Name: Wytwarzanie stabilnych transgenicznych C. elegans za pomocą mikroiniekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Naucz się mikroiniekcji plazmidów do gonady C. elegans w celu tworzenia transgenicznych linii zwierząt. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji genów przy użyciu fluorescencji in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować wszystkim członkom laboratorium Caldwell za ich ducha współpracy. Badania nad zaburzeniami ruchowymi w tym laboratorium były wspierane przez Bachmann-Strauss Dystonia &amp; Parkinson Foundation, United Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Parkinson's Disease Association of Alabama, the Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research oraz program Undergraduate Research.

Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego
Wymagane są dwa plazmidy: jeden do tkankowo swoistej ekspresji badanego genu oraz drugi jako selekcyjny marker transformacji.
Plazmid eksperymentalny
<ol>
<li>Wybierz promotor, który jest ekspresowany w interesującej tkance lub typie komórek, na przykład promotor specyficzny dla nerwów lub mięśni. W przypadku chęci ekspresji wielu genów w tej samej tkance można zastosować plazmid z kasetą promotorową w systemie Gateway (Invitrogen). Podejście to umożliwia wstawienie dowolnego interesującego genu za promotorem za pomocą klonowania rekombinacyjnego 4. Zazwyczaj 2-5 kb sekwencji upstream jest wystarczające do zapewnienia prawidłowej i precyzyjnej ekspresji. </li>
<li>cDNA interesującego genu można sklonować na dwa sposoby: <ol>
<li>Klonowanie konwencjonalne z użyciem enzymów restrykcyjnych.</li>
<li>W przypadku klonowania Gateway, cDNA jest amplifikowane metodą PCR przy użyciu starterów zawierających rekombinacyjną sekwencję Gateway att B. Amplifikowane cDNA jest najpierw rekombinowane do wektora donora pDONR201 w celu utworzenia wektora wejściowego, a następnie transformowane do szczepu E. coli DH5a. Po wyselekcjonowaniu udanych rekombinantów i izolacji DNA metodą mini-prep, wektor wejściowy jest rekombinowany do zawierającego promotor wektora docelowego w celu utworzenia plazmidu ekspresyjnego. Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacyjnego są dostępne w instrukcji Invitrogen Gateway lub w pracy Caldwell i wsp. 5.</li>
</ol></li>
</ol>
Plazmid z markerem selekcyjnym
Przykłady plazmidów markerowych dla transgenów obejmują rol-6 lub wykorzystanie promotora mięśni ścian ciała unc-54 do sterowania ekspresją białka fluorescencyjnego. Plazmidy markerowe te są zazwyczaj dostępne w obrębie społeczności badawczej na prośbę.
Mikroiniekcja C. elegans
Przygotowanie
<ol>
<li>Przeprowadź izolację DNA dwóch plazmidów przeznaczonych do wstrzyknięcia. Określ ich stężenie i zmieszaj w stosunku 1:1, tak aby każde z nich miało stężenie 50 ng/µl. </li>
<li>Przygotuj podkładki agarowe: <ol>
<li>Przygotuj 2% roztwór agarozy w wodzie; podgrzewaj lub użyj kuchenki mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia.</li>
<li>Rozłóż na blacie kilka szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 x 50 mm.</li>
<li>Za pomocą pipety Pasteura nanieś kroplę roztopionej agarozy na jedno szkiełko nakrywkowe i natychmiast połóż drugie szkiełko na kropli pod kątem 90° względem pierwszego. Powtórz czynność dla pozostałych szkiełek. Średnica spłaszczonego dysku agarozy powinna wynosić od 15 do 20 mm.</li>
<li>Po zestaleniu się agarozy (trwa to tylko chwilę) zdejmij szkiełko nakrywkowe i pozostaw podkładkę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (od kilku godzin do całej nocy).</li>
<li>Przechowuj podkładki w pudełku na szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej. </li>
</ol></li>
<li>Przygotuj kapilary do ładowania igieł z roztworem DNA: Kapilary do ładowania igieł wykonuje się z kapilar o pojemności 100 µl, które podgrzewa się w połowie nad otwartym płomieniem i szybko rozciąga do około dwukrotności ich długości. Po ochłodzeniu kapilary obie połowy rozdziela się poprzez złamanie. Przygotuj zapas 10–20 kapilar do ładowania igieł na potrzeby iniekcji. Przechowuj je pionowo w statywie do probówek do mikrocentryfugi. Zachowaj ostrożność, aby nie skaleczyć się ostrzami. </li>
<li>Wykonaj igły do mikroiniekcji: Igłę wykonuje się ze specjalnej kapilary zawierającej wewnętrzne włókno szklane, które służy jako knot dla roztworu DNA. Są one rozciągane w maszynie do wyciągania igieł. Używamy wyciągarki Narishige PP-830 z ustawioną temperaturą 24,8. Kilka igieł wyciąga się jednocześnie, a następnie przechowuje w małym plastikowym pudełku. Wiele igieł można łatwo „zamontować” na pasku plasteliny w celu długoterminowego przechowywania. </li>
<li>„Łamacze” końcówek igieł: Końcówka igły do mikroiniekcji jest tak cienka, że jej otwór jest w rzeczywistości zamknięty i należy go otworzyć, używając małych odłamków szkiełka nakrywkowego. Przygotowuje się je, owijając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm ręcznikiem papierowym i delikatnie naciskając, aż pęknie na kilka części. Odłamki o przydatnym rozmiarze mają około 3 x 4 mm. </li>
<li>Wyhoduj nicienie typu dzikiego (N2) do wczesnego stadium dorosłego w celu iniekcji, stosując standardowe procedury 6. Przygotuj około 100 nicieni we właściwym stadium dla każdego wstrzykniętego konstruktu.</li>
</ol>
Procedura
<ol>
<li>Otwórz główny zawór w butli z helem podłączonej do ramienia z igłą do mikroiniekcji i uchwytu. Zamknij zawór regulatora, aby dopuścić gaz do przewodu, doprowadzając ciśnienie do 35 psi. Zwróć uwagę, że gaz można uwalniać za pomocą pedału nożnego. </li>
<li>Włóż załadowywacz igieł do standardowej rurki pipety ustnej (znajdującej się w pojemnikach z szklanymi kapilarami) i pobierz niewielką ilość mieszaniny plazmidów (~1 µl). </li>
<li>Załadowywacz igieł ostrożnie umieść w tylnym końcu igły do iniekcji i delikatnie wsuń go przez całą długość igły, aż poczujesz opór. Wypchnij roztwór DNA, delikatnie dmuchając, a następnie wyjmij załadowywacz. </li>
<li>Wsuń igłę do ramienia mikroiniekcyjnego, uważając, aby umieścić ją wewnątrz małej wewnętrznej gumowej uszczelki. </li>
<li>Umieść odłamek szkła kryjącego służący do łamania igieł na krawędzi podkładki agarowej. Przykryj odłamek oraz całą powierzchnię podkładki agarowej olejem halokarbonowym. Umieść podkładkę agarową na stoliku mikroskopu odwróconego. </li>
<li>Ustaw igłę w centrum pola widzenia, korzystając z obiektywu 4X i oświetlenia w jasnym polu, ale nie opuszczaj jej jeszcze do oleju. Następnie ustaw wewnętrzną krawędź odłamka szkła kryjącego w centrum i ustaw ostrość na niej (nadal używając obiektywu 4X). Opuść igłę do oleju, wprowadzając ją w tę samą płaszczyznę ogniskowania co odłamek szkła kryjącego. Zwiększ powiększenie, przełączając się na obiektyw 40X. Ponownie ustaw ostrość na krawędzi odłamka i w razie potrzeby skoryguj pozycję końcówki igły. </li>
<li>Aby otworzyć końcówkę igły do iniekcji, DELIKATNIE dociśnij igłę do krawędzi odłamka szkła kryjącego, jednocześnie podając krótki impuls gazu za pomocą pedału nożnego. Igła zostanie wystarczająco otwarta, gdy z jej końca zaczną wydostawać się małe kropelki cieczy. Nadmierny przepływ cieczy spowodowany zbyt dużym otworem jest niepożądany, ponieważ może doprowadzić do śmierci zwierząt. </li>
<li>Usuń podkładkę agarową ze stolika, podnosząc igłę, ale nie zmieniaj pozycji osi X lub Y. Wysuń stolik spod igły, zdejmij podkładkę agarową i umieść ją pod mikroskopem dissectingowym. Przenieś nicienia na podkładkę, poniżej powierzchni oleju. Jeśli nicień się wyrywa, DELIKATNIE go dotknij, aż zetknie się z podkładką agarową. Wilgotny nicień powinien przylgnąć do suchego agarozu. </li>
<li>Iniekcja <ol>
<li>Szybko umieść podkładkę agarową z powrotem na stoliku, centrując nicienia w polu widzenia.</li>
<li>Opuść igłę w tę samą płaszczyznę ogniskowania co nicień.</li>
<li>Przełącz filtry na oświetlenie Hoffmana (rodzaj filtra kontrastowego). Pozwala to na uwidocznienie szczegółów morfologicznych nicienia. Jeśli w mikroskopie odwróconym dostępna jest optyka Nomarski/DIC, ona również będzie odpowiednia. Używając obiektywu 40X, ustaw ostrość na „ziarniste” syncytialne centrum gonady nicienia,&nbsp; poniżej wzoru „plastra miodu” jąder zarodkowych (wybierz tę gonadę, która znajduje się po stronie nicienia zwróconej w stronę igły).</li>
<li>Precyzyjnie dostrój pozycję igły, aż jej końcówka również znajdzie się w ostrości (w tej samej płaszczyźnie co „ziarnistość” gonady).</li>
<li>Delikatnie wprowadź igłę do centrum gonady i podaj krótki impuls ciśnienia gazu, aby wprowadzić jedną lub dwie kropelki DNA do ramienia gonady. Powinna być widoczna fala cieczy rozprzestrzeniająca się wzdłuż dystalnej części gonady. Nie należy zakładać, że większa ilość cieczy jest lepsza, ponieważ nadmiar cieczy może wpłynąć do proksymalnego zgięcia ramienia gonady, co może zahamować produkcję oocytów. Jeśli to możliwe, w zależności od pozycji nicienia, w ten sam sposób wykonaj iniekcję do drugiego ramienia gonady.</li>
<li>Ważne jest, aby pracować szybko podczas iniekcji nicienia, ponieważ może on łatwo wyschnąć. Decyzja o iniekcji drugiego ramienia gonady zależy od tego, jak szybko można ponownie ustawić igłę i nicienia. Cały proces powinien idealnie trwać mniej niż 1-2 minuty. </li>
</ol></li>
<li>Zdejmij szkło kryjące ze stolika i umieść je pod mikroskopem dissectingowym. Nanieś 1 µl buforu M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 85mM NaCl, 1mM MgSO4) bezpośrednio na iniektowanego nicienia (może to wymagać zanurzenia końcówki pipety poniżej powierzchni oleju halokarbonowego). Bufor powinien nawodnić nicienia, który następnie odklei się od powierzchni podkładki agarozowej. Przenieś nicienia na zwykłą płytkę za pomocą pęsety do nicieni. Podkładkę agarozową można wykorzystać jeszcze kilka razy, dopóki nie nasyci się zbyt mocno buforem i nicienie przestaną do niej przylegać.</li>
</ol>
Selekcja transgeniczna
<ol>
<li>Wstrzyknięte nicienie, pokolenie P0, przenosi się na oddzielne, świeże płytki (60 mm) z zasianymi bakteriami i pozwala im się rozmnażać. Zazwyczaj zwierzęta po wstrzyknięciu inkubuje się w temperaturze 20°C przez 2-3 dni, aż pojawią się potomstwo. </li>
<li>Potomstwo F1 obserwuje się pod kątem obecności markera transgenicznego (takiego jak fluorescencja) przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu. Każde fluorescencyjne zwierzę F1 będące nośnikiem jest osobno klonowane na nową płytkę (ponieważ potomstwo z każdego osobnika F1 jest uznawane za odrębną linię). Obojnaki F1 pozostawia się do rozmnażania. Ponownie, proces ten zazwyczaj przeprowadza się w 20°C przez 2-3 dni, aż pojawi się potomstwo. </li>
<li>W pokoleniu F2 również poszukuje się zwierząt transgenicznych. Zwierzęta F2, które odziedziczyły i wykazują ekspresję macierzy transgenicznej, uznaje się za linię „stabilną”. UWAGA: Na etapie F1 może pojawić się wiele zwierząt transgenicznych, ale nie są one stabilne. Większość transgenicznych zwierząt F1 nie zostanie przekształcona w stabilne linie F2. UWAGA: Aby kontrolować zmienność liczby kopii genu, należy wygenerować minimum trzy niezależne linie stabilne dla każdego wstrzykniętego konstruktu. </li>
<li>Każda niezależna linia stabilna powinna być utrzymywana jako oddzielna linia nicieni. Każdą linię można powielać, przenosząc kilka zwierząt transgenicznych na nową płytkę w każdym pokoleniu; czynność tę należy wykonywać przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu, jeśli marker selekcyjny jest fluorescencyjny.</li>
</ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby: - wstrzykiwać bezpośrednio do centrum gonady - nie wstrzykiwać zbyt dużej ilości płynu - pracować szybko, aby zapobiec wysuszeniu.
W przypadku problemów z igłą, takich jak zbyt duże uszkodzenie, najlepiej przygotować nową igłę, zamiast próbować wykonywać wtryskiwanie za pomocą igły w stanie nieidealnym.
Tworzenie nicieni transgenicznych ma wiele zastosowań, takich jak: - identyfikacj...

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Olej halogenowany, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapturka 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Kapturka 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Kapturka 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara 100 ul</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara szklana do igieł</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Wyciągarka do igieł</td><td>Narzędzie</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>System mikroiniekcyjny microINJECTOR</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Okular, stolik, manipulator</td></tr><tr><td>Stereomikroskop do sekcji z fluorescencją</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop do sekcji</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie stabilnych transgenicznych *c. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgeniczne osobniki Caenorhabditis elegans można łatwo stworzyć poprzez mikroiniekcję roztworu plazmidu DNA do gonady 1. DNA plazmidowe ulega reorganizacji, tworząc pozachromosomalne konkatamery, które są stabilnie dziedziczone, choć z mniejszą wydajnością niż rzeczywiste chromosomy 2. Gen zainteresowania jest wstrzykiwany wraz z wyraźnym markerem fenotypowym, takim jak rol-6 lub GFP, co umożliwia selekcję zwierząt transgenicznych pod mikroskopem stereoskopowym. Gen egzogenny może być ekspresowany z natywnego promotora w celu badania lokalizacji komórkowej. Alternatywnie transgen może być sterowany przez inny promoter tkankowo specyficzny, aby ocenić rolę produktu genu w konkretnej komórce lub tkance. Technika ta pozwala na wydajną ekspresję genu we wszystkich tkankach C. elegans, z wyjątkiem linii zarodkowej lub wczesnego embrionu 3. Tworzenie zwierząt transgenicznych jest powszechnie wykorzystywane w wielu paradygmatach eksperymentalnych. Niniejszy film prezentuje procedurę mikroiniekcji służącą do generowania transgenicznych nicieni. Ponadto opisano proces selekcji i utrzymywania stabilnych linii transgenicznych C. elegans.

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Transgeniczne osobniki *Caenorhabditis elegans* można łatwo uzyskać poprzez mikroiniekcję roztworu plazmidowego DNA do gonady 1. Plazmidowe DNA ulega reorganizacji w...

C. elegans to niezwykle użyteczny organizm modelowy, zarówno ze względu na naszą wiedzę o jego liniach komórkowych, jak i bogactwo informacji uzyskanych dzięki zsekwencjonowaniu i przeanalizowaniu jego całego genomu. W tym filmie prezentujemy proces mikroiniekcji plazmidów do C. elegans oraz selekcję transgenicznego potomstwa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; jako przezroczyste zwierzę wielokomórkowe, C. elegans jest idealny do wizualizacji transgenów wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie in vivo. Cześć, nazywam się Laura Berkowitz i jestem adiunktem w laboratorium Caldwell w Katedrze Nauk Biologicznych tutaj, na Uniwersytecie Alabamy.Jestem Adam Knight, również z laboratorium Calwella na Uniwersytecie Alabama. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować się do mikroiniekcji plazmidów i jak ją przeprowadzić w celu wytworzenia transgenicznych *C. elegans*, a także wyjaśnię, jak selekcjonować i utrzymywać linie transgeniczne *C. elegans*. Zatem zacznijmy.Zanim przystąpimy do mikrolinkcji, należy wykonać kilka kroków przygotowawczych, które teraz zaprezentuję. Najpierw przygotuj plazmidowe DNA do wstrzyknięcia; wymagane są dwa plazmidy: jeden kodujący tkankowo specyficzną ekspresję genu, który nas interesuje, oraz drugi zapewniający selekcyjny marker transformacji. Wymieszaj plazmidy w stosunku jeden do jednego, stosując stężenie 50 nanogramów per mikrolitr.Następnie należy przygotować podkładki do wiercenia, które posłużą do unieruchomienia nicieni podczas iniekcji. Aby przygotować podkładki, najpierw należy rozłożyć na blacie kilka szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 na 50 mm. Za pomocą pipety Pasteura nanieście kroplę roztopionego 2% agros na jedno szkiełko nakrywkowe, a następnie bezzwłocznie nałóżcie drugie szkiełko na kroplę pod kątem 90 stopni względem pierwszego.Pozostaw aerogel do zestalenia przez kilka sekund, a następnie usuń górną szkiełko przykrywowe. Średnica spłaszczonego dysku aerogelu powinna wynosić od 15 do 20 milimetrów. Pozostaw wkładik do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez kilka godzin lub przez noc.Po wyschnięciu przechowywać podłoża w pudełku na szkiełka nakrywki w temperaturze pokojowej. Następnie przygotować kapilary do roztworu DNA. W tym celu należy wziąć kapilarę o pojemności 100 µL, rozgrzać ją w środku w płomieniu palnika i szybko rozciągnąć do około dwukrotności jej długości.Po ostygnięciu rurki kapilarnej przełam ją na dwie połówki. Przygotuj zapas od 10 do 20 załadowanych igieł do iniekcji. Można je przechowywać pionowo w probówce do mikrowirówki.Brack, uważaj. Końcówki ładowarki igieł są bardzo ostre. Teraz przygotuj igły do mikroiniekcji.Igły te są wykonane ze specjalnej rurki kapilarnej zawierającej wewnętrzny szklany włókno. Włókno to pełni funkcję knota dla roztworu DNA. Do wytwarzania igieł używamy urządzenia Niki PP eight 30 Polar z ustawieniem temperatury na 24,8; w celu późniejszego przechowywania wyciąga się po kilka igieł jednocześnie.Wiele igieł można zamontować na pasku plasteliny modelarskiej. Do rozbicia końcówki wyciągniętej igły zostaną użyte małe odłamki szkiełka nakrywkowego. Odłamki te przygotowuje się, owijając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów chusteczką Kimwipe i delikatnie wywierając nacisk, aż do momentu rozbicia go na kilka części.Należy użyć odłamków o rozmiarze około trzech na cztery milimetry. Oprócz przygotowania DNA i igieł, należy przygotować od 50 do 100 odpowiednio rozwiniętych osobników. Dla każdego konstruktu wektora ekspresyjnego przeznaczonego do wstrzyknięcia należy przygotować dwa nicienie typu dzikiego.Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania mikromanipulatora do mikroiniekcji. Aby rozpocząć konfigurację mikroskopu, otwórz główny zawór w zbiorniku z helem, który jest podłączony do ramienia i uchwytu igły do mikroiniekcji. Zamknij regulator, aby umożliwić dopływ gazu do przewodu.Po ustawieniu ciśnienia na 35 PSI gaz można uwolnić za pomocą pedału nożnego. Następnie należy wprowadzić ładowarkę igłową do standardowej rurki pipety grawitacyjnej i nanieść niewielką ilość mieszaniny plazmidów, około 1 µL. Teraz należy delikatnie wsunąć ładowarkę przez całą igłę do mikroiniekcji, aż do momentu wyczucia oporu.Wypchnij roztwór DNA, delikatnie wydmuchując go, a następnie wyjmij ładowarkę. Po załadowaniu DNA wprowadź igłę do ramienia mikroiniekcyjnego, uważając, aby umieścić ją wewnątrz małej wewnętrznej uszczelki gumowej, a następnie przymocuj ją do ramienia manipulatora. Następnie umieść odłamek szkła kryształowego służący do łamania igieł na krawędzi podkładki pod świdrem.Pokryć odłamek oraz całą powierzchnię podkładki pod świdrem olejkiem węglowym. Następnie umieścić podkładkę na stoliku mikroskopu odwróconego. Po umieszczeniu podkładki, ustawić igłę w centrum pola widzenia, korzystając z obiektywu Forex i oświetlenia w polu jasnym, jednak nie zanurzać jej jeszcze w oleju.Następnie ustaw wewnętrzną krawędź odłamka szkiełka nakrywek w centrum i ustaw ostrość. Obniż igłę do oleju, doprowadzając ją do tej samej płaszczyzny ogniskowania co odłamek szkiełka nakrywek. Zwiększ powiększenie, przełączając na obiektyw 40 x, a następnie ponownie ustaw ostrość na krawędzi odłamka i w razie potrzeby skoryguj pozycję końcówki igły.Teraz należy przełamać końcówkę igły wstrzykującej. Delikatnie dociśnij igłę do krawędzi odłamka szkiełka nakrywkowego, jednocześnie podając krótki impuls gazu za pomocą pedału. Igła zostanie w ten sposób odpowiednio przełamana.Niepożądany jest nadmierny przepływ cieczy, prowadzący do wypływania małych kropel z końcówki igły z powodu zbyt dużego otworu, ponieważ może to doprowadzić do śmierci zwierząt. Po przygotowaniu igły rozpoczynamy mikrowstrzykiwanie. Następnie należy usunąć podkładkę pod świder ze stolika, unosząc igłę do góry.Nie należy jednak zmieniać położenia osi X lub Y. Wysuń stolik spod igły. Zdejmij podkładkę z świdrem i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.Przenieś dżdżownicę na podkładkę pod powierzchnię oleju. Jeśli dżdżownica się wierci, delikatnie przesuwaj ją, aż zetknie się z podkładką świdrową; wilgotna dżdżownica powinna przywrzeć do suchego podłoża. Szybko umieść podkładkę świdrową z powrotem na stoliku, centrując dżdżownicę w polu widzenia.Następnie opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowania co niczeń. Przełącz filtry w mikroskopie odwróconym na oświetlenie Hoffmana. Ten filtr kontrastowy pozwala na uwidocznienie szczegółów morfologicznych nicienia.Używając obiektywu 40x, ustaw ostrość na ziarniste centrum sensoryczne gonady robaka, znajdujące się poniżej plastra miodu jąder zarodkowych. Wybierz gonadę położoną po stronie robaka zwróconej w stronę igły. Precyzyjnie dostrój pozycję igły, aż jej końcówka również będzie w polu ostrości.Ostrożnie wprowadź igłę do centrum gonady i przyłóż krótki impuls ciśnienia gazu, aby wprowadzić jedną lub dwie krople DNA do ramienia gonady. Przy odpowiedniej wprawie i umiejętności powinna być widoczna fala cieczy rozprzestrzeniająca się w obrębie dystalnej części gonady. Można w ten sposób za każdym razem precyzyjnie trafić w środek gonady.Należy pamiętać, że podczas wstrzykiwania dżdżownicy ważne jest szybkie tempo pracy, ponieważ zwierzę może łatwo ulec wysuszeniu. Cały proces powinien idealnie zająć mniej niż jedną do dwóch minut.Po zakończeniu wtryskiwania należy zdjąć podkładkę z wiertłem ze stołu i umieścić ją pod mikroskopem sekcyjnym. Nanieś 1 µL buforu M9 bezpośrednio na wstrzykniętego nicienia. Może to wymagać zanurzenia końcówki pipety poniżej powierzchni oleju halocarbon.Bufor powinien nawodnić nicienia, który następnie oddzieli się od powierzchni podkładki aeros, po czym należy przenieść nicienia na zwykłą płytkę za pomocą zgłębnika do nicieni. Teraz przekażę wstrzyknięte nicienie Adamowi, który zaprezentuje nam proces selekcji i utrzymania linii transgenicznych. Wstrzyknięte nicienie przenosi się na poszczególne, świeżo zasiałe płytki o średnicy 60 mm i pozostawia do rozmnożenia.Robaki te reprezentują generację P zero. Zazwyczaj zainfekowane zwierzęta inkubuje się w temperaturze 20 °C przez dwa do trzech dni, aż do pojawienia się potomstwa. Po pojawieniu się potomstwa można rozpocząć przesiewy w celu wyselekcjonowania robaków transgenicznych.Potomstwo F1 jest obserwowane pod kątem obecności markera transgenicznego. W tym przypadku marker selekcyjny jest fluorescencyjny, co pozwala na przesiewanie za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Każde fluorescencyjne zwierzę F1 będące nosicielem jest osobno klonowane na nowej płytce.Wstrzyknięte P0 może wyprodukować od jednego do pięciu fluorescencyjnych potomków spośród wszystkich osobników F1. Pozostawia się hermafrodytów F1 do rozmnażania w temperaturze 20 °C przez dwa do trzech dni, aż pojawi się potomstwo. Gdy generacja F2 będzie gotowa, poddaje się ją również obserwacji pod kątem obecności zwierząt transgenicznych. Zwierzęta F2, które odziedziczyły i wyraziły marker transgeniczny, są uznawane za linię stabilną.Każdą niezależną linię stabilną należy prowadzić jako oddzielną linię nicieni, propagując każdą z nich poprzez przenoszenie kilku zwierząt transgenicznych na nową płytkę w każdym pokoleniu. Operację tę należy przeprowadzić przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu. Jeśli marker selekcyjny jest fluorescencyjny, w celu skontrolowania zmienności liczby kopii genu należy wygenerować minimum trzy niezależne linie stabilne dla każdego wstrzykniętego konstruktu.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak mikroiniekować konstrukcje wektorów ekspresyjnych, obserwować ich ekspresję oraz selekcjonować stabilne linie komórkowe. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie stabilnych transgenicznych C. elegans za pomocą mikroiniekcji

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

W organizmach modelowych transgeneza pozwala na manipulowanie funkcjami genów, podczas gdy RNAi umożliwia wyciszenie specyficznych transkryptów mRNA 1-2. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie technik niezbędnych do wprowadzenia stabilnie dziedziczonego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus na potrzeby badań w dziedzinie biologii ewolucyjnej, rozwojowej i behawioralnej.

Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Naucz się mikroiniekcji plazmidów do gonady C. elegans w celu tworzenia transgenicznych linii zwierząt. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji genów przy użyciu fluorescencji in vivo.

Generowanie stabilnych transgenicznych C. elegans metodą mikrowstrzykiwania

Przeglądaj więcej filmów