Barwienie białek w żelach

W poprzednim filmie zatytułowanym Elektroforetyczne rozdzielanie białek pokazaliśmy, w jaki sposób można oddzielić złożoną mieszaninę białek za pomocą elektroforezy żelowej. W tym filmie pokażemy cztery różne metody barwienia żelu w celu wizualizacji lokalizacji białek w żelu. Cześć, nazywam się Sean Gallagher i pracuję w UVP i współpracuję z Centrum Proteomiki w KEG Graduate Institute.

Dzisiaj pokażę Wam kilka technik wizualizacji białek po rozdzieleniu za pomocą elektroforezy. Obejmuje to barwienie kamasi na niebiesko-srebrne, cyro orange i cyro ruby. Zacznijmy więc najpierw od koloru niebieskiego Kamasi.

Wykrycie zakazów białkowych w żelu przez barwienie niebieskim Kamasi zależy od niespecyficznego wiązania barwnika. W tym przypadku Kamasi brylantowy niebieski G dwa 50. W tej metodzie białka oddzielone w żelu poliakrylowym są przemywane wodą o wysokiej czystości.

Lokalizacja białek jest następnie wykrywana za pomocą niebieskiego barwnika kamasi na bazie wody. Granica wykrywalności wynosi od 0,3 do jednego mikrograma na pasmo białka. Na początek zacznij od żelu z poliakrylamidu, w którym białka zostały oddzielone przez elektroforezę.

Podczas powolnego mieszania umieść żel poliakrylamidowy w plastikowym pojemniku wypełnionym 300 mililitrami wody o wysokiej czystości. Pozostaw na pięć minut. Wyrzuć i powtórz jeszcze dwa razy po trzecim praniu.

Wylej wodę i przykryj żel roztworem barwiącym Kamasi blue na godzinę, powoli mieszając, po godzinie barwienia wylej roztwór barwiący. Krótko spłucz żel, umieszczając go w około 200 mililitrach wody na 30 minut. W tym momencie żel może być przechowywany w wodzie do przyszłych badań obrazowych.

Na tym etapie żel może być również suszony, aby utrzymać trwały zapis żelu. Aby to zrobić, umieść żel na dwóch arkuszach bibuły filtracyjnej Watman o grubości trzech mm i przykryj górę folią. Następnie suszyć w konwencjonalnej suszarce żelowej przez jedną do dwóch godzin w temperaturze około 80 stopni Celsjusza.

Inną metodą barwienia białek jest barwienie srebrem, które zademonstrujemy w następnej kolejności. Chociaż metoda barwienia na niebiesko Kamasi jest łatwiejsza i szybsza, barwienie srebrem jest znacznie bardziej czułe z granicą wykrywalności wynoszącą 0,3 nanograma BSA. Wykrywanie prążków białkowych w żelu przez barwienie srebrem zależy od wiązania srebra z różnymi grupami chemicznymi w białku.

Poniższy protokół oparty jest na zestawie do barwienia srebra Silver Quest firmy in Vitrogen. Protokół wywodzi się z protokołu szybkiego barwienia, trwającego około 30 minut i stanowi jedną z wielu substancji chemicznych opartych na zestawach stosowanych do barwienia srebra zgodnego ze spektrometrią mas. W takim przypadku przed rozpoczęciem barwienia srebrem użyjemy prefabrykowanego mini żelu in vitrogen.

Upewnij się, że przez cały czas nosisz rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia odciskami palców. Umieść żel na tacy nadającej się do kuchenki mikrofalowej ze 100 mililitrami wody z odczynnikiem. Krótko spłucz, a następnie odlej wodę.

Następnie dodaj 100 mililitrów utrwalacza, składającego się z 40% etanolu, 10% kwasu octowego w wodzie o wysokiej czystości i kuchence mikrofalowej przez 30 sekund. Proces mikrofalowy skraca niezbędne etapy inkubacji poprzez przyspieszenie wiązania i barwienia. W tym momencie umieść żel na shakerze i powoli kołysz się przez pięć minut.

Po pięciu minutach odlej utrwalacz, dodaj 100 mililitrów 30% etanolu, aby umyć żelową kuchenkę mikrofalową przez 30 sekund, a następnie umieść żel na shakerze na pięć minut. Po pięciu minutach odlej etanol. Teraz dodaj 100 mililitrów odczynnika uczulającego w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund, a następnie umieść na shakerze na dwie minuty.

Po dwóch minutach odlej odczynnik uczulający. Dodaj 100 mililitrów wody z odczynnikiem w kuchence mikrofalowej na 30 sekund i umieść na shakerze na dwie minuty. Odlej i powtórz w sumie dwa cykle prania.

Teraz dodaj 100 mililitrów roztworu barwiącego, podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund i powoli mieszaj przez pięć minut. Po pięciu minutach odlej roztwór barwiący. Dodaj 100 mililitrów wody z odczynnikiem, pomiń kuchenkę mikrofalową, krok i umieść bezpośrednio na shakerze na 20 do 60 sekund.

Wylej wodę i natychmiast dodaj 100 mililitrów roztworu rozwijającego i rozwijaj, aż prążki białkowe staną się widoczne. Przy czystym tle zajmie to około pięciu do 10 minut. W tym momencie dodaj 10 mililitrów roztworu korka do dewelopera, aby zatrzymać rozwój w celu uzyskania najlepszych wyników.

Sfotografuj żel tak szybko, jak to możliwe, ponieważ mogą wystąpić niewielkie zmiany w intensywności koloru i wzrosty niespecyficznych elementów tła. Z biegiem czasu żel, który widzisz, zawiera resztki białek Po elektroblotach wysusz żel, aby zachować trwały zapis lub przechowuj w zamykanej plastikowej torbie. Następnie demonstrujemy metodę fluorescencyjnego barwienia żeli.

Barwniki fluorescencyjne mają wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi barwnikami białkowymi. Pomarańczowe barwniki z żelu białkowego Cipro, które tutaj przedstawimy, mogą wykryć od jednego do dwóch nanogramów białka na pasmo. Jest to bardziej wrażliwe niż barwienie na błękit kamasi i tak samo wrażliwe, jak wiele technik barwienia srebrem.

Barwienie fluorescencyjne jest proste i wymaga mniej czasu niż typowe protokoły barwienia srebrem i jest zakończone w mniej niż godzinę. Wybarwione białka można wizualizować za pomocą standardowego transluminatora UV o długości 300 nanometrów lub skanera laserowego. W tym przypadku ponownie użyjemy prefabrykowanego mini żelu in vitrogen, aby rozpocząć przygotowanie i oddzielenie białek za pomocą karty charakterystyki.

Ale użyj 0,05%SDS w uruchomionym buforze zamiast zwykłego 0,1%SDS, aby zmniejszyć fluorescencję tła. Aby rozpocząć procedurę barwienia, wlej pomarańczowy fluorescencyjny roztwór barwiący cipro do małego plastikowego naczynia na jeden lub dwa mini żele o standardowej wielkości. Użyj około 50 mililitrów roztworu barwiącego.

Ważne jest, aby pamiętać, że naczynia do barwienia należy dobrze wyczyścić i spłukać przed użyciem, ponieważ wszelkie detergenty będą zakłócać plamienie. Teraz umieść żel w roztworze barwiącym. Przykryj pojemnik folią aluminiową, aby chronić barwnik przed jasnym światłem.

Delikatnie mieszaj żel w temperaturze pokojowej przez 40 do 60 minut. Wyrzuć roztwór barwiący, a następnie płucz żel przez mniej niż minutę 7,5% kwasem octowym, około 100 mililitrów, aby usunąć nadmiar plamy z powierzchni żelu, zatrzymaj żel, inkubując przez noc w 0,1% tween 20, aby uwidocznić i sfotografować pasma białkowe. Umieść fluorescencyjnie znakowany żel bezpośrednio na standardowym transluminatorze 300 nanometrów lub transluminatorze światła niebieskiego.

Następnie zademonstrujemy alternatywną metodę barwienia fluorescencyjnego, która wykorzystuje rubinowy barwnik fluorescencyjny Cipro. Metoda barwienia rubinem Cipro została zaprojektowana specjalnie do stosowania na stronie dwuwymiarowej, ale okazała się najbardziej czułą barwieniem żelu białkowego dla standardowej jednowymiarowej strony SDS. Aby rozpocząć, przenieś żel do czystego naczynia z polipropylenu lub PVC o odpowiedniej wielkości.

Inkubować żel w odpowiedniej ilości nierozcieńczonego barwnika w żelu cypro rubinowego, ciągłe, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min. Przykryć żel i inkubować przez co najmniej trzy godziny. Przenieś żel do czystego naczynia barwiącego i umyj go raz w 10% roztworze metanolu i 7% kwasu octowego, odzyskaj siły i umieść żel z powrotem na bujaku na 30 minut.

W celu zmniejszenia fluorescencji tła i zwiększenia czułości, żel jest teraz gotowy do oglądania i fotografowania. Chcę wam podziękować za dzisiejsze dzisiejsze protokoły. Pokazaliśmy Ci kilka różnych procedur wizualizacji białek po elektroforezie.

Niektóre są bardzo wrażliwe, takie jak barwienie fluorescencyjne i barwienie srebrem, a niektóre są rutynowe, takie jak barwienie na niebiesko kamasi. Należy pamiętać, że czystość odczynników ma kluczowe znaczenie. Bardzo ważne jest również używanie ultra czystej wody, a także czas na każdym z kroków.

Musisz zwrócić na to szczególną uwagę, aby uzyskać powtarzalne wyniki. To wszystko i powodzenia w następnym zestawie eksperymentów.