Name: Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) metodą wiszącej kropli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych metodą wiszącej kropli. Ta technika umożliwia formowanie ciał zarodkowych i badanie potencjału terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>Przetraktować kolbę T75 0,1% roztworem żelatyny i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez noc, dzień przed eksperymentem.</li>
<li>Wyjąć komórki mES z inkubatora, odessać medium, przepłukać hodowlę komórek ES za pomocą PBS, a następnie dodać 0,05% roztwór trypsyny, aby pokryć dno naczynia (2 ml/płytka 100 mm).</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez około 1 minutę, aż komórki zaczną odklejać się od płytki. </li>
<li>Delikatnie triturować (pipetować w górę i w dół) trypsynizowane komórki od czterech do sześciu razy za pomocą zapchanej pipety Pasteura, aby rozproszyć komórki ES. Przenieść rozproszone komórki ES do stożkowej probówki wirówki o pojemności 15 ml zawierającej&nbsp; uprzednio podgrzane (37°C) medium mES. </li>
<li>Zebrać komórki przez wirowanie. Odessać supernatant, dodać 10 ml medium mES i pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. </li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do kolby T75 uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną i inkubować w temperaturze 37°C&nbsp; przy 5% CO2 przez jedną godzinę. *Po godzinie fibroblasty przyłączą się do płytki, natomiast komórki macierzyste pozostaną w medium. Odessać medium pipetą, aby zebrać komórki macierzyste. </li>
<li>Wirować komórki z prędkością 1000 rpm przez 5 min i odessać medium mES. Następnie dodać kolejne 10 ml medium różnicującego mES i resuspenderć komórki poprzez wielokrotne pipetowanie, aż powstanie jednorodna zawiesina komórek.</li>
<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru; użyć medium różnicującego do rozcieńczenia zawiesiny komórek macierzystych do stężenia od 400 do 500 komórek na 20 µl (20 µl/kropla)&nbsp; w sterylnym naczyniu.</li>
<li>Podnieść pokrywkę, ostrożnie ją odwrócić i położyć na naczyniu zawierającym 10 ml PBS.&nbsp; Używając pipety wielokanałowej, nanieść rzędy kropli o objętości 20 µl na odwróconą wewnętrzną powierzchnię pokrywki naczynia do hodowli tkanek.</li>
<li>Ostrożnie umieścić naczynie w inkubatorze na 2 dni. Po dwóch dniach ostrożnie odwrócić pokrywkę płytki, odessać 180 µl świeżego medium różnicującego i nanieść kilka kropli do dołka płytki 96-dołkowej o ultraniskiej adhezji (ultralow attachment plate). Następnie pobrać kroplę pipetą i przenosić krople pojedynczo do płytki 96-dołkowej. Umieścić płytki w inkubatorze bez zakłóceń na 3 dni. </li>
<li>Pokryć każdy dołek 48-dołkowej płytki do hodowli tkanek 300 µl 0,1% żelatyny. Po dodaniu żelatyny inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C na dzień przed przeniesieniem ciał embrioidalnych (EB). </li>
<li>Następnego dnia odessać żelatynę z płytki 48-dołkowej. Następnie dodać 300 µl medium różnicującego do każdego dołka. Przenieść EB z płytek 96-dołkowych do 48-dołkowych płytek pokrytych żelatyną, jedna po drugiej. Wymienić medium następnego dnia, a następnie wymieniać medium co drugi dzień w celu utrzymania komórek. </li>
<li>Spontaniczne skurcze kardiomiocytów powinny stać się widoczne w ciągu 7 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

Wady metody wiszącej kropli są następujące: objętość cieczy w kropli jest ograniczona do mniej niż 50ul ze względu na konieczność utrzymania kropli na pokrywce za pomocą napięcia powierzchniowego, a wymiana medium w wiszących kroplach jest niemożliwa. Bezpośrednia obserwacja tworzących się w kroplach ciał embrioidalnych (EB) za pomocą mikroskopii podczas hodowli jest również bardzo trudna. Ponadto metoda wiszącej kropli składa się z dwóch etapów, w związku z czym seria kroków w tej metodzie może być kłopotliwa.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Odczynnik</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Odczynnik</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>czynnik hamujący białaczkę (LIF)</td><td>Odczynnik</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa o bardzo niskiej adhezji</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mes) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Komórki macierzyste posiadają niezwykły potencjał do różnicowania się w wiele różnych typów komórek. Podczas podziału komórki macierzystej każda nowa komórka może pozostać komórką macierzystą lub przekształcić się w inny typ komórki o bardziej wyspecjalizowanej funkcji. Te obiecujące perspektywy naukowe skłaniają badaczy do analizy możliwości zastosowania terapii komórkowych w leczeniu chorób.

Podczas hodowli w zawiesinie bez czynników przeciwróżnicujących, embrionalne komórki macierzyste spontanicznie różnicują się i tworzą trójwymiarowe agregaty wielokomórkowe. Agregaty komórkowe te nazywa się ciałami embrionalnymi (EB). Hodowla w kropli wiszącej jest powszechnie stosowaną metodą indukcji powstawania EB. Zaokrąglone dno kropli wiszącej umożliwia agregację komórek ES, co zapewnia komórkom mES odpowiednie środowisko do tworzenia ciał EB. Liczbę komórek ES agregujących się w kropli wiszącej można kontrolować poprzez zmianę liczby komórek w początkowej zawiesinie komórkowej, która jest zawieszana w formie kropli z pokrywki szalki Petriego. Stosując tę metodę, możemy w sposób powtarzalny tworzyć jednorodne ciała EB z określonej liczby komórek ES.

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób przeprowadzania różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w ciała zarodkowe z wykorzystaniem metody wiszących kropli.

Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

Komórki macierzyste posiadają niezwykły potencjał do różnicowania się w wiele różnych typów komórek. Podczas podziału komórki macierzystej każda nowa komórka ma potencjał, aby albo...

Komórki macierzyste posiadają niezwykły potencjał do przekształcania się w wiele różnych typów komórek w organizmie, pełniąc rolę swoistego systemu naprawczego ciała. Teoretycznie mogą one dzielić się w sposób nieograniczony, aby uzupełniać inne komórki.Podczas podziału komórki macierzystej każda nowa komórka ma potencjał, aby pozostać komórką macierzystą lub stać się innym typem komórki o bardziej wyspecjalizowanej funkcji. Ta obiecująca dziedzina nauki skłania badaczy do analizy możliwości zastosowania terapii opartych na komórkach w celu leczenia chorób in vitro. Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych zachodzi, gdy komórkiom pozwala się agregować w kulturze zawiesinowej.Wobec braku embrionalnych fibroblastów mysich oraz czynnika hamującego białaczkę, agregaty komórkowe te nazywa się ciałami embrionalnymi. Metoda wiszącej kropli jest jedną z efektywnych procedur różnicowania komórek macierzystych w ciała embrionalne in vitro. Dzień dobry, nazywam się Sha Juan i pracuję w dziale medycyny sercowo-naczyniowej na Uniwersytecie Stanforda.Dzisiaj przedstawimy procedurę indywidualnej różnicowania komórek macierzystych zarodkowych w ciała embroidalne z wykorzystaniem metody kropelkowej. Zazwyczaj stosujemy tę metodę do różnicowania komórek macierzystych zarodkowych w kardiomiocyty. Procedura ta obejmuje następujące etapy: przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek macierzystych zarodkowych, tworzenie kultur kropelkowych, przenoszenie kultur kropelkowych na płytki o bardzo niskim stopniu przywierania oraz wysiewanie ciał embroidalnych na płytki pokryte żelatyną.Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem procedury jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek macierzystych zarodkowych. Ponieważ hodujemy niezróżnicowane komórki macierzyste zarodkowe na fibroblastach zarodkowych myszy, musimy oddzielić komórki i odizolować je od fibroblastów.Aby to osiągnąć, poddajemy komórki trypsynizacji zgodnie ze standardowymi procedurami. Po zakończeniu traktowania trypsyną dodajemy pożywkę dla embrionalnych komórek macierzystych myszy w celu neutralizacji trypsyny. Następnie przenosimy zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Następnie rozbij kolonie komórek, pipetując je w górę i w dół przy dnie probówki, aż do uzyskania drobnej zawiesiny komórek bez widocznych grudek. Teraz wirować komórki przy 1000 RPM przez pięć minut. Po wirowaniu odessać supernatant i zawiesić komórki w 10 ml pożywki dla mysich komórek ES (mouse ES cell Medium).Przenieś zawiesinę komórkową do kolby T 75 uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną i inkubuj w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przez jedną godzinę. Po godzinie fibroblasty przyczepią się do płytki, natomiast komórki macierzyste pozostaną w medium. Odessij medium pipetą, aby zebrać komórki macierzyste.Wiruj komórki przy 1000 RPM przez pięć minut, a następnie odessij pożywkę. Następnie dodaj kolejne 10 ml pożywki różnicującej i resuspenduuj komórki poprzez wielokrotne pipetowanie, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Policz komórki, używając hemosytometru.Teraz możemy przystąpić do hodowli zawiesiny komórkowej metodą wiszącej kropli. Aby rozpocząć hodowlę w wiszącej kropli, należy użyć medium różnicującego do rozcieńczenia zawiesiny komórek macierzystych do stężenia 500 komórek na 20 µL. Następnie należy odwrócić pokrywkę płytki do hodowli tkanek o średnicy 150 mm.Następnie nanieś pipetą 20 µL zawiesiny komórkowej na wewnętrzną powierzchnię pokrywki płytki. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 10 ml PBS na płytkę. Szybko odwróć pokrywkę płytki i delikatnie połóż ją na płytce, aby utworzyć krople wiszące.Po założeniu pokrywki płytki, ostrożnie przenieś ją do inkubatora. Pozostaw komórki w spokoju na dwa dni. Po zakończeniu inkubacji przejdziemy do przeniesienia hodowli w kropli wiszącej na płytki o ultra niskiej adhezji.Po dwóch dniach ostrożnie odwróć pokrywę płytki, następnie odessaj 180 µL świeżego pożywki do różnicowania i nanieś kilka kropel na płytkę 96-dołkową o ultra niskim przywieraniu (ultra low attachment). Następnie pobierz krople pipetą i przenieś je pojedynczo do płytki 96-dołkowej. Umieść płytki w inkubatorze na trzy dni, nie zakłócając ich stanu.Ciała embrionów będą nadal rosnąć, przyjmując kształt kuli. Po zakończeniu inkubacji będziemy gotowi do wysiewania ciał embrionów, aby wspomóc ich dalszą różnicowanie.Przenosimy je na płytkę 48-dołkową powlekaną żelatyną. Aby to zrobić, najpierw powlekamy każdy dołek płytki 300 µL 0,1% żelatyny. Po dodaniu żelatyny inkubujemy płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.Następnego dnia odessaj żelatynę z płytki 48-dołkowej. Następnie dodaj 300 µL medium do różnicowania do każdego dołka. Teraz przenoś pojedynczo ciała zarodkowe z płytki 96-dołkowej na płytki 48-dołkowe powlekane żelatyną.Zazwyczaj zmieniamy pożywkę następnego dnia, a następnie co drugi dzień, aby utrzymać przeżywalność komórek. Metody tej używamy do poszukiwania lepszych protokołów różnicowania embrionalnych komórek macierzystych. W przypadku kardiomiocytów zaprezentowaliśmy właśnie sposób przeprowadzania różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem hodowli w kropelkach wiszących.Metoda ta jest skuteczna, ponieważ okrągłe dno wiszącej kropli umożliwia agregację embrionalnych komórek macierzystych, zapewniając tym samym odpowiednie środowisko do powstawania ciał embrionalnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że liczbę embrionalnych komórek macierzystych zagregowanych w wiszącej kropli można kontrolować poprzez zmianę liczby komórek w początkowej zawiesinie komórkowej. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

in-vitro-differentiation-mouse-embryonic-stem-mes-cells-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) metodą wiszącej kropli

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy prostą i szybką metodę ładowania określonej liczby komórek do mikrofabrykowanych studni oraz ich utrzymywania w celu rozwoju ciał embrionalnych.

Krople wiszące typu Shrinky-Dink: prosty sposób formowania i hodowli ciał embrioidalnych

Opisujemy zastosowanie testu opartego na komórkach ES myszy w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda ta stanowi standaryzowaną platformę, która pozwala na wiarygodne ilościowe określenie wydajności kardiogennej i może być stosowana do badania innych linii komórkowych.

Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Opracowaliśmy nowy protokół w celu zwiększenia wydajności różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe in vitro. Zróżnicowane komórki ES nabyły cechy neuronów ruchowych, co potwierdzono poprzez wykazanie ekspresji markerów neuronalnych i neuronów ruchowych z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych.

Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Film pokazuje różnicowanie się embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) do ciał embrionalnych (EB) metodą wiszącej kropli. Po zawieszeniu mESC w wiszących kroplach i inkubacji, komórki agregują się, tworząc EB, które są dalej różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) za pomocą pożywki różnicującej uzupełnionej kwasem retinowym (RA).

Generowanie progenitorów nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy metodą wiszącej kropli

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Poznaj różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych metodą wiszącej kropli. Ta technika umożliwia formowanie ciał zarodkowych i badanie potencjału terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej.

Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

Przeglądaj więcej filmów