Name: Elektroforetyczne rozdzielanie białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj elektroforetyczne rozdzielanie białek metodą PAGE w biochemii i proteomice. Technika ta umożliwia separację białek według ładunku i rozmiaru w żelu poliakrylamidowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pełny protokół tekstowy dla tej metody eksperymentalnej jest dostępny w <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1002a/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Molecular Biology</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

elektroforetyczne rozdział białek

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektroforeza jest wykorzystywana do rozdzielania złożonych mieszanin białek (np. z komórek, frakcji subkomórkowych, frakcji kolumnowych lub immunoprecypitatów), badania składu podjednostek oraz weryfikacji homogeniczności próbek białek. Może służyć również do oczyszczania białek do dalszych zastosowań. W elektroforezie w żelu poliakrylamidowym białka migrują pod wpływem pola elektrycznego przez pory w matrycy żelu poliakrylamidowego; wielkość porów zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia akryloamidu. Szybkość migracji białka jest określana przez kombinację wielkości porów oraz ładunku, rozmiaru i kształtu białka. W niniejszej jednostce opisano standardową metodę Laemmliego dla nieciągłej elektroforezy żelowej w warunkach denaturujących, tj. w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS).

W tym filmie prezentujemy metodę elektroforetycznego rozdzielania białek z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Elektroforetyczne rozdział białek

Elektroforezę stosuje się do rozdzielania złożonych mieszanin białek (np. z komórek, frakcji subkomórkowych, frakcji kolumnowych lub immunoprecypitatów), aby...

Oddzielenie poszczególnych białek z kompleksowych mieszanin białkowych można osiągnąć za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, znanej jako PAGE; białka migrują w odpowiedzi na pole elektryczne przez pory w matrycy żelu. Połączenie wielkości porów żelu z ładunkiem, rozmiarem i kształtem białka determinuje szybkość jego migracji. W tym filmie zaprezentujemy metodę elektroforetycznego rozdzielania białek.Witajcie, jestem dr Bobul Chakravarti z Centrum Proteomiki Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Dzisiaj zaprezentuję procedurę przeprowadzania jednowymiarowej elektroforezy w żelu. Zapraszam do rozpoczęcia.W pierwszej kolejności należy złożyć kasetę z płytek szklanych aparatury do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta, używając dwóch czystych płytek szklanych i dwóch przekładek o grubości 1,5 millimeter. Następnie należy przymocować kasetę do statywu do odlewania żeli. W kolejnym kroku należy przygotować roztwór żelu rozdzielającego zgodnie z opisem w aktualnych protokołach.Do roztworu dodać określoną ilość 10%siarczanu amonu i wymieszać delikatnie. Ze względu na wysokie stężenie akryloamidu odgazowywanie nie jest konieczne. Używając jednorazowej plastikowej pipety o pojemności 10 ml, natychmiast nanieść roztwór żelu rozdzielającego na kanapkę wzdłuż krawędzi jednego z dystansów, aż wysokość roztworu między płytkami szklanymi wyniesie około 11 cm.Następnie za pomocą innej pipety powoli pokryj wierzch żelu warstwą wody nasyconej izobutanolu lub wody destylowanej o grubości około jednego centymetra. Zrób to, delikatnie nakładając wodę wzdłuż krawędzi jednego, a następnie drugiego dystansera; pozostaw żel do polimeryzacji na 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej warstwa wody zapewnia polimeryzację żelu akryloamidowego w linii prostej.Po spolimeryzowaniu żelu można przystąpić do wylania żelu zagęszczającego. Najpierw należy odlać warstwę wody destylowanej, a następnie przepłukać żel roztworem 1x Tris-HCl w SDS o pH 8,8. Następnie należy przygotować roztwór żelu zagęszczającego zgodnie z aktualnymi protokołami.Następnie, używając plastikowej pipety, pozwól, aby roztwór żelu startowego powoli spływał do środka zestawu między płytkami wzdłuż krawędzi jednego z dystansów, aż wysokość roztworu w kanapce wyniesie około jednego centymetra od górnej krawędzi płytek. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do żelu startowego. Po nalaniu żelu wsuń grzebień teflonowy o grubości 0,75 mm w warstwę roztworu żelu startowego.Pozostawić roztwór żelu zagęszczającego do polimeryzacji na 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej; teraz można przystąpić do przygotowania próbek białek. Aby rozpocząć przygotowanie próbek białek, rozcieńczyć część analizowanej próbki białka w stosunku jeden do jednego buforem do próbek 2X SDS.W przypadku rozcieńczonych roztworów białek należy rozważyć zastosowanie mieszaniny białka i 6× buforu do próbek SDS w stosunku pięć do jednego. Jeśli próbką jest osad białkowy, należy rozpuścić białko w 50 do 100 µL 1× buforu do próbek SDS. Następnie próbki należy podgrzewać przez trzy do pięciu minut w temperaturze 100 °C w kąpieli wodnej, używając szczelnych probówek do mikrocentryfugi z zakrętką.Następnie ostrożnie wyjmij grzebień teflonowy, uważając, aby nie przerwać krawędzi studni poliakryloamidowych. Po wyjęciu grzebienia przepłucz studnie buforem do elektroforezy 1X SDS. Następnie, za pomocą pipety, napełnij studnie buforem do elektroforezy 1X SDS.Po wypłukaniu i napełnieniu dołków buforem, przymocuj kasetę z żelem do górnej komory buforowej. Zgodnie z instrukcjami producenta, napełnij dolną komorę buforową zalecaną ilością jednokrotnego buforu do elektroforezy SDS. Następnie umieść kasetę przymocowaną do górnej komory buforowej w dolnej komorze buforowej.Teraz całkowicie wypełnij górną komorę buforową buforem do elektroforezy XSDS, tak aby dołeczki żelu kondensującego zostały wypełnione buforem. Żel jest teraz gotowy do załadunku; używając autopipety o pojemności 25 lub 100 µL z końcówkami do nakładania próbek na żel, nanieś próbkę białka do jednej lub kilku dołeczek, ostrożnie aplikując próbkę w postaci cienkiej warstwy na dnie dołeczek. Do dołeczek kontrolnych nanieś standardy masy cząsteczkowej.Do pozostałych pustych dołków należy dodać taką samą objętość 1X SDS buforu do prób, aby zapobiec rozlewaniu się treści sąsiednich ścieżek. Można teraz przystąpić do elektroforezy w żelu. Aby przeprowadzić elektroforezę, należy podłączyć zasilacz do komory i prowadzić ją przy stałym natężeniu prądu 30 mA dla żelu płaskiego o grubości 1,5 mm.Po dotarciu niebieskiego barwnika śledzącego (menthol blue) do dolnej krawędzi żelu rozdzielającego należy odłączyć zasilacz. Po zakończeniu elektroforezy należy wylać bufor do elektroforezy i wyjąć górną komorę buforową wraz z zamocowaną kanapką żelową. Ustawić żel w taki sposób, aby kolejność studzienek z próbkami była znana.Następnie wyjmij kanapkę z górnej komory buforowej i połóż ją na arkuszu papieru chłonnego lub ręczniku papierowym. Następnie ostrożnie przesuń jeden z dystansów w połowie od krawędzi kanapki wzdłuż całej jej długości. Wykorzystaj odsłonięty dystans jako dźwignię, aby podważyć płytkę szklaną i ostrożnie odsłonić żel.Wyjmij żel z dolnej płyty. Odetnij mały trójkąt z jednego narożnika żelu, aby nie zgubić orientacji ścieżek podczas barwienia i suszenia. Procedura elektroforezy żelowej została zakończona.Żel można teraz poddać dalszej obróbce, stosując różne procedury detekcji białek. Przedstawiliśmy właśnie sposób rozdzielania białek za pomocą elektroforezy żelowej. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroforetyczne rozdzielanie białek

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

Ten film opisuje multimeryczną STRONĘ do oddzielania natywnych kompleksów białkowych od homogenatów tkankowych. Technika ta jest hybrydą niebieskich technik native-page i SDS-PAGE. Oddzielone kompleksy można scharakteryzować i zbadać pod kątem ich roli w funkcjonowaniu komórki.

Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Ten protokół opisuje, jak przygotować i przeprowadzić przezroczystą elektroforezę uwięzienia frakcji płynnej z natywną żelową (CN-GELFrEE), natywną technikę separacji niekowalencyjnych zespołów biomolekularnych i białek z heterogenicznych próbek, która jest kompatybilna z różnymi technikami analizy białek.

CN-GELFrEE - Przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy

Po rozdzieleniu metodami elektroforetycznymi białka w żelu można wykryć za pomocą kilku metod barwienia. W niniejszym filmie zaprezentowano barwienie białek błękitem Coomassie, barwienie srebrem, SYPRO Orange oraz SYPRO Ruby.

Barwienie białek w żelach

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Mikrodruk białek w biologii komórki

Kopulacja i separacja tetrad są niezbędne do analizy genetycznej Chlamydomonas reinhardtii. W niniejszym materiale prezentujemy standardowe metody gametogenezy, kopulacji, kiełkowania zygot oraz sekcji tetrad. Niniejszy protokół składa się z serii łatwych do wykonania kroków, które ułatwią zastosowanie metod genetycznych naukowcom mniej zaznajomionym z Chlamydomonas.

Kojenie i separacja tetrad Chlamydomonas reinhardtii do analizy genetycznej

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Test pull-down kalmoduliny (CaM) jest skutecznym sposobem badania oddziaływań CaM z różnymi białkami. Metoda ta wykorzystuje paciorki sefarozowe z CaM do wydajnej i specyficznej analizy białek wiążących CaM. Stanowi ona istotne narzędzie do badania sygnalizacji CaM w funkcjach komórkowych.

Wytrącanie białek wiążących kalmoduliną (pull-down)

Poznaj elektroforetyczne rozdzielanie białek metodą PAGE w biochemii i proteomice. Technika ta umożliwia separację białek według ładunku i rozmiaru w żelu poliakrylamidowym.

Elektroforetyczne rozdział białek

Przeglądaj więcej filmów