Name: Ewolucja molekularna rekombinazy tre (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj ewolucję molekularną rekombinazy Tre, zaprojektowanej do usuwania prowirusa HIV-1 z zainfekowanych komórek ludzkich. Ta metoda pokazuje potencjał terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

ewolucja molekularna rekombinazy tre

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

W niniejszej pracy opisujemy stworzenie rekombinazy Tre poprzez ukierunkowaną ewolucję molekularną. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i eliminacji prowirusa z zakażonych ludzkich komórek.
Prace rozpoczęliśmy od Cre, rekombinazy o masie 38 kDa, która rozpoznaje 34-bp dwuniciową sekwencję DNA znaną jako loxP. Ponieważ Cre potrafi skutecznie eliminować sekwencje genomiczne, postawiliśmy sobie za cel stworzenie rekombinazy zdolnej do usunięcia sekwencji znajdującej się pomiędzy 5'-LTR a 3'-LTR zintegrowanego prowirusa HIV-1. W pierwszym kroku zidentyfikowaliśmy w obrębie miejsc LTR sekwencje podobne do loxP i przetestowaliśmy ich aktywność rekombinacyjną. Początkowo Cre oraz biblioteki zmutowanej Cre nie wykazały zdolności do rekombinacji wybranych miejsc loxLTR prowirusa HIV-1. Ponieważ rozpoczęcie każdego procesu ukierunkowanej ewolucji molekularnej wymaga przynajmniej śladowej aktywności, oryginalne asymetryczne sekwencje loxLTR podzielono na podzbiory i ponownie przetestowano pod kątem aktywności rekombinacyjnej. Wykazano aktywność rekombinacyjną dla tych podzbiorów, które posłużyły jako etapy pośrednie. Następnie biblioteki rekombinaz wzbogacono poprzez iteracyjne cykle ewolucji. W dalszej kolejności wzbogacone biblioteki poddano tasowaniu i rekombinacji. Połączenie różnych mutacji okazało się synergistyczne, co pozwoliło na stworzenie rekombinaz zdolnych do rekombinacji loxLTR1 i loxLTR2. Stanowiło to dowód na to, że strategia ewolucyjna wykorzystująca etapy pośrednie może być skuteczna. Po łącznie 126 cyklach ewolucji poszczególne rekombinazy poddano analizom funkcjonalnym i strukturalnym. Najaktywniejsza rekombinaza – Tre – wykazywała 19 zmian aminokwasowych w porównaniu z Cre. Rekombinaza Tre była w stanie wyciąć prowirusa HIV-1 z genomu komórek HeLa zainfekowanych HIV-1 (patrz: „HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase”, Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Niemcy). Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie enzymów projektowanych na zamówienie, które posłużą jako narzędzia „chirurgii molekularnej” i medycyny molekularnej.

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i medycyny molekularnej.

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Niniejszym raportujemy otrzymanie rekombinazy Tre poprzez ukierunkowaną ewolucję molekularną. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie...

Nazywam się Frank Alz. Jestem liderem grupy w Instytucie Maxx Plunk w zakresie Biologii Komórek Plamki i Genetyki w Dreźnie. Omówię teraz nasze prace nad opracowaniem rekombinaz specyficznych dla miejsca w celu przeprowadzenia chirurgii molekularnej.W zasadzie jako narzędzie umożliwiające wycinanie sekwencji, zdefiniowanych wcześniej sekwencji z genomu, a konkretnie w celu próby wyeliminowania komórek zakażonych HIV z wirusa. Zatem w zasadzie, aby wyciąć prowirusa HIV z genomu zakażonych komórek. Innym założeniem jest to, że adaptujemy już dobrze znane narzędzie genetyczne, a mianowicie rekombinazę Cre, aby wiązała i rozpoznawała, oraz wykorzystywała miejsce docelowe, które definiujemy wcześniej.Postanowiliśmy zatem sprawdzić, czy jesteśmy w stanie stworzyć rekombinazę specyficzną dla miejsca, która wiąże się z sekwencją naturalnie występującą w LTR wirusa HIV. Przewidywaliśmy, że jeśli uda nam się to osiągnąć, możliwe powinno być wycięcie prowirusa z genomu. W dużym uproszczeniu cykl życiowy wirusa przechodzi przez etap, w którym wirus integruje się z komórkami, a następnie poprzez odwrotną transkrypcję tworzy matrycę DNA, która jest flankowana przez dwie powtórki końcowe.Nazywa się je długimi powtórzeniami końcowymi lub w skrócie LTR. Następnie są one przenoszone do jądra komórkowego i integrują się mniej lub bardziej losowo z genomem gospodarza. W tej sytuacji powstaje tak zwany prowirus, który jest zintegrowany i flankowany przez dwa długie powtórzenia końcowe, czyli dwie sekwencje LTR.Koncepcja polegała na tym, że gdybyśmy byli w stanie stworzyć rekombinazę rozpoznającą sekwencję istniejącą w LTR, moglibyśmy wyciąć prowirusa z genomu gospodarza w formie kolistej i w ten sposób wyeliminować wirusa z komórek. Taka była idea koncepcyjna. Rekombinaza jest w rzeczywistości białkiem wiążącym DNA, które odnajduje bardzo specyficzne miejsce.Posiada on domenę wiążącą DNA, która rozpoznaje określoną sekwencję w obrębie DNA. Enzym staje się aktywny dopiero w momencie znalezienia tej dokładnej sekwencji. Nie wykazuje on aktywności w odniesieniu do żadnych innych sekwencji.Zasady ewolucji molekularnej są w zasadzie znane każdemu, ponieważ nie są one czymś innym niż hodowlą. Zasadą ewolucji molekularnej jest wprowadzanie mutacji, a następnie przeprowadzenie procesu selekcji w celu wyłonienia określonej cechy. Jest to analogiczne do prowadzenia hodowli roślin.Wiedzą Państwo, że chcą uzyskać konkretny rozmiar lub konkretny kolor, a następnie zawsze wybierają potomstwo następnego pokolenia posiadające określone cechy i zaczynają je ze sobą krzyżować. Dokładnie to samo robimy w przypadku cząsteczek. Zasadniczo jest to to samo, tyle że w małej skali.Zaczynamy od enzymu o określonej aktywności – w naszym przypadku jest to rekombinaza CRE – oraz białka typu dzikiego. Następnie wprowadzamy niewielką mutację w miejscu wiązania tej rekombinazy, co skutkuje bardzo niską aktywnością. W kolejnym kroku wprowadzamy losowe mutacje do enzymu, czyli do rekombinazy, a następnie wyselekcjonowane zostają mutanty, które są teraz w stanie wiązać to zmutowane miejsce.Gdy już to osiągniemy, możemy następnie połączyć różne mutanty, aby w końcu otrzymać końcowy produkt, w którym rekombinaza rozpoznaje sekwencję zdefiniowaną w LTR. Zaczynamy zatem, jak wspomniałem, od losowej biblioteki mutagennej. Jest to zazwyczaj realizowane za pomocą PCR podatnej na błędy.Stosujemy zatem warunki PCR, w których na przykład polimeraza Taq popełnia wiele błędów. W ten sposób generujemy losową bibliotekę zawierającą mutacje w różnych miejscach. Możemy również wykorzystać szczep mutatorowy, czyli bakteryjny szczep mutatorowy, który wprowadza liczne mutacje w określonych transkrypcjach.Następnie są one wykorzystywane jako materiał wyjściowy. Inną stosowaną przez nas technologią jest shuffle DNA (przetasowanie DNA), do której przechodzimy po pewnym czasie. Jest to w zasadzie technologia pozwalająca na łączenie różnych korzystnych mutacji, ponieważ nie wiadomo dokładnie, która z mutacji jest korzystna, ale dysponuje się różnymi mutantami o różnych mutacjach.W takim przypadku mamy jeden gen z korzystną mutacją w tym miejscu oraz drugi klon z mutacją w innym miejscu. Aby połączyć te dwie zmiany, przeprowadza się losową fragmentację poszczególnych fragmentów, a następnie łączy się je w reakcji PCR w celu ponownego zmontowania produktów. Dzięki temu, z określoną częstotliwością, powstanie kombinacja obu mutacji, w której część rekombinanta pochodzi z pierwszego mutanta, a część z drugiego.Następnie ten element wywrze dodatkowy efekt, który usprawni proces i pozwoli znacznie szybciej wyselekcjonować kandydatów o pożądanych właściwościach. Zdefiniowałbym to w taki sposób, że białko typu dzikiego nie wykazuje absolutnie żadnej aktywności w określonym miejscu. Jeśli weźmiemy na przykład naszą sekwencję wybraną z LTR wirusa HIV, to przy zastosowaniu rekombinazy cre w obrębie tej sekwencji nie zaobserwujemy żadnej aktywności.Rekombinaza CRE nie jest w stanie rekombinować tego miejsca i w mojej opinii mamy do czynienia z nową rekombinazą w momencie, gdy otrzymujemy enzym zdolny do wiązania i rekombinowania tej sekwencji. Nie określiliśmy z góry liczby cykli, które mieliśmy przeprowadzić, lecz wykonywaliśmy ich tyle, ile było konieczne, aż do uzyskania enzymu o pożądanej aktywności. Zaczęliśmy od bardzo niewielkich mutacji w obrębie miejsca wiązania, a następnie zaczęliśmy łączyć różne mutacje ze sobą.Był to jeden z kluczowych etapów sprawiających, że proces ten działał. Przechodziliśmy przez produkty pośrednie i musieliśmy zrealizować wiele takich cykli, aby znaleźć enzym o aktywności wystarczającej do przejścia do kolejnego etapu. Jest to bardzo podobne do każdego procesu hodowlanego.Określają Państwo pożądany poziom aktywności oraz konkretną cechę, a następnie rozpoczynają proces hodowli. Do momentu uzyskania oczekiwanego efektu proces nie jest zakończony i należy przeprowadzić kolejne generacje. W uproszczeniu tak właśnie to wygląda.Należy również wspomnieć, że 120 cykli ewolucji, a dokładniej sto dwadzieścia osiem sześć, służyło jedynie znalezieniu etapu pośredniego, w którym stwierdziliśmy, że możemy przestać, ponieważ pojawiła się pewna aktywność. Rekombinacja, którą uzyskaliśmy, jest wciąż mniej aktywna niż rekombinaza CRE w wersji typu dzikiego. Aby uzyskać bardziej aktywną rekombinazę, musielibyśmy przeprowadzić więcej cykli ewolucji.Zatem w zasadzie nie kończy się to na etapie, na którym obecnie jesteśmy w procesie ewolucji. Nie widzę żadnych ograniczeń technicznych. Kwestią sporną pozostaje to, jak daleko można to pchnąć.Zatem w przypadku strony LTR, sekwencja znajdująca się w LTR HA wykazuje 50% podobieństwa sekwencji do naturalnej strony LoxP, czyli strony naturalnej rozpoznawanej przez rekombinazę Cre. Pytanie brzmi, czy można pójść jeszcze dalej – nie wiemy tego jeszcze, ale fakt, że przy zaledwie 50% podobieństwa sekwencji do sekwencji typu dzikiego system ten działa, sugeruje, że można to dalej modyfikować. Rekombinaza działa dobrze w hodowlach komórek ludzkich, mimo że, jak wspomniałem, nie jest tak aktywna, jak rekombinaza Cre na swojej natywnej sekwencji.Zatem prawdopodobnie stabilność jest nieco mniejsza niż w przypadku analizowanej rekombinazy, dzikiego typu enzymu, i konieczne byłoby przeprowadzenie szerszej selekcji oraz większej liczby cykli ewolucji, aby w przyszłości usprawnić te cechy. Pierwszym krokiem jest zatem udoskonalenie miejsca, tej konkretnej rekombinazy, rekombinazy 3, aby uczynić ją bardziej aktywną, a być może zidentyfikować inne, bardzo wyraźne miejsca, które stanowiłyby dobre cele w LTR, i znaleźć dla nich odpowiednią rekombinazę. Następnie musielibyśmy przetestować tę rekombinazę w różnych testach, najpierw ponownie w kulturach komórkowych, a następnie – co jest bardzo istotne – przetestować tę rekombinazę w modelach zwierzęcych.Zatem musielibyśmy sprawdzić, czy rekombinaza ta wywołuje jakiekolwiek niepożądane skutki uboczne w organizmie. Następnie, bardzo trudnym aspektem jest opracowanie skutecznego systemu dostarczania tej rekombinazy, co nie jest trywialne. Opracowanie takiego systemu stanowi w sobie cały, odrębny obszar badań.Było to w zasadzie podejście z zakresu terapii genowej, które musielibyśmy zastosować. Myślę, że obserwujemy przesunięcie w medycynie w stronę coraz bardziej molekularną. I do tego oczywiście potrzebujemy narzędzi, które pozwolą nam pracować w takiej skali.I właśnie tutaj widzę przyszłość procesu ewolucji. Musimy tworzyć enzymy dostosowane do konkretnych potrzeb, które będą działać w procesach, których chcielibyśmy używać; w przypadku rekombinazy można to porównać do narzędzia dla chirurga, który podczas operacji musi wyciąć konkretny fragment tkanek. Obecnie potrzebujemy narzędzi, dzięki którym „molekularny chirurg” mógłby precyzyjnie wyciąć określony fragment DNA z genomu.Aby to osiągnąć, potrzebuje on odpowiednich narzędzi. Tę funkcję może w zasadzie spełnić ewolucja molekularna. W naturze występuje wiele enzymów, które posiadają właściwości bardzo pożądane do realizacji tego celu.Musimy jedynie dostosować je do naszych potrzeb, aby mogły stać się użyteczne. Myślę, że ewolucja molekularna może odgrywać tutaj bardzo ważną rolę. Trudno jest w tej chwili określić, gdzie leżą ograniczenia, ponieważ ta dziedzina technologii jest wciąż w powijakach.Czas pokaże zatem, gdzie leżą ograniczenia. Jestem pewien, że pewne będą istnieć, ale w tej chwili uważam, że możliwości przeważają nad ograniczeniami.

molecular-evolution-of-the-tre-recombinase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ewolucja molekularna rekombinazy tre

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji.  Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Białko nukleoidowe mitochondrialne drożdży, Mgm101, jest białkiem rekombinacyjnym typu Rad52, które tworzy duże pierścienie oligomeryczne. Opisano protokół przygotowania rozpuszczalnego rekombinowanego Mgm101 przy użyciu strategii znakowania białka wiążącego maltozę (MBP) w połączeniu z chromatografią wymiany kationów i wykluczania wielkości.

Przygotowanie białka rekombinacji Mgm101 za pomocą strategii znakowania opartej na MBP

Tutaj opisujemy metodę jednoczesnej kwantyfikacji okręgów wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji deklacyjnej K (KRECs). Test TREC/KREC może być stosowany jako marker wydalania grasicy i szpiku kostnego.

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Wprowadzenie technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) oraz systemu Cre/lox doprowadziło do licznych osiągnięć w biologii molekularnej i okazało się cennym narzędziem do oceny funkcji genów u zwierząt transgenicznych. W niniejszym wywiadzie omówiono mechanizm rekombinacji specyficznej dla miejsca za pomocą rekombinazy cyklizacyjnej (Cre) oraz sposób, w jaki zastosowanie tego enzymu doprowadziło do opracowania mutagenezy warunkowej, która wykazuje znaczące zalety w porównaniu z...

Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

Prezentujemy metody oceny, jak ryzyko drapieżnictwa może zmienić jakość chemiczną ofiar roślinożerców, wywołując zmiany w diecie, aby sprostać wymaganiom zwiększonego stresu, oraz jak rozkład zwłok tych zestresowanych roślinożerców spowalnia późniejszy rozkład ściółki roślinnej przez mikroby glebowe.

Powiązanie ryzyka drapieżnictwa, stresu fizjologicznego roślinożerców i mikrobiologicznego rozkładu ściółki roślinnej

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Wrotki to mikroskopijny zooplankton używany jako modele w badaniach ekotoksykologicznych i starzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół do skutecznego i powtarzalnego pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus. Synchronizacja warunków hodowli na przestrzeni kilku pokoleń ma szczególne znaczenie, ponieważ stan matki wpływa na historię życia potomstwa.

Pomiar czasu przeżycia u wrotków Brachionus: synchronizacja warunków matczynych

Poznaj ewolucję molekularną rekombinazy Tre, zaprojektowanej do usuwania prowirusa HIV-1 z zainfekowanych komórek ludzkich. Ta metoda pokazuje potencjał terapii genowej.

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Przeglądaj więcej filmów