Name: Ewolucja molekularna rekombinazy tre (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj ewolucję molekularną rekombinazy Tre, zaprojektowanej do usuwania prowirusa HIV-1 z zainfekowanych komórek ludzkich. Ta metoda pokazuje potencjał terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

ewolucja molekularna rekombinazy tre

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

W niniejszej pracy opisujemy stworzenie rekombinazy Tre poprzez ukierunkowaną ewolucję molekularną. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i eliminacji prowirusa z zakażonych ludzkich komórek.
Prace rozpoczęliśmy od Cre, rekombinazy o masie 38 kDa, która rozpoznaje 34-bp dwuniciową sekwencję DNA znaną jako loxP. Ponieważ Cre potrafi skutecznie eliminować sekwencje genomiczne, postawiliśmy sobie za cel stworzenie rekombinazy zdolnej do usunięcia sekwencji znajdującej się pomiędzy 5'-LTR a 3'-LTR zintegrowanego prowirusa HIV-1. W pierwszym kroku zidentyfikowaliśmy w obrębie miejsc LTR sekwencje podobne do loxP i przetestowaliśmy ich aktywność rekombinacyjną. Początkowo Cre oraz biblioteki zmutowanej Cre nie wykazały zdolności do rekombinacji wybranych miejsc loxLTR prowirusa HIV-1. Ponieważ rozpoczęcie każdego procesu ukierunkowanej ewolucji molekularnej wymaga przynajmniej śladowej aktywności, oryginalne asymetryczne sekwencje loxLTR podzielono na podzbiory i ponownie przetestowano pod kątem aktywności rekombinacyjnej. Wykazano aktywność rekombinacyjną dla tych podzbiorów, które posłużyły jako etapy pośrednie. Następnie biblioteki rekombinaz wzbogacono poprzez iteracyjne cykle ewolucji. W dalszej kolejności wzbogacone biblioteki poddano tasowaniu i rekombinacji. Połączenie różnych mutacji okazało się synergistyczne, co pozwoliło na stworzenie rekombinaz zdolnych do rekombinacji loxLTR1 i loxLTR2. Stanowiło to dowód na to, że strategia ewolucyjna wykorzystująca etapy pośrednie może być skuteczna. Po łącznie 126 cyklach ewolucji poszczególne rekombinazy poddano analizom funkcjonalnym i strukturalnym. Najaktywniejsza rekombinaza – Tre – wykazywała 19 zmian aminokwasowych w porównaniu z Cre. Rekombinaza Tre była w stanie wyciąć prowirusa HIV-1 z genomu komórek HeLa zainfekowanych HIV-1 (patrz: „HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase”, Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Niemcy). Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie enzymów projektowanych na zamówienie, które posłużą jako narzędzia „chirurgii molekularnej” i medycyny molekularnej.

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i medycyny molekularnej.

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Niniejszym raportujemy otrzymanie rekombinazy Tre poprzez ukierunkowaną ewolucję molekularną. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie...

Nazywam się Frank Alz. Jestem liderem grupy w Instytucie Maxx Plunk w zakresie Biologii Komórek Plamki i Genetyki w Dreźnie. Omówię teraz nasze prace nad opracowaniem rekombinaz specyficznych dla miejsca w celu przeprowadzenia chirurgii molekularnej.W zasadzie jako narzędzie umożliwiające wycinanie sekwencji, zdefiniowanych wcześniej sekwencji z genomu, a konkretnie w celu próby wyeliminowania komórek zakażonych HIV z wirusa. Zatem w zasadzie, aby wyciąć prowirusa HIV z genomu zakażonych komórek. Innym założeniem jest to, że adaptujemy już dobrze znane narzędzie genetyczne, a mianowicie rekombinazę Cre, aby wiązała i rozpoznawała, oraz wykorzystywała miejsce docelowe, które definiujemy wcześniej.Postanowiliśmy zatem sprawdzić, czy jesteśmy w stanie stworzyć rekombinazę specyficzną dla miejsca, która wiąże się z sekwencją naturalnie występującą w LTR wirusa HIV. Przewidywaliśmy, że jeśli uda nam się to osiągnąć, możliwe powinno być wycięcie prowirusa z genomu. W dużym uproszczeniu cykl życiowy wirusa przechodzi przez etap, w którym wirus integruje się z komórkami, a następnie poprzez odwrotną transkrypcję tworzy matrycę DNA, która jest flankowana przez dwie powtórki końcowe.Nazywa s

molecular-evolution-of-the-tre-recombinase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ewolucja molekularna rekombinazy tre

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji.  Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Białko nukleoidowe mitochondrialne drożdży, Mgm101, jest białkiem rekombinacyjnym typu Rad52, które tworzy duże pierścienie oligomeryczne. Opisano protokół przygotowania rozpuszczalnego rekombinowanego Mgm101 przy użyciu strategii znakowania białka wiążącego maltozę (MBP) w połączeniu z chromatografią wymiany kationów i wykluczania wielkości.

Przygotowanie białka rekombinacji Mgm101 za pomocą strategii znakowania opartej na MBP

Tutaj opisujemy metodę jednoczesnej kwantyfikacji okręgów wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji deklacyjnej K (KRECs). Test TREC/KREC może być stosowany jako marker wydalania grasicy i szpiku kostnego.

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Wprowadzenie technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) oraz systemu Cre/lox doprowadziło do licznych osiągnięć w biologii molekularnej i okazało się cennym narzędziem do oceny funkcji genów u zwierząt transgenicznych. W niniejszym wywiadzie omówiono mechanizm rekombinacji specyficznej dla miejsca za pomocą rekombinazy cyklizacyjnej (Cre) oraz sposób, w jaki zastosowanie tego enzymu doprowadziło do opracowania mutagenezy warunkowej, która wykazuje znaczące zalety w porównaniu z...

Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

Prezentujemy metody oceny, jak ryzyko drapieżnictwa może zmienić jakość chemiczną ofiar roślinożerców, wywołując zmiany w diecie, aby sprostać wymaganiom zwiększonego stresu, oraz jak rozkład zwłok tych zestresowanych roślinożerców spowalnia późniejszy rozkład ściółki roślinnej przez mikroby glebowe.

Powiązanie ryzyka drapieżnictwa, stresu fizjologicznego roślinożerców i mikrobiologicznego rozkładu ściółki roślinnej

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Wrotki to mikroskopijny zooplankton używany jako modele w badaniach ekotoksykologicznych i starzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół do skutecznego i powtarzalnego pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus. Synchronizacja warunków hodowli na przestrzeni kilku pokoleń ma szczególne znaczenie, ponieważ stan matki wpływa na historię życia potomstwa.

Pomiar czasu przeżycia u wrotków Brachionus: synchronizacja warunków matczynych

Poznaj ewolucję molekularną rekombinazy Tre, zaprojektowanej do usuwania prowirusa HIV-1 z zainfekowanych komórek ludzkich. Ta metoda pokazuje potencjał terapii genowej.

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Przeglądaj więcej filmów