Analiza immunoblot

Immuno blotting, często określany jako Western blotting, służy do identyfikacji w próbce białka specyficznych antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne. Procedura ta zwykle następuje po elektroforezie żelowej 2D lub 2D i polega na przeniesieniu oddzielonych białek do membran nitrocelulozowych. Inkubacja tych błon z pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwciałami, bezpośrednio lub pośrednio sprzężonymi z enzymami i wizualizacja antygenów białkowych na tych błonach przy użyciu reakcji z kolorowym lub fluorescencyjnym substratem.

W tym filmie przedstawiamy krok po kroku demonstrację procedury immunoblottingu. Cześć, nazywam się Sean Gallagher i współpracuję z centrum proteomicznym w KE Graduate Institute. Dzisiaj pokażę Wam analizę immuno blottingu.

Obejmuje ona szereg etapów, w tym separację białek, osuszanie białek na błonach, sondowanie immunologiczne i wizualizację za pomocą substratów chromogennych i luminescencyjnych kim. Więc zacznijmy. Przed rozpoczęciem procedury immunoblottingu próbki białek muszą być najpierw oddzielone za pomocą elektroforezy przy użyciu małych lub standardowych żeli jedno- lub dwuwymiarowych.

Przygotuj próbki antygenowe i załaduj je do pasów na żelu, dołącz wstępnie wybarwione lub biotynylowane białko, wzorce masy cząsteczkowej w jednym lub więcej paskach żelu. Te markery białkowe przeniosą się do błony i wygodnie wskażą orientację błony i rozmiary białek po barwieniu immunologicznym. Po zakończeniu elektroforezy jesteśmy gotowi do złożenia immuno blot.

Aby złożyć immuno blot Najpierw zdemontuj kanapkę z żelem i wyjmij żel do układania, zrównoważ żel przez 30 minut W temperaturze pokojowej w buforze transferowym ta równowaga jest wymagana, aby zapobiec zmianie wielkości żelu podczas przenoszenia, gdy żel jest w równowadze. Rozpocznij montaż kanapki transferowej na tacy wystarczająco dużej, aby pomieścić plastikową kasetę transferową wypełnioną buforem transferowym, tak aby kaseta była przykryta. Teraz umieść jasną podkładkę lub gąbkę w dolnej połowie plastikowej kasety transferowej.

Następnie weź arkusz bibuły filtracyjnej, który został przycięty do tego samego rozmiaru co żel. Wstępnie zwilż go buforem transferowym i umieść na wierzchu jasnej podkładki szkockiej. Po zakończeniu 30-minutowej równoważności żelu umieść żel na bibule filtracyjnej.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza między żelem a bibułą filtracyjną, delikatnie tocząc probówkę lub szklany pręt po powierzchni żelu. Możesz też użyć wałka BioRad, który jest dołączony do zestawu BioRad. Pamiętaj o używaniu rękawiczek podczas manipulowania bibułą filtracyjną, żelami i membranami.

Olej z twoich rąk zablokuje transfer. Następnie przygotuj membranę transferową. Przytnij membranę do tego samego rozmiaru co żel plus jeden do dwóch milimetrów na każdej krawędzi.

Następnie powoli umieść membranę w wodzie destylowanej jedną krawędzią pod kątem 45 stopni, woda wsiąknie do membrany i ostatecznie zwilży całą powierzchnię. Jeśli zostanie szybko włożony dwa razy do wody, powietrze zostanie uwięzione i pojawi się jako białe plamy na membranie. Białko nie przeniesie się na te obszary.

Gdy membrana jest całkowicie mokra, zrównoważ ją przez 10 do 15 minut i przenieś bufor. Ta procedura zwilżania działa w przypadku membran nitrocelulozowych i nylonowych. Tylko membrany PVDF są hydrofobowe i nie zamokną po prostu po umieszczeniu w wodzie destylowanej lub przeniesieniu. Bufor.

Membrany PVDF należy najpierw zanurzyć w 100% metanolu na jedną do dwóch sekund, a następnie równoważyć przez 10 do 15 minut. W buforze transferowym. W żadnym momencie nie pozwól, aby membrana wyschła.

Jeśli tak się stanie, ponownie zwilżyć metanolem, a następnie buforem transferowym. Gdy membrana jest gotowa, umieść wstępnie zwilżoną membranę bezpośrednio na górnej stronie żelu. Należy pamiętać o usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza znajdujących się pomiędzy żelem a membraną poprzez delikatne przetaczanie po powierzchni membrany szklanego pręta do probówki lub wałka BioRad.

Następnie zwilż, kolejny kawałek bibuły filtracyjnej watman o średnicy trzech mm. Następnie umieść go na membranie i ponownie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza. Następnie umieść kolejną jasną podkładkę lub gąbkę szkocką na wierzchu tej bibuły filtracyjnej.

Zakończ montaż kanapki z immuno blot, blokując górną połowę kasety transferowej na miejscu. Teraz, gdy kanapka z immuno blot jest już złożona, jesteśmy gotowi do przeniesienia białek z żelu na błonę. Aby rozpocząć procedurę przenoszenia, napełnij zbiornik do elektroblottingu buforem transferowym i umieść kasetę transferową zawierającą kanapkę w aparacie do elektroblottyzacji.

Ważne jest, aby kanapka była skierowana w stronę anody lub dodatnio naładowanej strony zbiornika. Podłącz przewody zasilacza do odpowiednich stron anody i katody aparatu do biczowania elektrycznego. Ta konkretna bibuła kryterium jest dostarczana z chłodzącym blokiem lodu.

Teraz elektroforetyczne przenoszenie białek z żelu do membrany przez 30 do 60 minut przy napięciu 50 woltów z chłodzeniem lub przez noc przy napięciu 14 woltów w chłodni. Po zakończeniu przenoszenia wyłącz zasilanie i zdemontuj urządzenie. Następnie usuń membranę z aparatu do bibuły i zanotuj orientację, przecinając róg.

W tym momencie membrany można wysuszyć i przechowywać w zamykanej plastikowej torbie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez rok. Przed dalszym przetwarzaniem wysuszone membrany PVDF należy umieścić w niewielkiej ilości 100% metanolu w celu zwilżenia membrany. Następnie w wodzie destylowanej w celu usunięcia metanolu.

Po zaznaczeniu orientacji zabarwić żel, aby sprawdzić skuteczność nanoszenia. Aby uwidocznić przenoszone białka, można albo zabarwić błonę odwracalnie rubinem cipro, albo nieodwracalnie atramentem kamasi blue India, błękitem naftolowym lub złotem koloidalnym. Te nieodwracalne procedury barwienia są niekompatybilne z membranami nylonowymi.

Teraz, gdy białka są przenoszone do błony, przystąp do sondowania immunologicznego i wizualnego wykrywania białek. Na tym etapie unieruchomione białka na błonie są badane za pomocą specyficznych przeciwciał w celu identyfikacji i ilościowego określenia wszelkich obecnych antygenów. Aby rozpocząć, umieść membranę w plastikowej tacce inkubacyjnej z 20 mililitrami buforu blokującego.

Niektórzy ludzie używają worków, ale często zamiast nich używa się tacek, ponieważ są one szczególnie przydatne podczas przetwarzania dużej liczby pasków w różnych roztworach przeciwciał pierwotnych. Następnie inkubuj szczelnie uszczelnioną membranę przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej lub platformie kołyszącej. Podczas inkubacji błony rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało i bufor blokujący.

Rozcieńczenie określa się empirycznie, ale zwykle wynosi od jednego do 100 do jednego do 1000. W przypadku przeciwciała poliklonalnego od jednego do 10 do jednego na 100 w przypadku supernatantów hybrydowych i więcej niż jeden do 1000 w przypadku płynu zawierającego przeciwciała monoklonalne kwasów mysich. Po zakończeniu inkubacji wylej bufor blokujący.

Zastąp bufor rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym i ponownie inkubuj przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej ze stałym mieszaniem. Następnie umyj membranę czterokrotnie, mieszając 100 mililitrami. TTBS dla filtrów NITROCELULOZOWYCH lub PVDF lub TBS dla filtrów nylonowych.

Myć przez 10 do 15 minut za każdym razem, gdy membrana jest myta, rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym. Przykładami przeciwciał drugorzędowych są peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna, koniugat anty IG, dostępny w handlu sprzężony enzym. Przeciwciała drugorzędowe są zwykle rozcieńczane od jednego do 200 do jednego do 25 000 przed użyciem.

Po zakończeniu etapów mycia i wyrzuceniu materiałów myjących, dodać rozcieńczoną peroksydazę chrzanowego lub fosfatazę alkaliczną, koniugat anty IG i inkubować przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Po 30 do 60 minutach wyjmij membranę z pojemnika i umyj ją cztery razy, za każdym razem od 10 do 15 minut. W TTBS zgodnie z wcześniejszym opisem.

Po zakończeniu prania jesteśmy gotowi do przejścia do etapu wizualizacji. Ale najpierw zademonstrujemy alternatywną procedurę sondowania immunologicznego. Ta alternatywna procedura sondowania immunologicznego opiera się na zestawie BC do barwienia wektorowego A firmy Vector Labs.

Wykorzystuje kompleks biotyny avidan do przyłączenia peroksydazy chrzanowej lub HRPO lub fosfatazy alkalicznej A A P do biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego. Dzisiaj zademonstrujemy zestaw HRPO. TTBS doskonale nadaje się jako bufor blokujący dla systemów biotyny avadon.

Jednak w przypadku filtrów nylonowych zalecane są odczynniki wiążące białka, ponieważ beztłuszczowe mleko w proszku zawiera resztki biotyny, które będą zakłócać test immunologiczny. Musi być używany na etapie blokowania tylko w celu rozpoczęcia równoważenia membrany w buforze blokującym w otwartej tacy przy ciągłym mieszaniu za pomocą wytrząsarki orbitalnej lub platformy kołyszącej. Inkubować błonę przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy membrana się równoważy.

Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Stosować TTBS do membran NITROCELULOZOWYCH lub PVDF o wysokiej czułości Aden. Systemy biotyny.

Rozcieńczenie cera zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe na ogół waha się od jednego na 1000 do jednego na 100 000. Zastosowanie chemii chemiluminescencyjnej wymaga większego zakresu rozcieńczeń. W naszym przypadku wykazując chromogenność.

Używamy rozcieńczenia podstawowego jeden na 5 000. Po zakończeniu równoważenia e usuń bufor blokujący. Następnie dodaj tyle roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, aby pokryć błonę.

Inkubować membranę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc po 30 minutach. Przemyć membranę trzykrotnie w TTBS dla nitrocelulozy w odstępach pięciominutowych Podczas etapu płukania przygotować roztwór biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając jedną kroplę biotynylowanego przeciwciała w 10 mililitrach TTBS. Po zakończeniu etapów mycia dodaj wtórny roztwór przeciwciała.

Inkubować błonę przez 30 minut w temperaturze pokojowej z powolnym kołysaniem, podczas gdy błona jest inkubowana z przeciwciałem drugorzędowym. W tym celu przygotuj biotynę avadon HRPO. Wymieszaj dwie krople odczynnika A do barwienia vti i dwie krople odczynnika B w 10 mililitrach.

TTBS dla nitrocelulozy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej po zakończeniu inkubacji przeciwciał drugorzędowych. Umyj membranę trzy razy w ciągu 15 minut za pomocą TTBS lub TBS.

Następnie dodaj roztwór enzymu biotyny avidan do membrany i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej z powolnym kołysaniem. Następnie umyj membranę trzy razy w 10-minutowych odstępach za pomocą TTBS. Teraz, gdy procedura sondowania immunologicznego została zakończona, białka związane z błoną są gotowe do wizualizacji za pomocą substratów chromogennych.

W tym ostatnim kroku wizualizacji substraty cztery CN dab slash ICL dwa i TMB są powszechnie stosowane w procedurach wykrywania immunologicznego opartych na chrzanie końskim i peroksydazie. Jeśli końcowe płukanie membrany podczas procedury sondy immunologicznej zostało przeprowadzone w TTBS, myj membranę przez 15 minut w temperaturze pokojowej i 50 mililitrach. TBS umieszcza teraz membranę w chromogenicznym roztworze do wizualizacji.

Pasma białkowe powinny pojawić się w ciągu 10 do 30 minut. Po 30-minutowej inkubacji wyrzucić substratową mieszaninę reakcyjną i zakończyć reakcję przez dodanie wody destylowanej. Blotting immunologiczny to wieloetapowa procedura stosowana przez tysiące laboratoriów w celu wykrycia obecności określonych białek po jednej lub jednej elektroforezie 2D.

Właśnie pokazałem ci, jak przeprowadzić analizę immunologiczną krwi. Więc to wszystko. Powodzenia w eksperymentach i dziękuję za oglądanie.