Name: Elektroporacja prątków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę elektroporacji prątków, która umożliwia skuteczną transformację DNA w komórkach Mycobacterium smegmatis. Protokół obejmuje przygotowanie kompetentnych komórek, parametry wysokiego napięcia oraz kluczowe czynniki wpływające na efektywność transformacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

elektroporacja mycobacterium

Electroporation of Mycobacteria

Wysoka wydajność transformacji stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad prątkami. Rodzaj Mycobacterium może być trudny do transformacji; wynika to głównie z obecności grubiej i woskowej ścian komórkowej, jednak sytuację pogarsza fakt, że większość technik molekularnych została opracowana dla gatunków dalekich krewniaczo, takich jak Escherichia coli i Bacillus subtilis. Pomimo tych przeszkód zidentyfikowano plazmidy prątkowe, a transformację DNA wielu gatunków Mycobacterium opisano już w literaturze. Najskuteczniejszą metodą wprowadzania DNA do prątków jest elektroporacja. Na sukces transformacji wpływa wiele parametrów, w tym gatunek/szczep, charakter transformowanego DNA, zastosowany marker selekcyjny, pożywka hodowlana oraz warunki impulsu elektroporacyjnego. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano zoptymalizowane metody transformacji zarówno dla prątków wolno- i szybko rosnących. Przedstawiono wydajność transformacji dla różnych gatunków Mycobacterium oraz przy użyciu różnych markerów selekcyjnych.

Strategie patogenności prątków są wciąż słabo poznane. Powolny tempo wzrostu większości gatunków, nieprzenikniona natura ściany komórkowej oraz zagrożenia związane z pracą z patogenami sprawiają, że prątki są trudne do badania, co w dużej mierze odpowiada za naszą ograniczoną wiedzę na temat tych organizmów. W tym filmie zaprezentujemy technikę elektroporacji, która polega na poddaniu komórek krótkiemu impulsowi o wysokim napięciu elektrycznym w celu umożliwienia wniknięcia DNA. Jest to najszerzej stosowana metoda wprowadzania DNA do komórek prątków.

Elektroporacja Mycobacterium

Wysoka wydajność transformacji stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad prątkami. Rodzaj Mycobacterium może być trudny do transformacji; wynika to głównie z...

Strategie patogenne prątków pozostają słabo poznane ze względu na powolny tempo wzrostu większości gatunków. Nieprzepuszczalna natura ściany komórkowej oraz zagrożenia związane z pracą z patogenami sprawiają, że prątki są trudne do badania, co w dużej mierze odpowiada za ograniczoną wiedzę na temat tych organizmów. W tym filmie zaprezentujemy technikę elektroporacji, która polega na poddaniu komórek krótkiemu i silnemu impulsowi elektrycznemu, co umożliwia wprowadzenie DNA.Jest to najpowszechniej stosowana metoda wprowadzania DNA do komórek prątków. Cześć, nazywam się Ron Good i pracuję w laboratorium Tanyi Parish w Centrum Chorób Zakaźnych przy Bats and the London School of Medicine and Dentistry. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę elektroporacji mikobakterii.W naszym laboratorium badamy *Mycobacterium tuberculosis*, jednak ze względu na jego wysoką patogenność oraz wymóg pracy w placówkach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL-3, zaprezentujemy tę technikę na niepatogenicznym szczepie *Mycobacterium smegmatis*. Przejdźmy zatem do elektroporacji bakterii. Aby przeprowadzić elektroporację prątków, musimy przygotować komórki kompetentne.Należy pamiętać, że prątnicze bakterie patogenne stanowią istotne zagrożenie biologiczne. W związku z tym wszystkie hodowle i manipulacje genetyczne muszą być przeprowadzane w odpowiednich warunkach izolacji, wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego klasy I. Ocena ryzyka powinna stanowić pierwszy etap każdego eksperymentu z prątnicami patogennymi.Aby je przygotować, zaczynamy od hodowli utrzymywanej w laboratorium na podłożach stałych, takich jak podłoże Lowesteina-Jensena; do 5 ml bulionu Lowesteina-Jensena zawierającego Tween wprowadzamy pętlą pełną prątek.Komórki prątków wykazują tendencję do skupiania się w kulturze ze względu na ich grubą woskową otoczkę. Wirowanie w wortexie oraz dodatek niejonowego detergentu, takiego jak Tween 80, ogranicza to zjawisko i pozwala na uzyskanie bardziej homogenicznej zawiesiny komórek. Po zaszczepieniu inkubuj kulturę w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu z prędkością 100 RPM przez noc.Po wyrośnięciu kultury starterowej, zaszczep kulturę w większej skali (około 100 ml pożywki LB w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml), stosując rozcieńczenie 1:100 kultury nocnej. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez około 16 do 24 godzin, po czym można sprawdzić gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru. Jeśli odczyt wynosi od 0,8 do 1, komórki znajdują się w optymalnej logarytmicznej fazie wzrostu.Następnie inkubować komórki na lodzie przez 1,5 godziny przed zbiorami, co pozwoli czterokrotnie zwiększyć wydajność transformacji. Dłuższa inkubacja na lodzie prowadzi do zmniejszenia wydajności. Następnie zebrać komórki, przelewając kultury do dużych probówek do wirowania.Wiruj z prędkością 300 Gs przez 10 minut; po wirowaniu przemyj komórki trzykrotnie w lodowatym, 10% glicerolu, redukując objętość przy każdym etapie w taki sposób, aby dla objętości hodowli wynoszącej 100 ml, do pierwszego przemycia użyto 20 ml, następnie 10 ml, a na koniec 5 ml do ostatniego przemycia. Po przemyciu ponownie zawieś komórki w objętości od 1/10 do 1/100 pierwotnej objętości lodowatego, 10% glicerolu. Na tym etapie komórki można podzielić na aalikwoty, zamrozić i przechowywać w temperaturze -70°C do późniejszego użycia.Wydajność transformacji często wzrasta po zamrożeniu komórek. Przed użyciem tych kompetentnych komórek należy je rozmrozić, zebrać poprzez wirowanie i resuspenderć w świeżym 10% glicerolu. W celu przeprowadzenia elektroporacji należy użyć elektroporatora, który jest urządzeniem zdolnym do dostarczenia impulsu wysokiego napięcia o wartości 2,5 kV.Stosuje się kilowolty. Bakterie i DNA umieszcza się w kuwetach do elektroporacji. Choć przerwa między elektrodami lub długość drogi może być taka sama w różnych kuwetach, różnią się one pod względem objętości, jaką mogą pomieścić.Rutynowo używamy 200 µL komórek w kubku o rozmiarze 0,2 cm, aby przeprowadzić elektroporację komórek. Najpierw należy przygotować próbkę DNA w taki sposób, aby była wolna od soli i innych zanieczyszczeń. Jest to istotne, aby zminimalizować ryzyko powstania łuku elektrycznego podczas elektroporacji.Przed przystąpieniem do porowania bakterii należy upewnić się, że próbki DNA charakteryzują się wysoką czystością. Stosunek absorbancji 260 do 280 powinien wynosić około 1,8. Do 200 µl zawiesiny bakterii należy dodać od 0,5 do 5 µg wolnego od soli DNA w objętości nieprzekraczającej 5 µl. Można przeprowadzić kontrolną elektroporację bez dodatku DNA w celu sprawdzenia częstotliwości występowania mutantów opornych na antybiotyki.Następnie pozostaw mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Zmniejszy to obecność żywych komórek w próbce oraz soli w roztworze DNA, co zminimalizuje powstawanie łuków elektrycznych po inkubacji w lodzie. Przed impulsem wysokiego napięcia dokładnie rozdystrybuuj komórki za pomocą pipety lub wortexa, aby je resuspendować i zapewnić wymieszanie z DNA. Wszelkie skupiska komórek doprowadzą do powstania łuków elektrycznych i obniżą wydajność transformacji.Następnie przenieś mieszaninę do schłodzonej wcześniej komory elektrody o przerwie 0,2 centymetra. Ponownie należy uważać, aby nie wprowadzić do mieszaniny żadnych pęcherzyków powietrza, co pozwoli również ograniczyć przeskoki iskier.Przed umieszczeniem qve w komorze impulsowej należy upewnić się, że jego zewnętrzna powierzchnia jest całkowicie sucha. Po dokładnym osuszeniu qve i ustawieniu rezystancji kontrolera impulsów na tysiąc omów, należy umieścić qve w komorze do elektroporacji. Następnie, po ustawieniu napięcia na 2,5 kilowolta, należy przyłożyć impuls do momentu usłyszenia sygnału dźwiękowego, który oznacza rozładowanie kondensatora w QVE.Stała czasowa większa niż 10 będzie wskazywać na udaną elektroporację. Nieudaną elektroporację zazwyczaj sygnalizuje łuk elektryczny, który powoduje iskrzenie; można go często uniknąć. Po zmianie rezystancji w sterowniku impulsów, umieść Q vet ponownie w lodzie na 10 minut.Po inkubacji przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej butelki uniwersalnej zawierającej 5 ml pożywki lemko TW. Ważne jest, aby rozcieńczyć komórki co najmniej dziesięciokrotnie bezpośrednio po impulsie, co wspomaga regenerację komórek i zwiększa przeżywalność transformantów. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez dwie do trzech godzin; po tym czasie będą one gotowe do wysiewania. Po inkubacji odwirowuj komórki w wirowarce z prędkością 3000 ×g przez 10 minut.Po wirowaniu przygotuj odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny w bulionie LB w taki sposób, aby na każdej płytce pojawiło się od 30 do 300 kolonii. Ważne jest, aby upewnić się, że kolonie oporne powstały z pojedynczej komórki, dlatego przed wysiewaniem należy dokładnie resuspenderować komórki. Jeśli komórki nie zostaną rozcieńczone, wizualizacja prawdziwie opornych kolonii na tle gęstego wzrostu komórek wrażliwych może być bardzo trudna; następnie wysejew komórki na agar LB z odpowiednim antybiotykiem.Płytki inkubuje się w temperaturze 37 °C aż do pojawienia się widocznych kolonii. Proces ten potrwa od trzech do pięciu dni od momentu wzrostu kolonii. Następnie należy policzyć transformanty.W celu obliczenia wydajności transformacji. Na wydajność transformacji wpływa kilka czynników. Należą do nich faza wzrostu komórek w momencie zbioru, pożywka do elektroporacji oraz natężenie pola i stała czasowa przyłożonego impulsu.Wydajność techniki elektroporacji zależy również od wyboru DNA do transformacji, a niekiedy od wyboru markera selekcyjnego. Rutynowo uzyskujemy wydajność od 10⁵ do 10⁶ kolonii na µg DNA, wykorzystując oporność na hygromycynę lub streptomycynę w ems magma. Aby wyhodować transformanty, należy wysiać elektroporowane prątki na podłoże stałe z dodatkiem czynnika selekcyjnego.Inkubować antybiotyk w temperaturze 37°C przez dwa do trzech dni. Po inkubacji trwającej od dwóch do trzech dni można przeanalizować transformanty zgodnie z wymaganiami dla większości zastosowań; należy wyizolować i przeanalizować trzy transformanty. Ważne jest sprawdzenie tożsamości pozachromosomalnego plazmidu po transformacji.Ponieważ delecje i rearanżacje występują często, właśnie pokazałem Państwu, jak przeprowadzić elektroporację mycobacterium s magma. Jeśli zamierzają Państwo wykonywać tę procedurę z patogennymi mikrobakteriami, należy pamiętać o zastosowaniu odpowiednich środków bezpieczeństwa. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroporacja prątków

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Elektroporacja plazmidowego DNA w mięśniach szkieletowych jest realną metodą modulowania ekspresji genów bez naruszania kurczliwości mięśni u myszy.

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Protokół ten opisuje metodę CTAB polegającą na wydobyciu wysokiej jakości DNA z mykobakterii, pokonując wyzwania związane z ich twardymi, bogatymi w kwas grzybniczy ściany komórkowe. Proces obejmuje trawienie enzymatyczne, lizę komórek za pomocą CTAB oraz oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję organiczną i wytrącanie etanolem. Ta metoda wytwarza DNA odpowiednie do badań molekularnych i jest wiarygodna w badaniach mykobakterialnych.

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj zoptymalizowaną metodę elektroporacji prątków, która umożliwia skuteczną transformację DNA w komórkach Mycobacterium smegmatis. Protokół obejmuje przygotowanie kompetentnych komórek, parametry wysokiego napięcia oraz kluczowe czynniki wpływające na efektywność transformacji.

Elektroporacja Mycobacterium

Przeglądaj więcej filmów