Hodowle mysich macierzystych komórek grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC)

Witajcie, nazywam się Maya Sibu Bloom i reprezentuję Instytut Genetyki Ludzkiej oraz Northeast England Stem Cell Institute na Uniwersytecie w Newcastle. Towarzyszy mi przedstawiciel Medical College of Wisconsin. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę przygotowania eksplantów z mieszków włosowych myszy.

Wibrisy stanowią tkankę wyjściową do przygotowania kultur macierzystych komórek grzebienia neuronalnego naskórka. Procedura ta obejmuje wycięcie poduszeczki wibrysów i mikrodissekcję mieszków włosowych, a następnie wyizolowanie BUL i umieszczenie ich na płytce hodowlanej. Przejdźmy zatem do realizacji.

Procedura ta rozpoczyna się od wypreparowania wybrzuszenia (bulge) z mieszków włosowych wibrysów dorosłych myszy. Zazwyczaj używamy myszy w wieku od dwóch do sześciu miesięcy, jednak młodsze zwierzęta mają tendencję do dostarczania większej liczby komórek macierzystych. Zwierzęta są poddawane eutanazji i całkowicie zanurzane w mieszaninie Betadinu i nadtlenku wodoru w stosunku jeden do jednego przez około trzy minuty w celu dezynfekcji, a następnie całe ciało myszy, zwłaszcza obszar twarzy, jest spryskiwane 75% etanolem i przenoszone pod mikroskop stereoskopowy.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza ostrożnie wypreparuj poduszeczki WHI, unikając przecięcia opuszek włosa, a następnie umieść je w zbalansowanym roztworze soli w temperaturze pokojowej. Aby wypreparować mieszki WHI, utrzymaj skórę obok mieszka pęsetą, a następnie przetnij obszar wokół mieszka prostymi nożyczkami. Wykonaj głębokie cięcie.

Aby uniknąć uszkodzenia cebulek włosa, należy podnieść mieszek wibrysy z poduszeczki wibrysowej i przenieść go na nową płytkę. Za pomocą świeżego roztworu HBSS należy zgrupować mieszki na tej samej płytce. Następnie, używając zaostrzonych pęset i igieł, należy przypiąć mieszek włosa do szklanej szalki Petriego pokrytej jedwabną osłoną i zawierającej HBSS.

Przepłucz luźną tkankę tłuszczową i tkankę skórną strumieniami buforu, aż mieszek wibrysy będzie czysty. W razie potrzeby przetnij nerw prowadzący do mieszka wibrysy i usuń przylegającą tkankę poprzez skrobanie oraz wielokrotne płukanie w HBSS. Przetnij mieszek wibrysy wzdłuż za pomocą mikroskalpela.

Należy unikać zbyt głębokiego nacięcia, aby nie uszkodzić wybrzuszenia. Krew należy usunąć, wielokrotnie płukając miejsce nacięcia roztworem HBSS, aż do całkowitego jej usunięcia. Pojawienie się krwi jest dobrym wskaźnikiem, że nacięcie było wystarczająco głębokie.

Następnie wykonaj cięcie poprzeczne powyżej poziomu zatoki koness, a następnie drugie cięcie poprzeczne na poziomie zatoki pierścieniowej, bardzo blisko skóry w obrębie wyizolowanego fragmentu mieszkowe. Teraz będzie widoczne uwypuklenie wewnątrz torebki. Proszę spojrzeć, oto ono.

Chwyć koniec kapsułki pęsetą i usuń wybrzuszenie. Obecnie widoczna będzie pusta kapsułka oraz wyizolowany zespół wybrzuszeń. Wyizolowane wybrzuszenia umieść w oddzielnej płytce hodowlanej w roztworze HBSS w temperaturze pokojowej.

Należy upewnić się, że żadna inna tkanka nie zanieczyszcza połączonych wypustek. Na tym etapie rośliny z wypustek mogą być hodowane przed przeniesieniem do hodowli roślin z wypustek. Płytki hodowlane o średnicy 35 mm są powlekane kolagenem poprzez naniesienie kropli 50 µL kolagenu i 10 µL roztworu sterylnego.

6% soli fizjologicznej obok siebie. Dobrze wymieszać za pomocą podwójnie zgiętej pipety Pasteura i przesunąć w stronę krawędzi płytki hodowlanej; inkubować przez noc w czystym środowisku, nie dopuszczając do wyschnięcia. W tym celu stosujemy eksykator z naczyniem z wodą na dnie.

Następnego dnia, w dniu hodowli. Przepłukać płytki solą fizjologiczną i inkubować wstępnie przez około trzy godziny płytki hodowlane pokryte kolagenem i przepłukane, w pożywce hodowlanej w inkubatorze. Pożywka hodowlana składa się z 85% alpha modified MEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 5% ekstraktu z embrionu kurczaka w 11. dniu.

Po wstępnej inkubacji usunąć pożywkę z płytek i dodać kilka BUL w jak najmniejszej ilości pożywki. Usunąć nadmiar pożywki. Inkubować przez jedną godzinę w inkubatorze komórkowym w nawilżonej atmosferze z 10% oxygen i 5% CO2.

Po jednej godzinie powoli dodaj 1,5 ml pożywki. Rośliny CHE powinny przylegać do podłoża kolagenowego; codziennie wymieniaj 50% pożywki hodowlanej. Dobrze, teraz zaczynajmy.

A teraz spójrzmy na hodowle. W ciągu trzech do czterech dni z kulek sprawdzeni zostaną wyemigrowane wysoko migracyjne komórki. Proszę zauważyć ich gwiaździstą morfologię oraz przeważający brak kontaktów międzykomórkowych.

W ciągu następnych kilku dni więcej komórek wyemigruje, a komórki, które już to zrobiły, będą gwałtownie proliferować. Ważne, rzadkie komórki o spłaszczonej morfologii stają się widoczne niekiedy kilka dni później niż grzebieniowe komórki neuroepidermalne. W tych kulturach czasami obserwuje się komórki macierzyste. Nie są to jednak neuroepidermalne komórki macierzyste grzebienia, lecz mniej mobilne, domniemane komórki macierzyste naskórka lub ich progenitory; kultury składające się z takich komórek powinny zostać odrzucone.

Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować kultury eksplantów wybrzuszenia (bulge), które zawierają epidermalne macierzyste komórki neurogenne. Ponieważ komórki te wykazują dużą zdolność do migracji, opuszczą one eksplant wybrzuszenia w ciągu trzech do czterech dni. Po eksplantacji wybrzuszenie zostaje usunięte, a w płytce hodowlanej pozostaje czysta populacja komórek neurogennych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o dokładnej dezynfekcji myszy w celu uniknięcia kontaminacji. Należy również głęboko naciąć poduszkę, aby nie uszkodzić mieszków włosowych. W odniesieniu do hodowli istotne jest rozróżnienie między migrującym destylatem, komórkami grzebienia neuronalnego a niemigrującymi keratynocytami o kształcie brukowym.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.