zhu Y, et al. Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription. Cancer Cell. 2021;39:694-707.</li>
	<li>Hung KL, et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 2021;600:731-736.</li>
	<li>Taghbalout A, et al. Extrachromosomal DNA associates with nuclear condensates and reorganizes chromatin structures to enhance oncogenic transcription. Cancer Cell. 2025;43:2191-2205.e6.</li>
	<li>Hsu TC, Pomerat CM. Mammalian chromosomes in vitro: II. A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. J Hered. 1953;44:23-30.</li>
	<li>Erwin GS, Bhimsaria D, Eguchi A, Ansari AZ. Mapping polyamide-DNA interactions in human cells reveals a new design strategy for effective targeting of genomic sites. Angew Chem. 2014;126:10288-10292.</li>
	<li>Erwin GS, et al. Synthetic genome readers target clustered binding sites across diverse chromatin states. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E7418-7427.</li>
	<li>Erwin GS, et al. Synthetic transcription elongation factors license transcription across repressive chromatin. Science. 2017;358:1617-1622.</li>
	<li>Erwin GS, et al. Recurrent repeat expansions in human cancer genomes. Nature. 2023;613:96-102.</li>
	<li>Shimizu N, Kanda T, Wahl GM. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 1996;12:65-71.</li>
	<li>Jaworski JJ, et al. ecDNA replication is disorganized and vulnerable to replication stress. Nucleic Acids Res. 2025;53:gkaf711.</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Mimo swoich dobrze uznanych zalet, metody DNA-FISH na rozmazach metafazowych są mało wykorzystywane w erze sekwencji całych genomów. Fizyczna organizacja amplifikowanego DNA jest funkcjonalnie znacząca, ponieważ może wpływać na dalsze zachowanie biologiczne i odpowiedź terapeutyczną61,62,63,64. Skupione na amplifikacji onkogeny mogą istnieć na ecDNA lub w obrębie HSR, a te dwa stany amplifikacj...

Genom ludzki jest zorganizowany nie tylko przez swoją sekwencję, ale także przez swoją strukturę, a zmiany w sekwencji lub strukturze mogą prowadzić do raka1,2,3,4. Amplifikacja onkogenów występuje w około 40% wszystkich guzów, gdzie przyczynia się do inicjacji, wzrostu, przerzutów i oporności na leki5. W niektórych przypadkach, amplifikowane onkogeny są przenoszone na pozachromosomalne DNA (ecDNA, zwane również podwójnymi minutami), które są kolistymi, samoreplikują się, podwójnie spiralnymi elementami DNA, znajdującymi się poza liniowymi chromosomami6,7,8,9. ecDNAs mają wielkość od setek kilobaz do megabaz10,11. Ze względu na brak centromerów, segregują asymetrycznie podczas mitozy, prowadząc do nawet 100+ kopii w pojedynczej komórce12,13,14,15,16,17,18. Ta nierównomierna segregacja generuje zmienność liczby kopii w komórkach potomnych, co prowadzi do szybkiego rozwoju guza i złego wyniku dla pacjenta17,19.
ecDNAs występują w dynamicznej relacji z regionami jednorodnego barwienia (HSRs) (Rysunek 1A)8,18. HSRs to ogniskowe, intrachromosomalne amplifikację, które mogą powstać przez reintegrację ecDNAs do pojedynczego locus w genomie8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Te dwa stany, ecDNAs i HSRs, mogą się przekształcać, ujawniając, że amplifikowanie onkogenów jest strukturalnie elastyczne24,25,32,33. Ta przemiana ma znaczenie terapeutyczne, ponieważ ecDNAs mogą przejść do stanu HSR w obecności leków32,33,34,35,36,37,38. Komórki, które przechodzą tę transformację do stanu HSR, stają się odporne na lek pod wpływem terapii33. HSRs również wydają się być częstsze w guzach złośliwych niż w guzach łagodnych39. Pomimo ich klinicznego znaczenia, nie ma zatwierdzonych przez FDA strategii, które celują w stan HSR, częściowo dlatego, że metody rozróżniania tych struktur amplifikacji pozostają niedostatecznie wykorzystywane.
Chociaż stany ecDNA i HSR mają odmienne konsekwencje kliniczne, obecne podejścia sekwencjonowania nie mogą ich wiarygodnie rozróżnić. Sekwencjonowanie całogenomowe (WGS) teraz identyfikuje skoncentrowane regiony z rozdzielczością par zasad40. WGS było wartościowe w definiowaniu składu sekwencji ecDNAs i HSRs, ale kosztem rozdzielczości przestrzennej. W przeciwieństwie do tradycyjnych podejść cytogenetycznych, WGS samo w sobie nie może określić, czy skoncentrowana sekwencja znajduje się na ecDNAs czy jest zintegrowana z chromosomem jako HSR41,42,43. W rezultacie metody, które zachowują kontekst przestrzenny amplifikacji, pozostają istotne dla zrozumienia biologii tych odrębnych stanów.
Ostatnie 40 lat, hybrydyzacja in situ z fluorescencyjnym DNA (DNA-FISH) na metafazanach służyła jako złoty standard do identyfikacji i rozróżniania stanów amplifikacji ecDNA i HSR42,44,45,46. W rzeczywistości, ecDNAs i HSRs zostały po raz pierwszy zidentyfikowane i scharakteryzowane poprzez analizy cytogenetyczne oparte na metafazanach7,47. Przed szerokim zastosowaniem sond fluorescencyjnych, hybrydyzacja in situ była przeprowadzana za pomocą radioaktywnie oznaczonych sond DNA, które były również używane do wizualizowania ecDNAs i HSRs48,49. W miarę popularyz

<table><tbody><tr><td>15-mL conical centrifuge</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Centrifugowanie.&nbsp;</td></tr><tr><td>15-mL stożkowe probówki</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Zbieranie komórek.</td></tr><tr><td>200-dowodowy etanol</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Etapy płukania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas octowy, glacjjalny, 99,7%</td><td>Millipore Sigma</td><td>695092</td><td>Fiksator Carnoy i etapy płukania szkiełka.</td></tr><tr><td>Środek do montowania antyfade</td><td>FisherScientific</td><td>NC9265087</td><td>Montowanie szkiełka po zakończonej przygotowce</td></tr><tr><td>Kabina bezpieczeństwa biologicznego z wylotem próżniowym</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Przechowywanie chemikaliów.</td></tr><tr><td>Kolcemid (N-metylo-N-deacetyl-kolchicyna)</td><td>Millipore Sigma</td><td>10295892001</td><td>Wiąże tubulinę, zatrzymują komórki w metafazie.</td></tr><tr><td>Słoiczki Coplina</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Etapy płukania.&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamino-2-fenyloindol)</td><td>Milipore Sigma</td><td>D8417-1MG</td><td>Fluorescencyjne barwienie DNA.</td></tr><tr><td>Sonda EGFR/CON7 FISH&nbsp;</td><td>Empire Genomics</td><td>EGFR-CHR07</td><td>Fluorescencyjna sonda specyficzna dla lokusu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Klej kauczukowy Elmera</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Utrzymanie pokrywki w miejscu podczas nocnej hybrydyzacji sondy.</td></tr><tr><td>Trwały marker odporny na etanol</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Oznaczanie szkiełka.</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Wykonywanie obrazów szkiełka.&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana pokrywka 22 x 22mm</td><td>ThermoFisher</td><td>50-143-780</td><td>Hybrydyzacja sondy na szkiełku.</td></tr><tr><td>Szklane szkiełko, wstępnie wyczyszczone</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Do opuszczania układów metafazowych i wykonywania DNA-FISH.</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z nawilżaniem</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Inkubacja żywych komórek.</td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td>Empire Genomics</td><td>Hyb-Buffer</td><td>Bufor używany z sondą.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kubełkowy koszyk na lód</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Utrzymanie zimnego fiksatyw Carnoy.&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl (2M)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9640G</td><td>Napełnianie komórek przed fiksacją.&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol, 99,9%, HPLC</td><td>Millipore Sigma</td><td>1060351000</td><td>Do fiksatyw Carnoy.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Centrifugowanie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Do komórek podczas fiksacji i do przygotowania sond.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda MYC / SE 8</td><td>Leica</td><td>KI-10106</td><td>Fluorescencyjna sonda specyficzna dla lokusu.&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Etapy płukania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastu fazowego</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Wykonywanie obrazów układów metafazowych tuż po opuszczeniu</td></tr><tr><td>Nasadki do pipet</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Pipetowanie.</td></tr><tr><td>Chlorku sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>Do bufora SSC.</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>567446</td><td>Do bufora SSC.</td></tr><tr><td>Sterylizacja wody ultraczystej</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Etapy płukania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Programowalny inkubator szkiełkowy ThermoBrite</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Inkubacja szkiełka.</td></tr><tr><td>Ściągacze</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Do etapów płukania szkiełka.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>dowolne źródło</td><td>BRAK</td><td>Do inkubacji KCl.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rozmazy metafazowe dna-fish w celu odróżnienia dodatkowego dna chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych

DNA-FISH Metaphase Spreads to Distinguish Extrachromosomal DNA from Homogeneously Staining Regions in Human Cancer Cell Lines

Sekwencjowanie całego genomu identyfikuje ogniskowe amplifikacje DNA z rozdzielczością par zasad, ale nie może określić, czy amplikowane sekwencje znajdują się na pozachromosomalnym DNA (ecDNA, znanym również jako podwójne minuty) lub w chromosomowo zintegrowanych jednorodnie barwiących regionach (HSR). Metafazowe rozmazania hybrydyzacji fluorescencyjnej DNA (DNA-FISH) pozostają standardem złotym do rozróżniania tych stanów amplifikacji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Przedstawiamy szczegółowy protokół dla metafazowych rozmazań DNA-FISH przy użyciu linii komórek rakowych człowieka, obejmujący hodowlę komórek, zatrzymanie w metafazie, leczenie hipotoniczne, fiksację, rozprzestrzenianie chromosomów, hybrydyzację sond fluorescencyjnych i obrazowanie fluorescencyjne. Protokół obejmuje pośrednie kroki kontroli jakości w celu zweryfikowania pomyślnego rozproszenia chromosomów i optymalizacji jakości rozmazań metafazowych, dzięki czemu przepływ pracy jest dostępny dla laboratoriów bez specjalistycznej wiedzy z zakresu cytogenetyki. Wyniki pokazują jasne wizualizowanie stanów amplifikacji ecDNA i HSR przy użyciu sond specyficznych dla lokusu i ilustrują typowe artefakty techniczne, które mogą wpływać na interpretację. Ten protokół zapewnia solidne i powtarzalne podejście do badania organizacji strukturalnej amplifikacji onkogenów w komórkach rakowych.

Niniejszy protokół (Rycina 1B) pozwala na uzyskanie czystych, dobrze rozproszonych i nienaruszonych chromosomów w metafazie, odpowiednich do analizy cytogenetycznej, z wyraźnie widocznymi pod mikroskopem fluorescencyjnym chromosomami i sygnałami DNA-FISH. Użycie mikroskopu w polu jasnym lub kontrastowego przy niskim powiększeniu (10× lub 20×) jest istotnym etapem kontroli jakości, pozwalającym zweryfikować, czy jądra komórkowe pękły, a chromosomy uległy rozproszeniu (Ryc...

Raportujemy protokół DNA-FISH metafazowej dystrybucji, który wizualnie wykrywa liczbę kopii lokusu i jego lokalizację w genomie. To podejście umożliwia rozdzielczość pojedynczych komórek stanów amplifikacji, szczególnie w liniach komórek nowotworowych zawierających DNA pozachromosomowe i jednorodnie barwiące regiony.

Rozmazy metafazowe DNA-FISH w celu odróżnienia dodatkowego DNA chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych

Whole-genome sequencing identifies focal DNA amplifications with base-pair resolution but cannot determine whether amplified sequences reside on ...

Nasze badania koncentrują się na ustaleniu, czy amplifikowane onkogeny znajdują się na pozachochromosomalnym DNA, czy w obrębie odrębnych, chromosomalnie zintegrowanych regionów homogenicznie barwiących się (HSR). Sekwencjonowanie nie pozwala na odróżnienie amplifikacji ecDNA od HSR, dlatego nasz protokół rozwiązuje ten problem z rozdzielczością na poziomie pojedynczej komórki.W celu rozpoczęcia, rozcieńcz roztwór zapasu Colcemidu w stosunku 1:1 sterylną wodą ultrapure. Aby zatrzymać komórki w fazie metafazy, dodaj 100 µL rozcieńczonego roztworu Colcemidu do komórek COLO320DM hodowanych w 10 mL pożywki w fazie wzrostu logarytmicznego przy konfluencji od 70% do 90%, a następnie umieść je w inkubatorze do hodowli komórkowych na okres od 45 minut do całej nocy. Przygotuj świeży utrwalacz Carnoy’a w stosunku 3:1 metanolu do kwasu octowego. Przez cały proces utrwalania przechowuj utrwalacz Carnoy’a w lodzie. Przygotuj świeży 0,075 M roztwór chlorku potasu i ogrzej go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po wirowaniu i zliczeniu komórek, przemyj je PBS. Ostrożnie resuspenduj komórki w 10 mL ciepłego 0,075 M roztworu chlorku potasu i wymieszaj zawiesinę poprzez delikatne odwracanie probów

dna-fish-metaphase-spreads-to-distinguish-extrachromosomal-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Izolacja i charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi pacjentów z rakiem jest rodzajem nieinwazyjnej płynnej biopsji i wiąże się z nawrotem choroby i progresją choroby. Ten film opisuje technikę fluorescencji-hybrydyzacji DNA in situ (DNA FISH) na CTC uchwyconych na przewodzie medycznym w celu zbadania konkretnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

3D DNA RYBY: technika lokalizacji określonego genu na chromosomie

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Prezentujemy nowe podejście do charakterystyki komórek nowotworowych. Połączyliśmy immunofluorescencję z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ, aby ocenić komórki wychwycone przez funkcjonalizowany przewód medyczny zdolny do wzbogacania in vivo CTC bezpośrednio z krwi pacjenta.

Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Połączenie preparatów halo DNA z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ umożliwia analizę interakcji genomowych z nukleoszkieletem w wysokiej rozdzielczości. Przyłączony genom prowadzi do zhybrydyzowanych sygnałów fluorescencyjnych zlokalizowanych w resztkowych wyekstrahowanych jądrach, podczas gdy nieprzyłączony genom znajduje się w halo DNA otaczającym resztkowe jądra.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie.

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Poznaj metodę DNA-FISH na rozmazach metafazowych do rozróżniania ekstrachromosomalnego DNA od regionów HSR w liniach komórek nowotworowych człowieka. Protokół umożliwia wizualizację amplifikacji onkogenów z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Rozmazy metafazowe DNA-FISH w celu odróżnienia dodatkowego DNA chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Rozmazy metafazowe DNA-FISH w celu odróżnienia dodatkowego DNA chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów