Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Nazywam się Frank Alz. Jestem liderem grupy w Instytucie Maxx Plunk w zakresie Biologii Komórek Plamki i Genetyki w Dreźnie. Omówię teraz nasze prace nad opracowaniem rekombinaz specyficznych dla miejsca w celu przeprowadzenia chirurgii molekularnej.

W zasadzie jako narzędzie umożliwiające wycinanie sekwencji, zdefiniowanych wcześniej sekwencji z genomu, a konkretnie w celu próby wyeliminowania komórek zakażonych HIV z wirusa. Zatem w zasadzie, aby wyciąć prowirusa HIV z genomu zakażonych komórek. Innym założeniem jest to, że adaptujemy już dobrze znane narzędzie genetyczne, a mianowicie rekombinazę Cre, aby wiązała i rozpoznawała, oraz wykorzystywała miejsce docelowe, które definiujemy wcześniej.

Postanowiliśmy zatem sprawdzić, czy jesteśmy w stanie stworzyć rekombinazę specyficzną dla miejsca, która wiąże się z sekwencją naturalnie występującą w LTR wirusa HIV. Przewidywaliśmy, że jeśli uda nam się to osiągnąć, możliwe powinno być wycięcie prowirusa z genomu. W dużym uproszczeniu cykl życiowy wirusa przechodzi przez etap, w którym wirus integruje się z komórkami, a następnie poprzez odwrotną transkrypcję tworzy matrycę DNA, która jest flankowana przez dwie powtórki końcowe.

Nazywa się je długimi powtórzeniami końcowymi lub w skrócie LTR. Następnie są one przenoszone do jądra komórkowego i integrują się mniej lub bardziej losowo z genomem gospodarza. W tej sytuacji powstaje tak zwany prowirus, który jest zintegrowany i flankowany przez dwa długie powtórzenia końcowe, czyli dwie sekwencje LTR.

Koncepcja polegała na tym, że gdybyśmy byli w stanie stworzyć rekombinazę rozpoznającą sekwencję istniejącą w LTR, moglibyśmy wyciąć prowirusa z genomu gospodarza w formie kolistej i w ten sposób wyeliminować wirusa z komórek. Taka była idea koncepcyjna. Rekombinaza jest w rzeczywistości białkiem wiążącym DNA, które odnajduje bardzo specyficzne miejsce.

Posiada on domenę wiążącą DNA, która rozpoznaje określoną sekwencję w obrębie DNA. Enzym staje się aktywny dopiero w momencie znalezienia tej dokładnej sekwencji. Nie wykazuje on aktywności w odniesieniu do żadnych innych sekwencji.

Zasady ewolucji molekularnej są w zasadzie znane każdemu, ponieważ nie są one czymś innym niż hodowlą. Zasadą ewolucji molekularnej jest wprowadzanie mutacji, a następnie przeprowadzenie procesu selekcji w celu wyłonienia określonej cechy. Jest to analogiczne do prowadzenia hodowli roślin.

Wiedzą Państwo, że chcą uzyskać konkretny rozmiar lub konkretny kolor, a następnie zawsze wybierają potomstwo następnego pokolenia posiadające określone cechy i zaczynają je ze sobą krzyżować. Dokładnie to samo robimy w przypadku cząsteczek. Zasadniczo jest to to samo, tyle że w małej skali.

Zaczynamy od enzymu o określonej aktywności – w naszym przypadku jest to rekombinaza CRE – oraz białka typu dzikiego. Następnie wprowadzamy niewielką mutację w miejscu wiązania tej rekombinazy, co skutkuje bardzo niską aktywnością. W kolejnym kroku wprowadzamy losowe mutacje do enzymu, czyli do rekombinazy, a następnie wyselekcjonowane zostają mutanty, które są teraz w stanie wiązać to zmutowane miejsce.

Gdy już to osiągniemy, możemy następnie połączyć różne mutanty, aby w końcu otrzymać końcowy produkt, w którym rekombinaza rozpoznaje sekwencję zdefiniowaną w LTR. Zaczynamy zatem, jak wspomniałem, od losowej biblioteki mutagennej. Jest to zazwyczaj realizowane za pomocą PCR podatnej na błędy.

Stosujemy zatem warunki PCR, w których na przykład polimeraza Taq popełnia wiele błędów. W ten sposób generujemy losową bibliotekę zawierającą mutacje w różnych miejscach. Możemy również wykorzystać szczep mutatorowy, czyli bakteryjny szczep mutatorowy, który wprowadza liczne mutacje w określonych transkrypcjach.

Następnie są one wykorzystywane jako materiał wyjściowy. Inną stosowaną przez nas technologią jest shuffle DNA (przetasowanie DNA), do której przechodzimy po pewnym czasie. Jest to w zasadzie technologia pozwalająca na łączenie różnych korzystnych mutacji, ponieważ nie wiadomo dokładnie, która z mutacji jest korzystna, ale dysponuje się różnymi mutantami o różnych mutacjach.

W takim przypadku mamy jeden gen z korzystną mutacją w tym miejscu oraz drugi klon z mutacją w innym miejscu. Aby połączyć te dwie zmiany, przeprowadza się losową fragmentację poszczególnych fragmentów, a następnie łączy się je w reakcji PCR w celu ponownego zmontowania produktów. Dzięki temu, z określoną częstotliwością, powstanie kombinacja obu mutacji, w której część rekombinanta pochodzi z pierwszego mutanta, a część z drugiego.

Następnie ten element wywrze dodatkowy efekt, który usprawni proces i pozwoli znacznie szybciej wyselekcjonować kandydatów o pożądanych właściwościach. Zdefiniowałbym to w taki sposób, że białko typu dzikiego nie wykazuje absolutnie żadnej aktywności w określonym miejscu. Jeśli weźmiemy na przykład naszą sekwencję wybraną z LTR wirusa HIV, to przy zastosowaniu rekombinazy cre w obrębie tej sekwencji nie zaobserwujemy żadnej aktywności.

Rekombinaza CRE nie jest w stanie rekombinować tego miejsca i w mojej opinii mamy do czynienia z nową rekombinazą w momencie, gdy otrzymujemy enzym zdolny do wiązania i rekombinowania tej sekwencji. Nie określiliśmy z góry liczby cykli, które mieliśmy przeprowadzić, lecz wykonywaliśmy ich tyle, ile było konieczne, aż do uzyskania enzymu o pożądanej aktywności. Zaczęliśmy od bardzo niewielkich mutacji w obrębie miejsca wiązania, a następnie zaczęliśmy łączyć różne mutacje ze sobą.

Był to jeden z kluczowych etapów sprawiających, że proces ten działał. Przechodziliśmy przez produkty pośrednie i musieliśmy zrealizować wiele takich cykli, aby znaleźć enzym o aktywności wystarczającej do przejścia do kolejnego etapu. Jest to bardzo podobne do każdego procesu hodowlanego.

Określają Państwo pożądany poziom aktywności oraz konkretną cechę, a następnie rozpoczynają proces hodowli. Do momentu uzyskania oczekiwanego efektu proces nie jest zakończony i należy przeprowadzić kolejne generacje. W uproszczeniu tak właśnie to wygląda.

Należy również wspomnieć, że 120 cykli ewolucji, a dokładniej sto dwadzieścia osiem sześć, służyło jedynie znalezieniu etapu pośredniego, w którym stwierdziliśmy, że możemy przestać, ponieważ pojawiła się pewna aktywność. Rekombinacja, którą uzyskaliśmy, jest wciąż mniej aktywna niż rekombinaza CRE w wersji typu dzikiego. Aby uzyskać bardziej aktywną rekombinazę, musielibyśmy przeprowadzić więcej cykli ewolucji.

Zatem w zasadzie nie kończy się to na etapie, na którym obecnie jesteśmy w procesie ewolucji. Nie widzę żadnych ograniczeń technicznych. Kwestią sporną pozostaje to, jak daleko można to pchnąć.

Zatem w przypadku strony LTR, sekwencja znajdująca się w LTR HA wykazuje 50% podobieństwa sekwencji do naturalnej strony LoxP, czyli strony naturalnej rozpoznawanej przez rekombinazę Cre. Pytanie brzmi, czy można pójść jeszcze dalej – nie wiemy tego jeszcze, ale fakt, że przy zaledwie 50% podobieństwa sekwencji do sekwencji typu dzikiego system ten działa, sugeruje, że można to dalej modyfikować. Rekombinaza działa dobrze w hodowlach komórek ludzkich, mimo że, jak wspomniałem, nie jest tak aktywna, jak rekombinaza Cre na swojej natywnej sekwencji.

Zatem prawdopodobnie stabilność jest nieco mniejsza niż w przypadku analizowanej rekombinazy, dzikiego typu enzymu, i konieczne byłoby przeprowadzenie szerszej selekcji oraz większej liczby cykli ewolucji, aby w przyszłości usprawnić te cechy. Pierwszym krokiem jest zatem udoskonalenie miejsca, tej konkretnej rekombinazy, rekombinazy 3, aby uczynić ją bardziej aktywną, a być może zidentyfikować inne, bardzo wyraźne miejsca, które stanowiłyby dobre cele w LTR, i znaleźć dla nich odpowiednią rekombinazę. Następnie musielibyśmy przetestować tę rekombinazę w różnych testach, najpierw ponownie w kulturach komórkowych, a następnie – co jest bardzo istotne – przetestować tę rekombinazę w modelach zwierzęcych.

Zatem musielibyśmy sprawdzić, czy rekombinaza ta wywołuje jakiekolwiek niepożądane skutki uboczne w organizmie. Następnie, bardzo trudnym aspektem jest opracowanie skutecznego systemu dostarczania tej rekombinazy, co nie jest trywialne. Opracowanie takiego systemu stanowi w sobie cały, odrębny obszar badań.

Było to w zasadzie podejście z zakresu terapii genowej, które musielibyśmy zastosować. Myślę, że obserwujemy przesunięcie w medycynie w stronę coraz bardziej molekularną. I do tego oczywiście potrzebujemy narzędzi, które pozwolą nam pracować w takiej skali.

I właśnie tutaj widzę przyszłość procesu ewolucji. Musimy tworzyć enzymy dostosowane do konkretnych potrzeb, które będą działać w procesach, których chcielibyśmy używać; w przypadku rekombinazy można to porównać do narzędzia dla chirurga, który podczas operacji musi wyciąć konkretny fragment tkanek. Obecnie potrzebujemy narzędzi, dzięki którym „molekularny chirurg” mógłby precyzyjnie wyciąć określony fragment DNA z genomu.

Aby to osiągnąć, potrzebuje on odpowiednich narzędzi. Tę funkcję może w zasadzie spełnić ewolucja molekularna. W naturze występuje wiele enzymów, które posiadają właściwości bardzo pożądane do realizacji tego celu.

Musimy jedynie dostosować je do naszych potrzeb, aby mogły stać się użyteczne. Myślę, że ewolucja molekularna może odgrywać tutaj bardzo ważną rolę. Trudno jest w tej chwili określić, gdzie leżą ograniczenia, ponieważ ta dziedzina technologii jest wciąż w powijakach.

Czas pokaże zatem, gdzie leżą ograniczenia. Jestem pewien, że pewne będą istnieć, ale w tej chwili uważam, że możliwości przeważają nad ograniczeniami.