Elektroforetyczne rozdział białek

Oddzielenie poszczególnych białek z kompleksowych mieszanin białkowych można osiągnąć za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, znanej jako PAGE; białka migrują w odpowiedzi na pole elektryczne przez pory w matrycy żelu. Połączenie wielkości porów żelu z ładunkiem, rozmiarem i kształtem białka determinuje szybkość jego migracji. W tym filmie zaprezentujemy metodę elektroforetycznego rozdzielania białek.

Witajcie, jestem dr Bobul Chakravarti z Centrum Proteomiki Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Dzisiaj zaprezentuję procedurę przeprowadzania jednowymiarowej elektroforezy w żelu. Zapraszam do rozpoczęcia.

W pierwszej kolejności należy złożyć kasetę z płytek szklanych aparatury do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta, używając dwóch czystych płytek szklanych i dwóch przekładek o grubości 1,5 millimeter. Następnie należy przymocować kasetę do statywu do odlewania żeli. W kolejnym kroku należy przygotować roztwór żelu rozdzielającego zgodnie z opisem w aktualnych protokołach.

Do roztworu dodać określoną ilość 10%siarczanu amonu i wymieszać delikatnie. Ze względu na wysokie stężenie akryloamidu odgazowywanie nie jest konieczne. Używając jednorazowej plastikowej pipety o pojemności 10 ml, natychmiast nanieść roztwór żelu rozdzielającego na kanapkę wzdłuż krawędzi jednego z dystansów, aż wysokość roztworu między płytkami szklanymi wyniesie około 11 cm.

Następnie za pomocą innej pipety powoli pokryj wierzch żelu warstwą wody nasyconej izobutanolu lub wody destylowanej o grubości około jednego centymetra. Zrób to, delikatnie nakładając wodę wzdłuż krawędzi jednego, a następnie drugiego dystansera; pozostaw żel do polimeryzacji na 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej warstwa wody zapewnia polimeryzację żelu akryloamidowego w linii prostej.

Po spolimeryzowaniu żelu można przystąpić do wylania żelu zagęszczającego. Najpierw należy odlać warstwę wody destylowanej, a następnie przepłukać żel roztworem 1x Tris-HCl w SDS o pH 8,8. Następnie należy przygotować roztwór żelu zagęszczającego zgodnie z aktualnymi protokołami.

Następnie, używając plastikowej pipety, pozwól, aby roztwór żelu startowego powoli spływał do środka zestawu między płytkami wzdłuż krawędzi jednego z dystansów, aż wysokość roztworu w kanapce wyniesie około jednego centymetra od górnej krawędzi płytek. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do żelu startowego. Po nalaniu żelu wsuń grzebień teflonowy o grubości 0,75 mm w warstwę roztworu żelu startowego.

Pozostawić roztwór żelu zagęszczającego do polimeryzacji na 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej; teraz można przystąpić do przygotowania próbek białek. Aby rozpocząć przygotowanie próbek białek, rozcieńczyć część analizowanej próbki białka w stosunku jeden do jednego buforem do próbek 2X SDS.

W przypadku rozcieńczonych roztworów białek należy rozważyć zastosowanie mieszaniny białka i 6× buforu do próbek SDS w stosunku pięć do jednego. Jeśli próbką jest osad białkowy, należy rozpuścić białko w 50 do 100 µL 1× buforu do próbek SDS. Następnie próbki należy podgrzewać przez trzy do pięciu minut w temperaturze 100 °C w kąpieli wodnej, używając szczelnych probówek do mikrocentryfugi z zakrętką.

Następnie ostrożnie wyjmij grzebień teflonowy, uważając, aby nie przerwać krawędzi studni poliakryloamidowych. Po wyjęciu grzebienia przepłucz studnie buforem do elektroforezy 1X SDS. Następnie, za pomocą pipety, napełnij studnie buforem do elektroforezy 1X SDS.

Po wypłukaniu i napełnieniu dołków buforem, przymocuj kasetę z żelem do górnej komory buforowej. Zgodnie z instrukcjami producenta, napełnij dolną komorę buforową zalecaną ilością jednokrotnego buforu do elektroforezy SDS. Następnie umieść kasetę przymocowaną do górnej komory buforowej w dolnej komorze buforowej.

Teraz całkowicie wypełnij górną komorę buforową buforem do elektroforezy XSDS, tak aby dołeczki żelu kondensującego zostały wypełnione buforem. Żel jest teraz gotowy do załadunku; używając autopipety o pojemności 25 lub 100 µL z końcówkami do nakładania próbek na żel, nanieś próbkę białka do jednej lub kilku dołeczek, ostrożnie aplikując próbkę w postaci cienkiej warstwy na dnie dołeczek. Do dołeczek kontrolnych nanieś standardy masy cząsteczkowej.

Do pozostałych pustych dołków należy dodać taką samą objętość 1X SDS buforu do prób, aby zapobiec rozlewaniu się treści sąsiednich ścieżek. Można teraz przystąpić do elektroforezy w żelu. Aby przeprowadzić elektroforezę, należy podłączyć zasilacz do komory i prowadzić ją przy stałym natężeniu prądu 30 mA dla żelu płaskiego o grubości 1,5 mm.

Po dotarciu niebieskiego barwnika śledzącego (menthol blue) do dolnej krawędzi żelu rozdzielającego należy odłączyć zasilacz. Po zakończeniu elektroforezy należy wylać bufor do elektroforezy i wyjąć górną komorę buforową wraz z zamocowaną kanapką żelową. Ustawić żel w taki sposób, aby kolejność studzienek z próbkami była znana.

Następnie wyjmij kanapkę z górnej komory buforowej i połóż ją na arkuszu papieru chłonnego lub ręczniku papierowym. Następnie ostrożnie przesuń jeden z dystansów w połowie od krawędzi kanapki wzdłuż całej jej długości. Wykorzystaj odsłonięty dystans jako dźwignię, aby podważyć płytkę szklaną i ostrożnie odsłonić żel.

Wyjmij żel z dolnej płyty. Odetnij mały trójkąt z jednego narożnika żelu, aby nie zgubić orientacji ścieżek podczas barwienia i suszenia. Procedura elektroforezy żelowej została zakończona.

Żel można teraz poddać dalszej obróbce, stosując różne procedury detekcji białek. Przedstawiliśmy właśnie sposób rozdzielania białek za pomocą elektroforezy żelowej. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.