Elektroporacja prątków

Strategie patogenetyczne prątków pozostają słabo poznane, a powolne tempo wzrostu większości gatunków jest powolne. Nieprzenikalna natura ściany komórkowej i zagrożenia związane z pracą z patogenami sprawiają, że prątki są trudne do zbadania i są w dużej mierze odpowiedzialne za nasze słabe zrozumienie tych organizmów. W tym filmie zademonstrujemy technikę elektroporacji, która polega na poddaniu komórek krótkiemu i silnemu impulsowi elektrycznemu, który umożliwia wejście DNA.

Jest to najczęściej stosowana metoda wprowadzania DNA do komórek prątków. Cześć, nazywam się Ron Good i pracuję w laboratorium Tanyi Parish z Centrum Chorób Zakaźnych w Bats i London School of Medicine and Dentistry. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę dla mikrobakterii działających elektrycznie.

W naszym laboratorium badamy gruźlicę drobnoustrojów, ale ponieważ jest ona wysoce patogenna i wymaga urządzeń hermetyzujących C3, pokażemy Ci tę technikę w niepatogennej mikrobakterii m Mcma. Zjedzmy więc elektrycznie trochę bakterii. Aby jeść prątki, musimy wytworzyć kompetentne komórki.

Należy pamiętać, że prątki chorobotwórcze stanowią poważne zagrożenie biologiczne. Dlatego wszystkie hodowle i manipulacje genetyczne muszą być przeprowadzane w odpowiednim zabezpieczeniu. Urządzenia wewnątrz szafy bezpieczeństwa klasy pierwszej Ocena ryzyka musi stanowić pierwszą część każdego eksperymentu z prątkami chorobotwórczymi.

Aby je wykonać, zaczynamy od kultury, która została utrzymana w laboratorium na pożywkach stałych, takich jak łemko, inokulat ślimakowy, pięć milili łemkowskich zawierających bulion z pętelką pełną prątków. Ponieważ wiele prątków to organizmy stosunkowo wolno rosnące, niezwykle ważne jest utrzymanie dobrej techniki aseptycznej, aby zapobiec zanieczyszczeniu tych kultur bakteriami lub grzybami, które mogą szybko przerosnąć prątki. Często rozsądnie jest ustawić zduplikowane kultury na wypadek, gdyby jedna z nich została skażona.

Komórki prątków mają tendencję do zlepiania się w kulturze ze względu na grubą woskową powłokę. Wirowanie i dodanie niejonowego detergentu, takiego jak pożywka tween 82, zmniejsza to zbrylanie i zapewnia bardziej jednorodną zawiesinę komórek. Po zaszczepieniu inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością stu obrotów na minutę przez noc.

Po wyrośnięciu kultury starterowej należy zaszczepić kulturę na dużą skalę około stu mililitrów łemkowskiej tw w kolbie stożkowej o sile 250 mil z rozcieńczeniem od 1 do 100 kultury na noc. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez około 16 do 24 godzin, w którym to czasie gęstość optyczną można sprawdzić za pomocą spektrofotometru. Jeśli odczytuje 0,8 do jednego, komórki są w optymalnej fazie wzrostu.

Następnie inkubuj komórki na lodzie przez 1,5 godziny przed zbiorem, co pomoże czterokrotnie zwiększyć wydajność transformacji. Dłuższy. Inkubacja na lodzie powoduje zmniejszenie wydajności. Następnie zbierz komórki, wlewając kultury do dużych probówek wirówkowych.

Wirować w temperaturze 300 g przez 10 minut po odwirowaniu, umyć komórki trzykrotnie na lodowatym chłodzie, 10% glicerolu za każdym razem zmniejszać objętość, tak aby na objętość kultury wynoszącą sto posiłków do pierwszego prania używa się 20 posiłków, następnie 10 milicali i na końcu 5 milicali do ostatniego prania. Po przemyciu resus zawiesić komórki w jednej do 10 do jednej do stu pierwotnej objętości lodu. 10% glicerolu na tym etapie komórki można podnieść, zamrozić i przechowywać w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Wydajność przemiany często wzrasta po zamrożeniu komórek. Przed użyciem tych kompetentnych komórek należy je rozmrozić, zebrać przez odwirowanie i ponownie zawiesić w świeżym, 10% glicerolu przed użyciem. Aby paradować z elektrotechnologią, ems mag an electro, czyli urządzenie, które może dostarczyć impuls o wysokim napięciu 2,5.

Używane są kilowolty. Bakterie i DNA umieszcza się w elektroporacji, kuwetach. I chociaż przerwa lub długość ścieżki mogą być takie same w różnych kuwetach, różnią się one pod względem objętości, którą mogą pomieścić.

Rutynowo używamy 200 mikrolitrów komórek w 0,2 centymetra qve do zjadania komórek. Najpierw przygotuj próbkę DNA w taki sposób, aby była wolna od soli i innych zanieczyszczeń. Jest to ważne, aby zminimalizować ryzyko wyładowań łukowych podczas elektroporacji.

Przed pobraniem bakterii upewnij się, że próbki DNA są wysokiej czystości. Dwa współczynniki chłonności 60 do dwóch 80 powinny być bliskie 1,8. Dodaj 0,5 do pięciu mikrogramów DNA bez soli w objętości nie większej niż pięć mikrolitrów do 200 mikrolitrów zawiesiny mikrobakteryjnej, można dołączyć kontrolną elektroporację bez DNA w celu sprawdzenia częstotliwości mutantów oporności na antybiotyki.

Następnie pozostaw mieszankę na lodzie na 10 minut. Zmniejszy to obecność żywych komórek w próbce i soli w roztworze DNA, co zminimalizuje wyładowania łukowe po inkubacji lodu, dokładnie rozprowadzi komórki za pomocą pipety lub wiru przed impulsem wysokiego napięcia w celu ponownego zawieszenia komórek i zapewnienia wymieszania DNA. Każde zlepianie się komórek doprowadzi do wyładowania łukowego i zmniejszy wydajność transformacji.

Następnie przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej elektrody o średnicy 0,2 centymetra gab qve. Ponownie uważaj, aby nie wprowadzić do mieszanki żadnych bąbelków. Również w celu zmniejszenia wyładowań łukowych.

Upewnij się, że zewnętrzna strona qve jest całkowicie sucha przed umieszczeniem jej w komorze pulsacyjnej. Po dokładnym wysuszeniu qve i przy rezystancji regulatora impulsów ustawionej na tysiąc omów, umieść qve w komorze elektroporacji. Następnie po ustawieniu napięcia na 2,5 kilowolta należy przyłożyć impuls, aż usłyszysz sygnał dźwiękowy, wskazujący, że kondensator w QVE się rozładował.

Stała czasowa większa niż 10 będzie wskazywać na udaną elektroporację. Nieudana elektroporacja jest zwykle sygnalizowana wyładowaniem łukowym, które powoduje iskrę, której często można uniknąć. Zmieniając opór na kontrolerze impulsów, umieść weterynarza Q z powrotem na lodzie na 10 minut.

Po inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej uniwersalnej butelki zawierającej pięć mililitrów łemkowskiego bulionu TW. Ważne jest, aby rozcieńczyć komórki co najmniej dziesięciokrotnie bezpośrednio po impulsie, aby pomóc komórkom w regeneracji i zwiększyć przeżywalność transformantów. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin, a następnie są gotowe do posiewu po inkubacji, zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 3000 G przez 10 minut.

Po odwirowaniu należy odpowiednio rozcieńczyć zawiesinę w bulionie łemkowskim, tak aby na każdą płytkę wpłynęło od 30 do 300 kolonii. Ważne jest, aby upewnić się, że odporne kolonie powstały z pojedynczej komórki, dlatego przed posiewem należy upewnić się, że komórki są dokładnie zawieszone. Jeśli komórki nie są rozcieńczone, może być bardzo trudno uwidocznić naprawdę odporne kolonie na tle Trawnik wrażliwych komórek teraz pokrywa komórki na łemkowskim świdrze odpowiednim antybiotykiem.

Wysiadują płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kolonie staną się widoczne. Zajmie to od trzech do pięciu dni po wzroście kolonii. Policz transformanty.

Obliczanie wydajności transformacji. Na efektywność transformacji wpływa kilka czynników. Należą do nich faza wzrostu komórek po pobraniu pożywki do elektroporacji oraz natężenie pola i stała czasowa dostarczonego impulsu.

Skuteczność techniki elektroporacji zależy również od wyboru DNA do transformacji, a niekiedy od wyboru markera do selekcji. Rutynowo uzyskujemy wydajność od 10 do piątej, od 10 do szóstej kolonii na mikrogram DNA, używając oporności na higromycynę lub streptomycynę w ems magma. Teraz, aby wyrosnąć z transformantów, wyrzuć elektroporowane prątki na stałe podłoże plus selekcja.

Antybiotyk inkubować w temperaturze 37 stopni przez dwa do trzech dni. Po dwu- lub trzydniowej inkubacji można analizować transformanty zgodnie z wymaganiami dla większości zastosowań, należy wyjąć i przeanalizować trzy transformanty. Ważne jest, aby sprawdzić tożsamość dodatkowego plazmidu chromosomowego po transformacji.

Ponieważ delecje i rearanżacje są powszechne, właśnie pokazałem ci, jak elektrolitować magmę prątków. Jeśli zamierzasz wykonać ten zabieg z drobnoustrojami chorobotwórczymi, pamiętaj o zastosowaniu odpowiednich środków bezpieczeństwa. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.