ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują ITQB NOVA (Uniwersytet NOVA w Lizbonie, Oeiras, Portugalia) oraz GREEN-IT Research Unit za dostęp do obiektów szklarniowych i infrastruktury wspierającej. Autorzy dziękują również firmie Semillas Fitó za uprzejme dostarczenie nasion pomidorów użytych w tym badaniu, z szczególnymi podziękowaniami dla dr. Narváez (technolog nasion, Semillas Fitó). Praca ta była wspierana przez FCT - Fundację dla Nauki i Technologii, I.P., poprzez jednostkę badawczo-rozwojową Green-it Bioresources for Sustainability (UID/04551/2025, DOI: 10.54499/UID/04551/2025; UID/PRR/04551/2025, DOI: 10.54499/UID/PRR/04551/2025) oraz związane laboratorium LS4FUTURE (LA/P/0087/2020, DOI: 10.54499/LA/P/0087/2020).

<ol>
	<li>Barret M, et al. Emergence shapes the structure of the seed microbiota. Appl Environ Microbiol. 2015;81(4):1257-66.</li>
	<li>Nelson EB. The seed microbiome: Origins, interactions, and impacts. Plant Soil. 2018;422(1):7-34.</li>
	<li>Shade A, Jacques MA, Barret M. Ecological patterns of seed microbiome diversity, transmission, and assembly. Curr Opin Microbiol. 2017;37:15-22.</li>
	<li>Truyens S, Weyens N, Cuypers A, Vangronsveld J. Bacterial seed endophytes: Genera, vertical transmission and interaction with plants. Environ Microbiol Rep. 2015;7(1):40-50.</li>
	<li>Torres-Cort&#233;s G, et al. Differences in resource use lead to coexistence of seed-transmitted microbial populations. Sci Rep. 2019;9(1):6648.</li>
	<li>Vilchez JI, Yang Y, Yi D, Zhang H. Measurements of root colonized bacteria species. Bio-protocol. 2021;11(7):e3976.</li>
	<li>Wassermann B, Cernava T, M&#252;ller H, Berg C, Berg G. Seeds of native alpine plants host unique microbial communities embedded in cross-kingdom networks. Microbiome. 2019;7(1):108.</li>
	<li>Ding JYM, Ho LS, Ibrahim J, Teh CK, Goh KM. Impact of sterilization and chemical fertilizer on the microbiota of oil palm seedlings. Front Microbiol. 2023;14:1091755.</li>
	<li>Lagier JC, et al. The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota. Clin Microbiol Rev. 2015;28(1):237-64.</li>
	<li>Links MG, et al. Simultaneous profiling of seed-associated bacteria and fungi reveals antagonistic interactions between microorganisms within a shared epiphytic microbiome on Triticum and Brassica seeds. New Phytol. 2014;202(2):542-53.</li>
	<li>Compant S, et al. The plant endosphere world&#8212;bacterial life within plants. Environ Microbiol. 2021;23(4):1812-29.</li>
	<li>Wegner CE, Liesack W. Microbial community dynamics during the early stages of plant polymer breakdown in paddy soil. Environ Microbiol. 2016;18(9):2825-42.</li>
	<li>Xu XY, et al. Seed-microbiome interactions: Mechanistic insights and utilization toward seed performance for sustainable agriculture. Plant Commun. 2026;7(3):101716.</li>
	<li>Rom&#227;o I, do Carmo-Gomes J, Silva D, Vilchez JI. The seed microbiota from an application perspective: An underexplored frontier in plant-microbe interactions. Crop Health. 2025;3(1):12.</li>
	<li>Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev. 1995;59(1):143-69.</li>
	<li>Yu Y, Chen Z, Xie H, Feng X, Wang Y, Xu P. Overhauling the effect of surface sterilization on analysis of endophytes in tea plants. Front Plant Sci. 2022;13:849658.</li>
	<li>Berg G, Raaijmakers JM. Saving seed microbiomes. ISME J. 2018;12(5):1167-70.</li>
	<li>Bewley JD. Seed germination and dormancy. Plant Cell. 1997;9(7):1055-66.</li>
	<li>Niza-Costa M, et al. Geographically disperse, culturable seed-associated microbiota in forage plants of alfalfa (Medicago sativa L.) and pitch clover (Bituminaria bituminosa L.): Characterization of beneficial inherited strains as plant stress-tolerance enhancers. Biology. 2022;11(12):1838.</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów związanych z tą pracą. W niniejszej publikacji wykorzystano ilustracje koncepcyjne przygotowane przy użyciu sztucznej inteligencji.

Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że integracja standaryzowanej sterylizacji powierzchni z kontrolowanym kiełkowaniem nasion zapewnia solidne ramy dla kulturomicznej izolacji mikrobioty związanej z nasionami. Kluczowym wynikiem tego protokołu jest zdolność do zbilansowania skutecznego usuwania zewnętrznych zanieczyszczeń z zachowaniem endogennych populacji mikroorganizmów. Bilans ten jest krytyczny w badaniach opartych na hodowlaniach, gdzie zbyt rygorystyczna sterylizacja może zmniejszyć odzyskiwanie mikroorganizmów,...

Nasiona kryją różnorodne społeczności drobnoustrojów składające się z bakterii i grzybów związanych zarówno z tkankami wewnętrznymi, jak i powierzchniami zewnętrznymi1,2,3. Mikroorganizmy te są coraz częściej uznawane za integralne składniki biologii roślin, ponieważ mogą one wpływać na rozwój rośliny od najwcześniejszych etapów, w tym na kiełkowanie, rozwój siewek oraz reakcje na stresy biotyczne i abiotyczne1,2,3. Z perspektywy ekologicznej nasiona pełnią funkcję nie tylko propagul rozprzestrzeniających rośliny, ale także rezerwuarów inokulum drobnoustrojowego, co czyni je kluczowym punktem wyjścia do zrozumienia, w jaki sposób mikrobiomy związane z roślinami są inicjowane i utrzymywane w całym cyklu życiowym rośliny1,2,3.
Mikroorganizmy związane z nasionami mogą stanowić pierwsze inokulum mikrobiologiczne, z którym styka się wyrastająca roślina, a tym samym mogą przyczyniać się do formowania mikrobiomu podczas przejścia z fazy nasiona do siewki1,3,4. To wczesne inokulum może wpływać na społeczności mikrobiologiczne, które następnie kolonizują korzenie i inne części rośliny, co ma konsekwencje dla zakorzenienia się rośliny i późniejszych interakcji między rośliną a mikroorganizmami1,4. Ponadto część mikrobioty nasion może być przekazywana pionowo poprzez struktury rozrodcze, takie jak kwiaty, zalążki i pyłek, co pozwala populacjom mikrobiologicznym przetrwać przez kolejne pokolenia roślin4,5. Ta ciągłość międzypokoleniowa sugeruje, że niektóre mikroorganizmy przenoszone przez nasiona mogą w stały sposób przyczyniać się do kondycji i adaptacji rośliny.
Pod względem funkcjonalnym mikroorganizmy związane z nasionami mogą wpływać na kondycję gospodarza poprzez kilka mechanizmów, w tym produkcję fitohormonów, związków przeciwdrobnoustrojowych i innych aktywnych biologicznie metabolitów, które modulują rozwój roślin lub hamują rozwój konkurentów i patogenów5,6,7. Populacje drobnoustrojów przenoszone przez nasiona zdają się również współistnieć dzięki różnicowaniu wykorzystania zasobów i partycjonowaniu ekologicznemu, co sugeruje, że nasiono stanowi środowisko selektywne, a nie pasywny zbiornik różnorodności mikrobiologicznej7. Wspólnie wyniki te wspierają tezę, że nasiona goszczą populacje drobnoustrojów, które mogą wpływać na wczesny rozwój roślin i stanowią kandydatów do dalszej charakterystyki funkcjonalnej2,3,5,7.
Aby zbadać mikroorganizmy związane z nasionami w sposób funkcjonalnie informatywny i eksperymentalnie wykonalny, konieczne jest odzyskanie żywych populacji drobnoustrojów z materiału nasiennego. W tym kontekście izolacja mikrobiologiczna umożliwia dostęp do żywych mikroorganizmów, które mogą być następnie scharakteryzowane eksperymentalnie i ocenione w dalszych analizach istotnych dla interakcji roślina–mikrob. Jest to szczególnie ważne w systemach nasiennych, gdzie mikroorganizmy związane z nasionami mogą przyczyniać się do wczesnego zakorzenienia się rośliny i stanowić kandydatów do przesiewania funkcjonalnego oraz przyszłego zastosowania praktycznego.
Odzyskiwanie mikroorganizmów związanych z nasionami jest niezwykle wrażliwe na procedury przygotowania próbek, w szczególności na sterylizację powierzchniową, przetwarzanie tkanek oraz stadium rozwojowe pobranego materiału. Wrażliwość ta jest szczególnie istotna w systemach nasiennych, ponieważ biomasa mikrobiologiczna jest często niska, a niewielkie różnice proceduralne mogą silnie wpływać zarówno na liczbę jednostek tworzących kolonie, jak i na skład izolatów. Wśród tych zmiennych sterylizacja powierzchniowa jest jednym z najbardziej krytycznych i najtrudniejszych do zoptymalizowania etapów. Sterylizacja jest niezbędna w celu ograniczenia zanieczyszczeń epifitycznych przed izolacją mikrobiologiczną, jednak nadmierna ekspozycja na środki sterylizujące może obniżyć żywotność lub zdolność do hodowli mikroorganizmów endogennych, podczas gdy niewystarczająca sterylizacja może doprowadzić do dominacji taksonów związanych z powierzchnią w późniejszych kulturach8,9,10. W związku z tym celem sterylizacji nie jest maksymalizacja ekspozycji chemicznej, lecz zastosowanie najłagodniejszej obróbki, która skutecznie hamuje zanieczyszczenia pochodzące z powierzchni, zachowując jednocześnie możliwość odzyskania mikroorganizmów wewnętrznych5,11.
Ponieważ efektywność sterylizacji zależy od gatunku rośliny, struktury tkanki, właściwości łupiny nasion oraz towarzyszącej im społeczności mikrobowej, protokoły powinny być dobierane spośród wcześniej zwalidowanych metodologii, a następnie ostrożnie adaptowane do badanego układu8,12,13. W materiałach o niskiej biomasie, takich jak nasiona pomidora, równowaga ta jest szczególnie istotna: nadmierna sterylizacja może gwałtownie zmniejszyć odzysk mikroorganizmów, natomiast niewystarczająca sterylizacja zwiększa prawdopodobieństwo, że szybko rosnące zanieczyszczenia powierzchniowe zdominują uzyskane izolaty. Z tego powodu efektywność sterylizacji powinna być rutynowo weryfikowana, a nie przyjmowana za pewnik. Wysiew końcowej wody płuczącej stanowi praktyczną kontrolę pozostałego zanieczyszczenia zewnętrznego, jednak kontrolę tę należy zawsze interpretować łącznie z odzyskiem mikroorganizmów z homogenatów nasion lub siewek. Protokół, który daje sterylne kontrole płukania, ale niewielki lub żaden odzysk wewnętrznej mikrobioty, może być nieodpowiedni, gdy celem jest porównawcza izolacja drobnoustrojów, a nie maksymalna dekontaminacja6,8,10,14.
W związku z tym, aby porównania były miarodajne, wymagana jest ścisła standaryzacja procedur. W próbkach o niskiej biomasie niespójności w płukaniu, przenoszeniu, homogenizacji, rozcieńczaniu, wysiewaniu lub inkubacji mogą zmienić zarówno całkowitą odzyskaną liczbę drobnoustrojów, jak i pozorną reprezentację poszczególnych taksonów. Jest to szczególnie istotne przy porównywaniu materiału suchego i wykiełkowanego, gdzie różnice metodologiczne mogą zostać łatwo pomylone ze zmianami biologicznymi.
Głównym ograniczeniem wielu protokołów mikrobiologicznych dotyczących nasion jest to, że opierają się one wyłącznie na suchych, niekiełkujących nasionach jako materiale wyjściowym. Chociaż pozwala to na uzyskanie przydatnej wartości bazowej dla frakcji mikrobiologicznej obecnej przed aktywacją nasion, może to prowadzić do niedoszacowania mikroorganizmów, które są w stanie uśpienia, metabolicznie nieaktywne, poddane stresowi lub początkowo występują przy niskiej liczności względnej2,15.
W stanie suchym nasiona stanowią fizjologicznie uśpione środowisko, w którym zarówno tkanki gospodarza, jak i towarzyszące im mikroorganizmy mogą pozostawać stosunkowo nieaktywne. W konsekwencji populacje drobnoustrojów wyizolowane bezpośrednio z suchych nasion mogą nie w pełni reprezentować te, które stają się łatwiej możliwe do odzyskania po rozpoczęciu kiełkowania.
Podczas kiełkowania nasion zachodzi pobór wody, reaktywacja metaboliczna, mobilizacja składników odżywczych oraz reorganizacja tkanek, co zmienia lokalne środowisko dostępne dla powiązanych z nimi mikroorganizmów11,16. Zmiany te mogą stymulować wzrost drobnoustrojów, zmieniać relatywną reprezentację populacji mikrobiologicznych oraz ułatwiać wykrywanie lub izolację taksonów, które wcześniej występowały rzadko lub były słabo odzyskiwane z suchych nasion. Dodatkowo wyłonienie się korzenia zakotwiczenia tworzy nowy przedział roślinny, który może sprzyjać proliferacji i redystrybucji drobnoustrojów, co sprawia, że przejście od nasiona do siewki jest szczególnie informacyjnym etapem dla analiz mikrobiologicznych1,17.
Z tego powodu równoległe przetwarzanie suchych nasion i wykiełkowanych siewek zapewnia bardziej informacyjny projekt doświadczalny niż analiza samych suchych nasion. Suche nasiona ustanawiają punkt odniesienia dla populacji zdolnych do hodowli obecnych przed aktywacją, podczas gdy materiał wykiełkowany pozwala na porównawczą ocenę taksonów, które stają się łatwiej odzyskiwalne podczas wczesnego rozwoju. Takie podejście jest szczególnie użyteczne, gdy celem jest nie tylko skatalogowanie odzyskiwalnych mikroorganizmów, ale także zidentyfikowanie taksonów związanych z przejściem z nasiona do siewki oraz priorytetyzacja izolatów do dalszej charakterystyki (Rycina 1).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72014/72014fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Koncepcyjny i proceduralny przegląd porównawczego schematu izolacji. (A) Koncepcyjna reprezentacja stanu suchego nasiona pomidora przed kiełkowaniem. (B) Koncepcyjna reprezentacja stanu wykiełkowanego nasiona pomidora podczas przejścia z nasiona w siewkę. (C) Schematyczny przebieg protokołu, obejmujący sterylizację powierzchni nasion, ocenę kontrolną płukania, bezpośrednią obróbkę suchych nasion lub kontrolowane kiełkowanie, homogenizację połączonych powtórzeń biologicznych, rozcieńczenia seryjne i wysiewanie, ilościowe oznaczenie na podstawie CFU, odzyskiwanie izolatów, identyfikację taksonomiczną oraz analizę porównawczą materiału suchego i wykiełkowanego. Krytyczne punkty kontrolne wyróżnione w schemacie obejmują wydajność sterylizacji, równoważne powtórzenia biologiczne oraz spójność wysiewania i analizy CFU. Panele A i B zostały przygotowane jako koncepcyjne ilustracje wspomagane przez AI wyłącznie w celu wizualnej reprezentacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72014/72014fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ponieważ protokół ma na celu porównanie odzyskiwania drobnoustrojów z materiału suchego i wykiełkowanego, niezbędna jest ścisła spójność metodologiczna. Wszystkie porównania należy przeprowadzać z użyciem tej samej partii nasion, identycznych warunków sterylizacji, tych samych pożywek oraz równoważnych procedur rozcieńczania, wysiewania i inkubacji. Bez takiego poziomu standaryzacji pozorne różnice między próbkami suchymi a wykiełkowanymi mogą odzwierciedlać zmienność techniczną, a nie biologicznie istotne wzbogacenie. Jest to szczególnie ważne w procesach izolacji, gdzie odzyskana frakcja jest kształtowana zarówno przez próbkę biologiczną, jak i przez selektywne efekty samej procedury eksperymentalnej4,15.
Równie niezbędne są powtórzenia biologiczne. Taksony o niskiej liczności mogą różnić się między partiami nasion, a odzysk drobnoustrojów z próbek o niskiej biomasie jest z natury stochastyczny, nawet w ściśle kontrolowanych warunkach. W celu uzyskania wiarygodnego porównania zaleca się wykonanie co najmniej pięciu niezależnych powtórzeń biologicznych dla każdego wariantu. W niniejszym schemacie pracy każde powtórzenie biologiczne składa się z materiału połączonego z 3–5 suchych nasion lub 3–5 wykiełkowanych siewek, przetworzonych jako jedna próbka. Ponadto wszystkie czynności po sterylizacji powinny być wykonywane w warunkach aseptycznych, aby zminimalizować wtórne zanieczyszczenia i zachować interpretowalność otrzymanego zestawu izolatów.
Czas trwania kiełkowania należy również starannie dobrać. Musi on być wystarczająco długi, aby umożliwić wyłonienie się korzenia zakiełkowego i wczesny rozwój siewki, ale nie na tyle przedłużony, aby późniejszy wzrost rośliny wprowadził dodatkową złożoność ekologiczną niezwiązaną z bezpośrednim przejściem z nasiona w siewkę. W przypadku pomidora okres kiełkowania do 5 dni w warunkach sterylnych zapewnia praktyczne okno czasowe, w którym siewka pozostaje ściśle powiązana ze środowiskiem nasiona, podczas gdy może już zachodzić wczesna aktywacja i redystrybucja drobnoustrojów. Spójne ramy czasowe we wszystkich eksperymentach są niezbędne, ponieważ różnice w stadium rozwoju mogą same w sobie wpływać na wzorce odzyskiwania drobnoustrojów. Niniejszy schemat postępowania jest najbardziej odpowiedni do porównawczego odzyskiwania hodowlanych mikrobiot z systemów nasion o niskiej biomasie, gdy celem jest ocena przesunięć związanych z kiełkowaniem w standaryzowanych warunkach. Jest on mniej odpowiedni do bezpośredniej oceny całkowitej różnorodności mikrobiomu nasion lub dla systemów eksperymentalnych, w których wymagane są podejścia niezależne od hodowli w celu uchwycenia szerszej społeczności mikrobiologicznej.
Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie powtarzalnych ram dla izolacji kulturowalnej mikrobioty związanej z nasionami pomidora poprzez zintegrowanie zestandaryzowanej sterylizacji powierzchniowej z kontrolowanym kiełkowaniem nasion. Metoda ta umożliwia analizę porównawczą suchych nasion i wykiełkowanych siewek przy użyciu równoważnych powtórzeń biologicznych, z których każde składa się z połączonego materiału z 3–5 suchych nasion lub 3–5 wykiełkowanych siewek, w celu oceny zależnych od kiełkowania zmian w odzyskiwaniu jednostek tworzących kolonie (CFU) oraz w składzie taksonomicznym. Poprzez minimalizację błędów sterylizacji i promowanie odzyskiwania mikroorganizmów podczas przejścia z nasiona w siewkę, podejście to ułatwia izolację mikroorganizmów o potencjalnym znaczeniu funkcjonalnym podczas wczesnego rozwoju siewek i wspiera dalsze badania nad wczesnymi interakcjami między rośliną a mikroorganizmami.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01916-500G</td><td>Składnik agaru LB; 15 g/L.</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Lab1st&nbsp;</td><td>SV120H</td><td>Służy do sterylizacji instrumentów/materiałów lub walidacji sterylizacji.</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA bakterii</td><td>Promocell</td><td>PK-MB708-206-100</td><td>Ekstrakcja DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Ustawienia do liczenia/rejestrowania kolonii</td><td>OCS</td><td>B079Y5W57N</td><td>Potrzebne do rejestrowania CFU, morfotypów i różnic między płytkami; w manuskrypcie nie określono licznika/modelu.</td></tr><tr><td>Fiołki do kriokonserwacji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359033</td><td>Zakładany do przechowywania szczepów glicerynowych w -80 &deg;C; nie zostały wymienione bezpośrednio, ale są potrzebne do etapu konserwacji.</td></tr><tr><td>System rejestracji izolacji cyfrowych</td><td>Nie określono w manuskrypcie</td><td>Nie dotyczy</td><td>Służy do rejestracji meta danych izolacji: pochodzenie, replika, warunki, leczenie sterylizacyjne, data izolacji, środowisko płytkowe, morfologia, status identyfikacji.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>83813440</td><td>Służy do przygotowania 70% v/v roztworu etanolu do sterylizacji powierzchni nasion.</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>11718772</td><td>Opcjonalne alternatywne podłoże do kiełkowania.</td></tr><tr><td>Pincety/szczypce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>930229</td><td>Służą do przenoszenia nasion i zbierania wykiełkowanych sadzonek.</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA genomowego</td><td>PromoCell</td><td>PK-MB708-206-100</td><td>Służy do ekstrakcji DNA genomowego z oczyszczonych kultur bakteryjnych; dokładny zestaw/metoda nie została określona.</td></tr><tr><td>Glicerol, sterylny 80%</td><td>VWR</td><td>24388364</td><td>Mieszany 1:1 v/v z kulturą płynną do przygotowania kriostocku.</td></tr><tr><td>Kopuła przepływu laminarnego Bio48</td><td>Faster</td><td>LAB-CAP-22</td><td>Wymagana do aseptycznego obchodzenia się z nasionami, transferów sterylizacyjnych i przygotowania sterylnych materiałów.</td></tr><tr><td>Medium agar LB</td><td>VWR</td><td>846495000</td><td>Standardowe medium stosowane do porównawczej hodowliwania; na litr: 10 g tryptyzy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl, 15 g agaru.</td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówkowe</td><td>Ratiolab</td><td>RATI5615000</td><td>Służą do sterylizacji nasion i przetwarzania próbek.</td></tr><tr><td>Medium MS</td><td>Sigma</td><td>M0404-10L</td><td>Wspomniane jako sterylne podłoże do kiełkowania w hodowli wolnej od bakterii.</td></tr><tr><td>NZYTaq II 2&times; Master mix</td><td>Nzytech</td><td>MB35803</td><td>Mieszanka PCR do amplifikacji</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm/Merck</td><td>HS234526A</td><td>Służy do uszczelniania płytek kiełkowych, zmniejszając jednocześnie zakażenie.</td></tr><tr><td>Miszki Petriego</td><td>Labbox</td><td>PDIP-E9N-500</td><td>Służą do ustawienia do kiełkowania, nakładania i obsługi wysterylizowanych nasion.</td></tr><tr><td>Phytoagar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>9002-18-0</td><td>Wspomniane jako opcjonalne alternatywne sterylne podłoże do kiełkowania.</td></tr><tr><td>Zestaw pipet i końcówek</td><td>Merck</td><td>EP3123000918-1EA</td><td>Służą do usuwania roztworów sterylizacyjnych, mycia, rozcieńczania i nakładania.</td></tr><tr><td>Medium agar R2A</td><td>HI-MEDIA</td><td>M1743-500G</td><td>Opcjonalne dodatkowe medium do rozszerzonych przepływów kulturowych.</td></tr><tr><td>Chlorku sodu, NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>10040460</td><td>Służy do przygotowania sterylnego 0,45% NaCl do homogenizacji i rozcieńczeń szeregowych; jest również częścią medium LB.</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Carlo Erba</td><td>370323</td><td>Służy do przygotowania 20% v/v roztworu podchlorynu sodu do sterylizacji powierzchni nasion. Materiał żrący; wymaga środków ochrony osobistej.</td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe tłuczki</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030120973</td><td>Służą do homogenizacji suchych nasion i wykiełkowanych sadzonek.</td></tr><tr><td>Mikser wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>15901137</td><td>Służy do resuspendowania komórek mikrobiowych z homogenatów.</td></tr></tbody></table>

izolacja mikrobioty związanej z nasionami pomidora poprzez kontrolowane kiełkowanie i hodowle porównawcze

Isolation of Tomato Seed-Associated Microbiota Through Controlled Germination and Comparative Culturing

Sterylizacja powierzchniowa jest krytycznym, ale często nieoptymalizowanym etapem w badaniach mających na celu izolację mikroorganizmów związanych z nasionami, ponieważ zbyt surowocie traktowanie może zmniejszać lub zniekształcać endogenne populacje mikrobiomu. Ten protokół przedstawia powtarzalne podejście do izolacji hodowanych mikrobiomów związanych z nasionami pomidorów przy użyciu warunków sterylizacji powierzchniowej opartych na uprzednio zweryfikowanych metodologiach, w połączeniu z kontrolowaną kiełkowaniem nasion. Zamiast definiować uniwersalnie optymalne traktowanie sterylizacyjne, podejście to stosuje standaryzowane warunki, które można dostosować według cech nasion, minimalizując jednocześnie stronniczość i zachowując endogenne populacje mikrobiomu.
Aby zwiększyć odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów związanych z przejściem z nasion do siewek, protokół obejmuje kontrolowany etap kiełkowania przed izolacją mikrobiomu. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść opartych na maceratowaniu suchych, niekiełkujących nasion, kontrolowane kiełkowanie promuje aktywację mikroorganizmów podczas przejścia z nasion do siewek w sterylnych warunkach. Porównawcze analizy jednostek tworzących kolonie (CFU) ekwiwalencyjnych replikat biologicznych, z których każda składa się ze zbiorczego materiału z 3–5 suchych nasion lub 3–5 kiełkujących siewek, ujawniły zauważalną zmianę w hodowanych społecznościach po kiełkowaniu. Rodzaje, które były słabo reprezentowane w suchych nasionach, wzbogaciły się po kiełkowaniu, podczas gdy inne taksony, które były bardziej obfite w suchych nasionach, zmniejszyły swoją względną reprezentację, co wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.
W różnych replikatach biologicznych, rodzaje w tym Stutzerimonas, Stenotrophomonas oraz Priestia były konsekwentnie wzbogacone wśród izolaci pochodzących z kiełkujących siewek, podczas gdy Paenibacillus pozostawał obfity w różnych warunkach, ale wykazywał zauważalne zmiany w składzie na poziomie gatunków. Integrując standaryzowane warunki sterylizacji z kontrolowanym kiełkowaniem i porównawczą analizą materiału suchego i kiełkującego, ten protokół dostarcza solidnej i powtarzalnej ramy dla kulturowej izolacji mikrobiomu związanego z nasionami, o potencjalnym funkcjonalnym znaczeniu w wczesnym rozwoju siewek, i wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.

Przeprowadzenie sterylizacji powierzchniowej i kontrola kontaminacji zewnętrznej 
Sterylizacja powierzchniowa w znormalizowanych warunkach, oparta na wcześniej zwalidowanych metodologiach, doprowadziła do skutecznej redukcji zewnętrznej kontaminacji mikrobiologicznej, przy jednoczesnym zachowaniu odzysku drobnoustrojów zdolnych do hodowli z materiału pochodzącego z nasion. Posiew końcowej wody płuczącej nie wykazał wykrywalnego wzrostu kolonii, co wskazuje na skuteczne usunięcie mikroorganizmów zwią...

Ten protokół łączy standaryzowaną sterylizację powierzchni nasion z kontrolowaną kiełkowaniem, aby umożliwić powtarzalne izolację mikrobioty związanej z nasionami pomidora podczas przejścia od nasiona do sadzonki. Podejście to poprawia odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów, które są niedostatecznie reprezentowane w suchych nasionach i wspiera porównawcze badania kulturowe podczas wczesnego rozwoju sadzonek.

Izolacja mikrobioty związanej z nasionami pomidora poprzez kontrolowane kiełkowanie i hodowle porównawcze

Surface sterilization is a critical yet frequently under-optimized step in studies aiming to isolate seed-associated microorganisms, as excessively harsh ...

isolation-tomato-seed-associated-microbiota-through-controlled

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Hassan, J. A., et al. Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek. J. Vis. Exp. (2020).Ten film przedstawia metodę badań przesiewowych pod kątem oporności bakteryjnej w różnych odmianach pomidorów przy użyciu dziesięciodniowych sadzonek zaszczepionych zawiesiną bakteryjną. Wyjaśnia, w jaki sposób bakterie atakują aparaty szparkowe, dostarczają białka efektorowe w celu stłumienia odporności roślin oraz...

Test zalewania sadzonek w celu badania przesiewowego odporności bakteryjnej pomidorów

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie...

System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

Bakterie endofityczne kolonizują tkanki roślinne i wspomagają ich wzrost.Aby zbadać ich wpływ na wzrost pomidorów w stresie solnym, zacznij od sterylnych sadzonek z rozwijającymi się liśćmi i korzeniami.Zanurz korzenie eksperymentalnej sadzonki w zawiesinie bakterii endofitycznych; Pozostawić kontrolę niezaszczepioną.Przenieś obie grupy do wysterylizowanej gleby, aby zapobiec zewnętrznej ingerencji mikrobiologicznej i inkubuj w komorze wzrostowej.Z gleby bakterie dostają się przez przejściowe...

Zwiększenie tolerancji na stres solny u roślin pomidora poprzez endofityczną kolonizację bakteryjną

Źródło: Matthysse, A. G. Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium. J. Vis. Exp., (2018)Ten film pokazuje protokół pomiaru kolonizacji korzeni siewek pomidora przez bakterie patogenne typu dzikiego i niedoborowego celulozy. Liczebne ilości gęsto przylegających bakterii wykazują większą przyczepność i tworzenie mikrokolonii przez szczep typu dzikiego, co podkreśla rolę celulozy w stabilnej kolonizacji korzeni.

Ocena kolonizacji korzeni siewek pomidorów przez patogenną bakterię na podstawie liczenia komórek żywotnych

Prosta metoda pomiaru i charakteryzowania przyczepności bakterii do roślin, szczególnie korzeni i pędów, jest opisana w tym artykule.

Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

Tutaj prezentujemy wszechstronną metodę transformacji korzenia pomidora, a następnie inokulacji Ralstonia solanacearum, aby przeprowadzić prostą analizę genetyczną do badania bakteryjnej choroby więdnięcia.

Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

Test zalewania sadzonek ułatwia szybkie badanie odmian dzikich pomidorów pod kątem odporności na bakterię Pseudomonas syringae. Ten test, stosowany w połączeniu z testem wzrostu bakterii siewek, może pomóc w dalszym charakteryzowaniu podstawowej odporności na bakterię i może być wykorzystany do mapowania populacji w celu określenia genetycznych podstaw odporności.

Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek

Aby uzyskać aksenicznego owada, jego powierzchnia jaja jest sterylizowana, a wykluta larwa jest następnie hodowana za pomocą aksonicznych liści. Metoda ta zapewnia skuteczny sposób przygotowania owadów aksenowych bez podawania antybiotyków lub opracowywania sztucznej diety, którą można również zastosować do innych owadów żywiących się liśćmi.

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Protokół ten jest przydatny do oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju w celu obserwacji drobniejszej struktury embrionalnej.

Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.)

iPlantMicro Lab..  This protocol combines standardized seed surface sterilization with controlled germination to enable the reproducible isolation of tomato seed-associated microbiota during the seed-to-seedling transition. The approach enhances recovery of culturable microorganisms that are underrepresented in dry seeds and supports comparative culturomic studies during early seedling development.

Izolacja mikrobioty związanej z nasionami pomidora poprzez kontrolowane kiełkowanie i hodowle porównawcze

Przeglądaj więcej filmów