Wytwarzanie stabilnych transgenicznych C. elegans za pomocą mikroiniekcji

Morska elegancja jest niezwykle użytecznym organizmem modelowym zarówno ze względu na naszą wiedzę na temat jego linii komórkowych, jak i bogactwo informacji uzyskanych dzięki sekwencjonowaniu i analizie całego jego genomu. W tym filmie pokazujemy proces mikrowstrzykiwania plazmidów do elegancji morskiej i selekcji transgenicznego potomstwa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej jako przezroczyste i wielokomórkowe zwierzę, elegancja morska jest idealna do wizualizacji transgenów wyrażających białka znakowane fluorescencyjnie in vivo. Cześć, nazywam się Laura Berkowitz i jestem pracownikiem naukowym w Caldwell Lab na Wydziale Nauk Biologicznych na Uniwersytecie w Alabamie.

Nazywam się Adam Knight i również pracuję w Calwell Lab na Uniwersytecie w Alabamie. Dzisiaj pokażę Ci, jak przygotować się i wykonać mikroiniekcję plazminy, aby wygenerować transgeniczną elegancję morską, a także pokażę Ci, jak wybrać i utrzymać linie elegancji fok transgenicznych. Więc zacznijmy.

Zanim rozpoczniemy mikroiniekcję, mamy kilka kroków przygotowawczych, które teraz Ci pokażę. Najpierw przygotuj plazmidowe DNA do wstrzyknięcia, wymagane są dwa plazmidy, jeden, który koduje specyficzną tkankowo ekspresję naszego interesującego nas genu, a drugi, który zapewnia wybieralny marker transformacji. Wymieszaj plazmidy ze sobą w stosunku jeden do jednego 50 nanogramów na mikrolitr.

Następnie należy przygotować podkładki ślimakowe, które posłużą do unieruchomienia ślimaków do iniekcji. Aby wykonać podkładki świdra, najpierw ustaw kilka okularów nakrywkowych o wymiarach 22 na 50 milimetrów na blacie stołu. Za pomocą pipety pastwiskowej umieść kroplę stopionego 2%agros na jednej szklance nakrywkowej i natychmiast umieść drugą szklankę nakrywkową na kropli pod kątem 90 stopni do pierwszej.

Pozwól aerodynamice zestalić się na kilka sekund, a następnie zdejmij górną szybę pokrywową. Średnica spłaszczonej tarczy aero powinna wynosić od 15 do 20 milimetrów. Podobnie jak zwierzę domowe, pozostaw podkładkę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez kilka godzin lub na noc.

Po wyschnięciu przechowuj podkładki w szklanym pudełku nakrywkowym w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj ładowarki igłowe do roztworu DNA. Aby to zrobić, weź stu mikrolitrową rurkę kapilarną i podgrzej ją w środku otwartego ognia i szybko pociągnij do około dwukrotności jej długości.

Gdy rurka kapilarna ostygnie, rozsuń dwie połówki. Zgromadź od 10 do 20 ładowarek igłowych do wstrzykiwania. Możesz przechowywać je w pozycji pionowej w mikroprobówce wirówkowej.

Brack, bądź ostrożny. Punkty ładowania igłowego są bardzo ostre. Teraz wykonaj igły do mikro iniekcji.

Igły te są wykonane ze specjalnej rurki kapilarnej, która zawiera wewnętrzne szklane włókno. Włókno to służy jako dla roztworu DNA. Do produkcji igieł używamy Niki PP eight 30 Polar Przy ustawieniu grzania 24,8 kilka igieł jest wyciąganych jednocześnie w celu przechowywania.

Na pasku modeliny można zamontować wiele igieł. Małe odłamki szkła nakrywkowego zostaną użyte do rozbicia wyciągniętej końcówki igły. Odłamki te przygotowuje się, owijając szklane szkło o wymiarach 18 na 18 milimetrów chusteczką Kim i delikatnie dociskając, aż rozpadnie się na kilka kawałków.

Użyj odłamków o rozmiarze około trzech na cztery milimetry. Oprócz przygotowania DNA i igieł, przygotuj około 50 do 100 odpowiednio zainscenizowanych. Dwa dzikie robaki dla każdego konstruktu wektora wyrażenia, który ma zostać wstrzyknięty.

Jesteśmy teraz gotowi do skonfigurowania mikroskopu mikroiniekcyjnego. Aby rozpocząć ustawianie mikroskopu, otwórz główny zawór na zbiorniku helu, który jest połączony z ramieniem igły do mikroiniekcji i uchwytem. Zamknij reduktor, aby gaz mógł dostać się do przewodu.

Podnosząc ciśnienie do 35 PSI, gaz można uwolnić za pomocą pedału nożnego. Następnie włóż ładowarkę igłową do standardowej rurki pipety do ust i upuść niewielką ilość mieszaniny plazmidów na około jeden mikrolitr. Teraz delikatnie przełóż ładowarkę do końca przez igłę do mikroiniekcji, aż poczujesz opór.

Usuń roztwór DNA, delikatnie, a następnie wyjmij ładowarkę. Po załadowaniu DNA włóż igłę do ramienia do mikroiniekcji, uważając, aby umieścić ją w małej wewnętrznej gumowej uszczelce, a następnie zaciśnij ją na ramieniu manipulatora. Następnie umieść odłamek szkła nakrywkowego łamiący igłę na jednej krawędzi podkładki ślimaka.

Przykryj odłamek, a także całą powierzchnię podkładki świdra olejem węglowym. Następnie umieść podkładkę ślimaka na stoliku mikroskopu odwróconego. Po umieszczeniu podkładki ślimaka umieść igłę na środku pola widzenia, korzystając z obiektywu Forex i jasnego oświetlenia pola, ale nie opuszczaj jej jeszcze do oleju.

Następnie umieść wewnętrzną krawędź odłamka szkła nakrywkowego na środku, a następnie skup się na niej. Opuść igłę w oleju, ustawiając ją w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co odłamek szkła nakrywkowego. Zwiększ powiększenie, przełączając się na obiektyw 40x, a następnie ponownie ustaw ostrość na krawędzi odłamka i w razie potrzeby zmień położenie końcówki igły.

Teraz rozłam Otworzyć końcówkę igły do wstrzykiwań. Delikatnie popchnij igłę o krawędź odłamka szkła nakrywkowego, jednocześnie nakładając krótki impuls gazu za pomocą pedału nożnego. Igła zostanie wystarczająco złamana.

Kiedy małe kropelki płynu wydostają się z końca igły, nadmiar płynu przepływa z powodu zbyt dużego przepływu, otwór nie jest pożądany, ponieważ zabije zwierzęta. Gdy igła jest już gotowa, przystępujemy do mikroiniekcji. Następnie zdejmij podkładkę ślimaka ze sceny, podnosząc igłę do góry.

Nie zmieniaj jednak położenia osi X ani Y. Wysuń stolik spod igły. Zdejmij podkładkę ślimaka i umieść ją na mikroskopie preparacyjnym.

Przenieś słowo na podkładkę pod powierzchnią oleju. Jeśli robak wije się delikatnie, głaszcz go, aż zetknie się z podkładką ślimaka, wilgotny robak powinien przylegać do suchego agro. Szybko umieść podkładkę ślimaka z powrotem na scenie, wyśrodkowując ślimak w polu view.

Następnie opuść igłę do tej samej płaszczyzny ostrości co robak. Przełącz filtry na odwróconej lunecie na oświetlenie Hoffmana. Ten filtr kontrastowy pozwala na uwidocznienie szczegółów morfologicznych robaka.

Korzystając z obiektywu 40 x, skup się na ziarnistym centrum czuciowym gonady robaka poniżej wzoru plastra miodu jąder zarodkowych. Wybierz, która gonada jest umieszczona po stronie robaka skierowanej w stronę igły. Grzywna. Dostosuj położenie igły, aż końcówka również będzie ostra.

Delikatnie włóż igłę w środek gonady i zastosuj krótki impuls ciśnienia gazu, aby wyrzucić jedną lub dwie krople DNA do ramienia gonady. Powinieneś obserwować falę cieczy rozchodzącą się po dystalnym ościeniu z dużą praktyką i umiejętnościami. Za każdym razem możesz uderzyć w centrum ościenia.

Należy pamiętać, że ważne jest, aby działać szybko podczas wstrzykiwania robaka. Ponieważ może łatwo wyschnąć. Cały proces powinien zająć mniej niż jedną do dwóch minut.

Po zakończeniu wstrzykiwania zdejmij podkładkę ślimaka ze stolika i umieść ją na lunecie sekcyjnej. Nanieść jeden mikrolitr buforu M nine bezpośrednio na wstrzykniętego robaka. Może to pociągnąć za sobą zanurzenie końcówki pipety pod powierzchnią oleju węglowego halo.

Bufor powinien ponownie nawodnić robaka, a następnie uniesie się on z powierzchni podkładki aerodynamicznej, przenieś robaka na zwykłą płytkę za pomocą wykałacza do robaków. Teraz przekażę wstrzyknięte robaki Adamowi, a on pokaże nam selekcję i utrzymanie linii transgenicznych. Wstrzyknięte robaki przenosi się na pojedyncze, świeżo wysiane 60-milimetrowe płytki i pozostawia do rozmnażania.

Robaki te reprezentują pokolenie P zero. Zazwyczaj wstrzykiwane zwierzęta są inkubowane w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aż pojawi się potomstwo. Gdy pojawi się potomstwo, jesteśmy gotowi do rozpoczęcia badań przesiewowych w kierunku transgenicznych robaków.

Potomstwo F1 jest obserwowane pod kątem dowodów na obecność markera transgenicznego. W tym przypadku wybieralny marker jest fluorescencyjny, dzięki czemu możemy przeprowadzić badanie przesiewowe za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Każde zwierzę fluorescencyjnego nosiciela F1 jest oddzielnie klonowane na nową płytkę.

Wstrzyknięty P zero może wyprodukować tylko od jednego do pięciu fluorescencyjnych potomstwa spośród wszystkich swoich F1. Pozwól hermafrodytom F1 rozmnażać się w temperaturze 20 stopni przez dwa do trzech dni, aż pojawi się potomstwo. Gdy pokolenie F two jest gotowe, obserwuje się je również u zwierząt transgenicznych. F dwa zwierzęta, które odziedziczyły i wyraziły marker transgeniczny, są uważane za stabilną linię.

Każda niezależna stabilna linia powinna być utrzymywana jako oddzielna linia robaków, która rozmnaża się w każdej linii, przenosząc kilka transgenicznych zwierząt na nową płytkę w każdym pokoleniu. Należy to zrobić za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Jeśli selektywny marker jest fluorescencyjny w celu kontroli zmienności liczby kopii genu, należy wygenerować co najmniej trzy niezależne stabilne linie na wstrzyknięty konstrukt.

Właśnie pokazaliśmy, jak mikro wstrzykiwać wyrażenia, konstrukcje wektorowe i widzieć elgana oraz wybierać stabilne linie. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.