Name: Wywiad: Wycięcie DNA wirusa HIV-1 przy użyciu wyewoluowanej rekombinazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-16T23:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj metodę wycięcia DNA wirusa HIV-1 przy użyciu wyewoluowanej rekombinazy Cre. Ta innowacyjna strategia terapii genowej umożliwia eliminację zintegrowanego wirusa z komórek gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

W celu uzyskania szerszych informacji na temat rekombinacji specyficznej dla miejsca oraz inżynierii specyficzności miejsca enzymów rekombinaz, prosimy o obejrzenie powiązanych filmów zatytułowanych&nbsp;<a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=718" target="_blank">Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology</a>&nbsp;oraz <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=791" target="_blank">Molecular Evolution of the Tre Recombinase</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

wywiad: wycinanie prowiralnego dna hiv-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integruje się z chromosomem gospodarza w zainfekowanych komórkach i utrzymuje się w postaci prowirusa flankowanego przez długie powtórzenia końcowe (LTR). Obecne strategie leczenia koncentrują się głównie na enzymach wirusowych lub fuzji wirusa z komórką, co hamuje cykl życiowy wirusa, ale nie eliminuje infekcji. Ponieważ zintegrowany prowirus nie jest celem tych podejść, mogą pojawić się nowe, oporne szczepy HIV-1. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza Tre (patrz Molecular evolution of the Tre recombinase , Buchholz, F., Max Planck Institute for Cell Biology and Genetics, Dresden) efektywnie wycina zintegrowane DNA prowirusowe HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek. Wytworzyliśmy pseudotypy wirusowe zawierające loxLTR i zainfekowaliśmy komórki HeLa, aby sprawdzić, czy rekombinaza Tre potrafi wyciąć prowirus z genomu ludzkich komórek zainfekowanych HIV-1. Sklonowano linię komórkową uwalniającą cząstki wirusa, a następnie przetransfekowano ją plazmidem wykazującym ekspresję Tre lub wektorem kontrolnym. Monitorowano aktywność rekombinazy oraz produkcję wirusa. Wszystkie analizy wykazały efektywne usunięcie prowirusa z zainfekowanych komórek bez widocznych efektów cytotoksycznych. Wyniki te stanowią dowód koncepcyjny, że możliwe jest wyewoluowanie rekombinazy specyficznie celującej w LTR HIV-1 oraz że rekombinaza ta jest zdolna do wycinania prowirusa HIV-1 z genomu ludzkich komórek zainfekowanych HIV-1.
Zanim jednak zmodyfikowana rekombinaza mogłaby zostać zastosowana w praktyce terapeutycznej, konieczne jest pokonanie istotnych przeszkód. Do najkrytyczniejszych problemów, z którymi się mierzymy, należą efektywne i bezpieczne dostarczanie do komórek docelowych oraz brak efektów ubocznych.

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

HIV-1 integruje się z chromosomem gospodarza zainfekowanych komórek i utrzymuje się w formie prowirusa flankowanego długimi powtórzeniami końcowymi. Obecne strategie terapeutyczne ...

Nazywam się JohE Hvar i kieruję Katedrą Biologii Komórki i Biologii w Instytucie HE PET w Hamburgu w Niemczech. Instytut HE PET jest instytutem badań podstawowych, który koncentruje się wyłącznie na ludzkim pe, wirusach patogennych oraz, jak bym to ujął, kwestiach z nimi związanych. Nasz wydział interesuje się przede wszystkim badaniem regulacji ekspresji genów HIV oraz interakcjami, a w szczególności interakcjami wewnątrzkomórkowymi HIV z komponentami komórki gospodarza.Na podstawie tych danych staramy się również opracować nowe terapie eksperymentalne dla choroby wywołanej przez HIV. Problemem w przypadku HIV jest to, że HIV jest retrowirusem lub lentiwirusem i jak każdy retrowirus, po zakażeniu komórki gospodarza, HIV integruje genom wirusowy z genomem komórki gospodarza. Do tej pory nie opracowano metody pozwalającej na usunięcie zintegrowanego prowirusa.Oznacza to, że w kontekście terapeutycznym mówimy o chorobie przewlekłej wymagającej dożywotniego leczenia, a co za tym idzie, o wszystkich problemach z tym związanych, takich jak skutki uboczne leków, pojawianie się oporności i tak dalej. Od wielu lat w badaniach podstawowych znamy tzw. rekombinazy, występujące naturalnie w procesach rekombinacji, na przykład u drożdży lub bakterii. Rekombinazy te rozpoznają specyficzne sekwencje DNA, przetasowują geny oraz reorganizują genom i tak dalej.W badaniach podstawowych, w tym badaniach in situ, szczególnie często wykorzystuje się rekombinazę zwaną Cre. Rekombinaza CRE rozpoznaje swoją specyficzną sekwencję i jeśli dana sekwencja znajduje się pomiędzy dwoma miejscami rozpoznania, CRE jest w stanie wyciąć tę sekwencję pośredniczącą.Koncepcja ta, istniejąca od 10 lub 15 lat, polega na tym, aby w medycynie wyeliminować wirusa, wykorzystując z drugiej strony rekombinazy, takie jak Cre, do wycięcia prowirusowego DNA. Teoretycznie powinno to być możliwe, ponieważ podczas infekcji HIV odwrotna transkrypcja zamienia jego genom RNA w DNA, a w wyniku tego procesu powstają sekwencje zwane długimi powtórzeniami końcowymi (LTR), które wyznaczają koniec 5' lub początek oraz koniec 3' zintegrowanego prowirusowego DNA. Zatem w teorii, gdyby udało się opracować rekombinazę, która specyficznie rozpoznaje sekwencję w LTR, Cre atakowałaby koniec 5' i koniec 3' zintegrowanego prowirusowego DNA, wycinając go i w ten sposób eliminując wirusa z zainfekowanej komórki. Problem z HIV polega na tym, że występują różne izolaty, być może nawet u jednej osoby, u jednego pacjenta; jednak, z tego co wiemy do tej pory, sekwencja ta znajduje się na początku i na końcu genomu wirusa.Innymi słowami, sekwencje LTR są bardziej konserwatywne niż na przykład geny HIV. Sądzę zatem, że istnieje duża szansa, iż wystarczy niewielka liczba rekombinantów, które w zasadzie rozpoznają ogromną różnorodność wszystkich izolatów HIV. A jeśli nie, będziemy musieli wygenerować nowy za pomocą ewolucji molekularnej, co w przyszłości może zostać częściowo zautomatyzowane.I tak będzie – proces ten przebiegnie znacznie szybciej niż w warunkach laboratoryjnych. Do współpracy zaprosiliśmy naszego kolegę, dr. Franka z Instytutu Maxa Plancka, którego widzimy w kadrze. Jest on specjalistą w dziedzinie rekombinaz i pokrewnych zagadnień.W zasadzie zastosował on metodę, którą nazywamy metodą ewolucji molekularnej. Metoda ta opiera się jednak na technologii PCR, czyli reakcji łańcuchowej polimerazy. Wykorzystał on gen naturalnie występującej rekombinazy Cre i przeprowadził reakcję PCR lub wiele reakcji PCR w warunkach, które wprowadzają mutacje w sposób losowy.Kluczem jest teraz wyselekcjonowanie nowych wersji rekombinazy, które nabyły nową zdolność lub nową aktywność, a mianowicie rozpoznawania sekwencji specyficznych dla HIV. Proces ten jest przeprowadzany w cyklach powtarzalnych. Wykonał on około 120 lub ponad 120 cykli, stosując tę metodę ewolucji molekularnej.Kiedy ostatecznie opracowano tę konkretną metodę, obecnie nazywaną rekombinacją specyficzną dla trzech LTR, z nową rekombinazą, która obecnie specyficznie rozpoznaje sekwencje HIV. Wstępne badania, a konkretnie eksperymenty z rekombinazami, zostały przeprowadzone tutaj, w Instytucie HE PET w Hamburgu. To, co zrobiliśmy, polegało przede wszystkim na dostarczeniu tej rekombinazy za pomocą wektorów genowych do ludzkich hodowli komórkowych, które zostały zainfekowane izolatem klinicznym HIV-1.Z czasem, w ciągu od sześciu do ośmiu tygodni, udało nam się to udowodnić. Obecnie rekombinant jest obiecujący ilościowo; zintegrowano profil HIV DA, co w zasadzie doprowadziło do wyleczenia całej kultury poprzez usunięcie HIV. Technologia ta wiąże się jednak z licznymi problemami.Przede wszystkim musimy upewnić się, że ekspresja rekombinazy nie powoduje toksycznych efektów ubocznych. Nie spodziewamy się tego, ponieważ w przypadku rekombinacji występujących naturalnie, takich jak gre, istnieją tak zwane zwierzęta transgeniczne. Wykazują one ekspresję tej rekombinacji GRE i co prawda pojawiają się pewne problemy, ale nie są one zbyt znaczące.Mogę to stwierdzić na tym etapie. Istnieje zatem nadzieja, że nie wystąpią toksyczne skutki uboczne, ale nigdy nie wiadomo, dopóki nie przeprowadzi się eksperymentów. Pojawiają się również problemy związane z tym, że być może nie uda nam się rozpoznać każdego izolatu klinicznego, co uniemożliwiłoby całkowite wyeliminowanie dominującego izolatu HIV u pacjenta.Będziemy jednak z czasem selekcjonować rzadkie, marginalne izolaty. Nie wiemy jeszcze dokładnie jak, musimy przeprowadzić te eksperymenty. Istnieje natomiast poważny problem z dostarczaniem genów, związany z technologią wektorową.Musimy zastosować tak zwane wektory lentiwirusowe lub wektory retrowirusowe, aby dostarczyć gen lub gen rekombinazy. Czy występują zatem skutki uboczne? Czy wektory te wywołują efekty toksyczne?To wszystkie nasze pytania. Mamy również nadzieję na zwiększenie aktywności grzebieni. Rekombinacja przebiega szybciej, niż obserwujemy to obecnie w ciągu ostatnich kilku tygodni w zakresie aktywności.W związku z tym są to pytania otwarte, na które musimy odpowiedzieć w nadchodzących latach. Obecnie jest to bez wątpienia problem, ponieważ rekombinazy nie są dostępne w formie doustnej. Nie będzie zatem istniała tabletka z rekombinazą, którą można by po prostu przyjąć, aby pozbyć się wirusa.Rozważając zatem przyszłe metody terapeutyczne, musimy wziąć pod uwagę podejścia oparte na terapii genowej. Można zatem przyjąć koncepcję, w której izoluje się tzw. hematopoetyczne komórki macierzyste lub komórki CD34-dodatnie z krwi pacjentów zainfekowanych HIV. Następnie w warunkach laboratoryjnych wprowadza się gen dla receptorów CCR5 do tych komórek pacjenta.Na koniec ponownie podajemy, reinfundujemy pacjentowi jego genetycznie zmodyfikowane komórki, wstrzykując je w okolicę lędźwiową tego samego pacjenta. W efekcie układ odpornościowy lub układ krwiotwórczy pacjenta powinien z czasem ulec przynajmniej częściowej rekonstrukcji za pomocą komórek, które po zakażeniu HIV będą w stanie pozbyć się wirusa, ponieważ wykazują one teraz ekspresję rekombinazy. Wynikiem tego będzie spadek wiremii u pacjenta, co z pewnością poprawi jego jakość życia.Możemy również mieć nadzieję, że układ odpornościowy u tych pacjentów ulega przynajmniej częściowej regeneracji. W związku z tym w pełni funkcjonalne komórki odpornościowe będą – miejmy nadzieję – w stanie zaatakować pozostałe zainfekowane komórki w organizmach tych pacjentów. Tego, czy jesteśmy w stanie całkowicie wyeliminować HIV z organizmu pacjenta, nie możemy obecnie określić.

interview-hiv-1-proviral-dna-excision-using-an-evolved-recombinase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wywiad: Wycięcie DNA wirusa HIV-1 przy użyciu wyewoluowanej rekombinazy

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i...

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Poznaj metodę wycięcia DNA wirusa HIV-1 przy użyciu wyewoluowanej rekombinazy Cre. Ta innowacyjna strategia terapii genowej umożliwia eliminację zintegrowanego wirusa z komórek gospodarza.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Przeglądaj więcej filmów