Barwienie białek w żelach

W poprzednim filmie zatytułowanym Elektroforetyczne rozdzielanie białek pokazaliśmy, w jaki sposób można rozdzielić złożoną mieszaninę białek przy użyciu elektroforezy w żelu. W tym filmie zaprezentujemy cztery różne metody barwienia żeli w celu wizualizacji lokalizacji białek w żelu. Witajcie, nazywam się Sean Gallagher z firmy UVP i współpracuję z Centrum Proteomiki w KEG Graduate Institute.

Dzisiaj zaprezentuję Państwu szereg technik wizualizacji białek po rozdziale metodą elektroforezy. Obejmują one barwienie błękitem Coomassie, barwienie srebrem oraz barwienie barwnikami SYPRO Orange i SYPRO Ruby. Zacznijmy zatem od błękitu Coomassie.

Wykrywanie prążków białkowych w żelu za pomocą barwienia błękitem Coomassie opiera się na niespecyficznym wiązaniu barwnika. W tym przypadku zastosowano Coomassie Brilliant Blue G-250. W tej metodzie białka rozdzielone w żelu poliakryloamidowym są przemywane wodą o wysokiej czystości.

Lokalizację białek wykrywa się następnie za pomocą barwienia wodnego kamasi blue. Granica wykrywalności wynosi od 0,3 do 1 µg na prążek białkowy. W celu rozpoczęcia procedury należy użyć żelu poliakrylamidowego, w którym białka zostały rozdzielone metodą elektroforezy.

Przy powolnym mieszaniu umieść żel poliakryloamidowy w plastikowym pojemniku wypełnionym 300 ml wody o wysokiej czystości. Pozostaw na pięć minut. Wylej roztwór i powtórz czynność jeszcze dwukrotnie po trzecim przemyciu.

Odlać wodę i przykryć żel roztworem barwiącym Coomassie blue na jedną godzinę, powoli mieszając. Po godzinie barwienia odlać roztwór barwiący. Krótko wypłukać żel, umieszczając go w około 200 mililitrach wody na 30 minut. Na tym etapie żel można przechowywać w wodzie do późniejszej wizualizacji.

Na tym etapie żel można również wysuszyć, aby zachować trwały zapis. W tym celu należy umieścić żel na dwóch arkuszach papieru filtrowanego Whatman o grubości 3 mm i przykryć go folią spożywczą. Następnie należy go suszyć w konwencjonalnej suszarce do żeli przez jedną do dwóch godzin w temperaturze około 80 °C.

Kolejną metodą barwienia białek jest barwienie srebrem, którą zaprezentujemy w dalszej części. Chociaż metoda barwienia błękitem Coomassie jest łatwiejsza i szybsza, barwienie srebrem jest znacznie bardziej czułe, z granicą wykrywalności wynoszącą 0,3 nanogramów BSA. Wykrywanie prążków białkowych w żelu za pomocą barwienia srebrem opiera się na wiązaniu srebra z różnymi grupami chemicznymi w białku.

Poniższy protokół opiera się na zestawie do barwienia srebrem Silver Quest firmy Invitrogen. Protokół ten został opracowany na podstawie metody szybkiego barwienia, trwającej około 30 minut, i stanowi jeden z wielu systemów chemicznych opartych na zestawach do barwienia srebrem, które są kompatybilne ze spektrometrią mas. W tym przypadku przed rozpoczęciem barwienia srebrem użyjemy gotowego mini-żelu firmy Invitrogen.

Należy przez cały czas nosić rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia odciskami palców. Umieścić żel w tacy bezpiecznej do stosowania w kuchence mikrofalowej z 100 mililitrami wody stopnia czystości reagentowej. Krótko przepłukać, a następnie odlać wodę.

Następnie należy dodać 100 mililitrów utrwalacza, składającego się z 40% etanolu i 10% kwasu octowego w wodzie o wysokiej czystości, a następnie poddać działaniu mikrofal przez 30 sekund. Proces mikrofalowy skraca niezbędne etapy inkubacji poprzez przyspieszenie wiązania i barwienia. W tym momencie należy umieścić żel na wytrząsarce i powoli kołysać przez pięć minut.

Po pięciu minutach odlać utrwalacz, dodać 100 mililitrów 30% etanolu w celu przemycia żelu, podgrzewać w mikrofalówce przez 30 sekund, a następnie umieścić żel na wytrząsarce na pięć minut. Po pięciu minutach odlać etanol. Następnie dodać 100 mililitrów odczynnika uwrażliwiającego, podgrzewać w mikrofalówce przez 30 sekund, a następnie umieścić na wytrząsarce na dwie minuty.

Po dwóch minutach odlać odczynnik uwrażliwiający. Dodać 100 milliliters wody czystości reagentowej, podgrzać w kuchence mikrofalowej przez 30 seconds, a następnie umieścić na wytrząsarce na dwie minuty. Odlać ciecz i powtórzyć czynność, aby przeprowadzić łącznie dwa cykle płukania.

Następnie należy dodać 100 milliliters roztworu barwiącego, podgrzać w kuchence mikrofalowej przez 30 seconds i powoli mieszać przez pięć minut. Po upływie pięciu minut należy odlać roztwór barwiący. Należy dodać 100 milliliters wody czystości reagent grade, pominąć etap podgrzewania w mikrofalówce i umieścić próbkę bezpośrednio na shakerze na 20 to 60 seconds.

Odlać wodę i niezwłocznie dodać 100 mililitrów roztworu wywołującego, a następnie wywoływać do momentu, aż prążki białkowe staną się widoczne. Przy zachowaniu przejrzystego tła proces ten zajmie około od pięciu do 10 minut. W tym momencie do wywoływacza należy dodać 10 mililitrów roztworu zatrzymującego, aby przerwać proces wywoływania i uzyskać najlepsze wyniki.

Należy sfotografować żel tak szybko, jak to możliwe, ponieważ mogą wystąpić niewielkie zmiany w intensywności barwy oraz wzrost elementów tła nieswoistego. Z czasem w widocznym żelu gromadzą się białka resztkowe. Po elektrotransferze (blottingu) żel należy wysuszyć w celu zachowania trwałej dokumentacji lub przechowywać w szczelnej plastikowej torebce. Następnie prezentujemy metodę fluorescencyjnego barwienia żeli.

Barwniki fluorescencyjne oferują szereg zalet w porównaniu do tradycyjnych barwień białek. Barwienia żeli białkowych barwnikiem Cipro orange, które zostaną tutaj opisane, pozwalają na wykrycie od jednego do dwóch nanogramów białka na prążek. Metoda ta jest bardziej czuła niż barwienie Coomassie brilliant blue i porównywalna pod względem czułości z wieloma technikami barwienia srebrem.

Barwienie fluorescencyjne jest proste, wymaga mniej czasu pracy ręcznej niż typowe protokoły barwienia srebrem i zostaje ukończone w czasie krótszym niż jedna godzina. Obarwione białka można wizualizować przy użyciu standardowego transluminatora UV 300 nanometrów lub skanera laserowego. W tym przypadku ponownie użyjemy gotowego mini żelu firmy Invitrogen, aby przygotować i rozdzielić białka za pomocą SDS-PAGE.

Należy jednak zastosować 0,05% SDS w buforze do elektroforezy zamiast standardowego 0,1% SDS, aby zredukować fluorescencję tła. Aby rozpocząć procedurę barwienia, należy nalać fluorescencyjny roztwór barwiący cipro orange do małego plastikowego pojemnika mieszczącego jeden lub dwa miniżele o standardowej wielkości. Należy użyć około 50 ml roztworu barwiącego.

Należy pamiętać, że naczynia do barwienia powinny zostać dokładnie oczyszczone i wypłukane przed użyciem, ponieważ wszelkie detergenty będą zakłócać proces barwienia. Teraz należy umieścić żel w roztworze barwiącym. Przykryj naczynie folią aluminiową, aby chronić barwnik przed silnym światłem.

Delikatnie agituj żel w temperaturze pokojowej przez 40 do 60 minut. Odlej roztwór barwiący, a następnie płucz żel przez mniej niż jedną minutę w 7,5% kwasie octowym (około 100 ml), aby usunąć nadmiar barwnika z powierzchni żelu, a następnie odbarwiaj żel poprzez inkubację przez noc w 0,1% tween 20 w celu wizualizacji i sfotografowania prążków białkowych. Umieść żel z etykietą fluorescencyjną bezpośrednio na standardowym transluminatorze 300 nm lub transluminatorze światła niebieskiego.

Następnie zaprezentujemy alternatywną metodę barwienia fluorescencyjnego z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Cipro ruby. Metoda barwienia Cipro ruby została opracowana specjalnie do zastosowań w dwuwymiarowej elektroforezie żelowej, jednak okazała się najbardziej czułą metodą barwienia żeli białkowych w standardowej jednowymiarowej elektroforezie SDS-PAGE. Aby rozpocząć, należy przenieść żel do czystej szalki z polipropylenu lub PVC o odpowiednim rozmiarze.

Inkubuj żel w odpowiedniej ilości nierozcieńczonego barwnika do żeli białkowych cipro ruby, zapewniając ciągłe, delikatne mieszanie na wytrząsarce orbitalnej przy 50 RPMs. Przykryj żel i inkubuj przez co najmniej trzy godziny. Przenieś żel do czystej kuwety do barwienia i przemyj go raz w roztworze 10% methanol i 7% acetic acid, a następnie odzyskaj żel i umieść go z powrotem na kolebce na 30 minut.

W celu zredukowania fluorescencji tła i zwiększenia czułości, żel jest teraz gotowy do analizy i sfotografowania. Dziękuję za zapoznanie się z dzisiejszymi protokołami. Przedstawiliśmy szereg różnych procedur wizualizacji białek po elektroforezie.

Niektóre z nich są bardzo czułe, jak barwienie fluorescencyjne i barwienie srebrem, a inne są rutynowe, jak barwienie Coomassie blue. Należy pamiętać, że czystość odczynników ma kluczowe znaczenie. Bardzo ważne jest również stosowanie wody ultrapurej, a także przestrzeganie czasu trwania każdego z etapów.

Należy zwrócić na to szczególną uwagę, aby uzyskać powtarzalne wyniki. To wszystko, życzymy powodzenia w kolejnych eksperymentach.