Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) metodą wiszącej kropli
July 23rd, 2008
Ten film pokazuje, jak przeprowadzić in vitro różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy do ciał embrionalnych za pomocą metody wiszącej kropli.
Komórki macierzyste mają niezwykły potencjał do przekształcania się w wiele różnych typów komórek w organizmie. Służy jako rodzaj systemu naprawczego dla organizmu. Teoretycznie mogą dzielić się bez ograniczeń, aby uzupełnić inne komórki.
Kiedy komórka macierzysta dzieli się, każda nowa komórka ma potencjał, aby albo pozostać komórką macierzystą, albo stać się innym typem komórki o bardziej wyspecjalizowanej funkcji. Ta obiecująca dziedzina nauki skłania naukowców do zbadania możliwości zastosowania terapii komórkowych w leczeniu chorób in vitro. Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych zachodzi, gdy komórki mogą agregować się w hodowli zawiesinowej.
W przypadku braku mysich embrionów, żywicieli fibroblastów i czynnika hamującego białaczkę, te agregaty komórkowe nazywane są ciałami zarodków. Metoda wiszącej kropli jest jedną ze skutecznych procedur różnicowania komórek macierzystych w ciała zarodkowe in vitro. Cześć, jestem Sha Juan z lewej strony na wydziale medycyny sercowo-naczyniowej na Uniwersytecie Stanforda.
Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę indywidualnego różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w celu wytworzenia organizmu metodą ręcznego opadania. Zazwyczaj używamy tej metody do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty. Procedura ta, obejmująca następujące kroki, przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki embrionalnych komórek macierzystych, wygenerowanie kultur ręcznych, przeniesienie kultur ręcznych na bardzo niskie płytki mocujące oraz poszycie korpusów haftowych na płytki powlekane wystają.
Dobra, zacznijmy. Pierwszym etapem zabiegu jest przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki embrionalnych komórek macierzystych. Ponieważ hodujemy nasze niezróżnicowane embrionalne komórki macierzyste, hodując je na mysich fibroblastach embrionalnych, musimy odłączyć komórki i oddzielić je od fibroblastów.
Aby to zrobić, próbujemy anżować komórki przy użyciu standardowych procedur. Po zakończeniu próby i leczenia dodaj pożywkę z embrionalnych komórek macierzystych myszy, aby zneutralizować trypsynę. Następnie przenieś zawiesinę komórek do stożkowej rurki o grubości 15 mil.
Następnie rozbij kolonie komórek, pipetując w górę iw dół na dnie probówki, aż uzyskasz drobną zawiesinę komórek bez widocznych grudek. Teraz obracaj ogniwa z prędkością tysiąca obrotów na minutę przez pięć minut. Po odwirowaniu komórki odessać supernat i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 milicali mysiej komórki ES. Średni.
Przenieść zawiesinę komórek do kolby T 75 wstępnie zakodowanej 0,1% żelatyny i inkubować w temperaturze 37 stopni z 5% CO2 przez jedną godzinę. Po godzinie fibroblasty przyczepiają się do płytki, ale komórki macierzyste pozostają w pożywce. Odpipetuj pożywkę, aby zebrać komórki macierzyste.
Obracaj komórki z prędkością tysiąca obrotów na minutę przez pięć minut i odessaj pożywkę. Następnie dodaj kolejne 10 mililitrów pożywki różnicującej i ponownie zawiesij komórki przez powtarzalne pipetowanie, aż pojawi się drobna zawiesina komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
Teraz jesteśmy gotowi do hodowli zawiesiny komórkowej przy użyciu metody wiszącej kropli. Aby rozpocząć hodowlę z wiszącą kroplą, użyj mediany różnicowania, aby rozcieńczyć zawiesinę komórek macierzystych do stężenia 500 komórek na 20 mikrolitrów. Następnie odwróć 150-milimetrową pokrywę płytki do hodowli tkankowej.
Następnie odpipetować 20 mikrolitrów zawiesiny komórek na wewnętrzną powierzchnię pokrywy płytki. Za pomocą pipetera wielokanałowego dodaj 10 milicali PBS na płytkę. Szybko odwróć pokrywę talerza i delikatnie umieść ją na talerzu, aby uformować wiszące krople.
Po założeniu pokrywy płytki ostrożnie przenieś ją do hodowli w inkubatorze. Komórki były nienaruszone przez dwa dni. Po zakończeniu inkubacji przystąpimy do przeniesienia wiszącej kultury kroplowej na bardzo niskie płytki mocujące.
Po dwóch dniach ostrożnie odwróć pokrywę płytki, a następnie odessaj 180 mikrolitrów świeżej pożywki różnicującej i wlej kilka kropli do 96-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Następnie nabierz krople za pomocą pipety i przenieś je pojedynczo na płytkę 96-dołkową. Umieść płytki w inkubatorze bez przeszkód na trzy dni.
Ciała zarodkowe będą nadal rosły w kształt kuli. Po zakończeniu inkubacji będziemy gotowi do pokrycia ciał zarodków. Aby pomóc ciałom zarodkowym w dalszym różnicowaniu się.
Przenosimy je na 48-dołkową płytkę pokrytą żelatyną. Aby to zrobić, najpierw pokrywamy każdą studzienkę płytki 300 mikrolitrami 0,1% żelatyny. Po dodaniu żelatyny inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego dnia odessaj żelatynę z płytki 48-dołkowej. Następnie dodaj do każdego 300 mikrolitrów pożywki różnicującej. Cóż, teraz jeden po drugim przenieś ciała zarodków z 96 dołków do 48 dołków pokrytych żelatyną.
Zwykle zmieniamy pożywkę następnego dnia, a następnie co drugi dzień, aby utrzymać komórki. Używamy tej metody, aby szukać lepszych protokołów różnicowania embrionalnych komórek macierzystych. W kardiomiocytach właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić różnicowanie in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy za pomocą hodowli wiszących kropli.
Ta metoda jest skuteczna, ponieważ okrągłe dno wiszącej kropli umożliwia agregację embrionalnych komórek macierzystych, zapewniając w ten sposób dobre środowisko do tworzenia ciał Embry'ego. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że liczba embrionalnych komórek macierzystych zagregowanych w wiszącej kropli może być kontrolowana poprzez zmianę liczby komórek w początkowej zawiesinie komórki. Otóż to.
Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymencie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To wideo pokazuje in vitro różnicowanie komórek macierzystych mysich zarodkowych w ciała zarodkowate za pomocą metody kropli zawieszonej. Komórki macierzyste mają potencjał do rozwoju w różne typy komórek, działając jako system naprawczy dla organizmu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Różnicowanie komórek
- Techniki hodowania in vitro
Tło
- Komórki macierzyste teoretycznie mogą dzielić się bez ograniczeń.
- Każda nowa komórka może pozostać komórką macierzystą lub stać się specjalizowanym typem komórki.
- Ten obszar nauki prowadzi do potencjalnych terapii opartych na komórkach.
- Różnicowanie komórek macierzystych zarodkowych odbywa się w hodowli zawiesinowej.
Cel badania
- Zdemonstrowanie różnicowania komórek macierzystych zarodkowych.
- Przedstawienie metody kropli zawieszonej do agregacji komórek.
- Dostarczenie wglądu w potencjalne zastosowania terapeutyczne.
Zastosowane metody
- In vitro różnicowanie komórek macierzystych zarodkowych myszy.
- Metoda kropli zawieszonej do agregacji komórek.
- Techniki hodowli zawiesinowej.
- Obserwacja formowania się ciał zarodkowych.
Główne wyniki
- Sukcesywne formowanie ciał zarodkowych z komórek macierzystych.
- Demonstracja skuteczności metody kropli zawieszonej.
- Wgląd w proces różnicowania komórek macierzystych.
- Potencjalne zastosowania w terapiach opartych na komórkach.
Wnioski
- Metoda kropli zawieszonej jest skuteczna w różnicowaniu komórek macierzystych.
- Ciało zarodkowate można utworzyć in vitro z komórek macierzystych zarodkowych myszy.
- Ta technika może posłużyć rozwojowi badań w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Controlled embryoid body formation enables reproducible in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine research. The hanging drop method provides a scalable, standardized approach to generate homogeneous multicellular aggregates, reducing variability in downstream phenotypic screening and assay development. This technique enhances predictive confidence by allowing precise cell number control, facilitating consistent embryoid body generation for therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell differentiation pathways and functional target validation through controlled embryoid body formation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing a reproducible system to assess lineage commitment and early differentiation markers.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by allowing standardized evaluation of differentiation efficiency across genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated embryoid body systems for downstream compound screening and phenotypic assessment.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled cell aggregation in hanging drops.
- Scalability: Enables platform reuse and consistent compound evaluation across multiple wells and plates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by generating embryoid bodies that model early developmental processes pertinent to regenerative therapies.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via standardized embryoid body production.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative assessment of differentiation kinetics and homogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
The hanging drop method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation through lead identification and preclinical validation, enabling standardized embryoid body generation for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled aggregation of mouse embryonic stem cells into embryoid bodies.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through uniform embryoid body formation, facilitating reliable compound screening outcomes.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as embryoid body size, number, and morphology to compare differentiation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating disease-relevant embryoid bodies for mechanistic de-risking and biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects requiring standardized embryoid body production for differentiation assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in differentiation outcomes, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in stem cell research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of embryoid body formation across laboratories and experiments.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in regenerative medicine pipelines.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on consistent embryoid body quality and differentiation efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, single-cell suspension preparation, and embryoid body handling.
- Depends on access to low-attachment plates, gelatin-coated surfaces, and standardized differentiation media.
- Necessitates cross-team standardization of cell concentration, drop volume, and incubation timing for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring embryoid bodies to different culture surfaces for downstream differentiation.
- Limited by the need for manual pipetting precision and careful handling to avoid embryoid body disruption during transfer steps.
