Metoda MODS w diagnostyce gruźlicy i gruźlicy wielolekoopornej

Na każde trzy osoby na świecie jedna jest zarażona gruźlicą. Rozpoznanie czynnej gruźlicy zapobiega nowym zakażeniom, ponieważ pacjenci z aktywną gruźlicą zarażają od 10 do 15 innych osób rocznie, aż do czasu, gdy zostaną wyleczeni lub umrą. Mods to akronim, którego używamy, aby uniknąć konieczności mówienia o obserwacji mikroskopowej, teście wrażliwości na lek i powodzie, dla którego to się nazywa, stanie się oczywiste po wyjaśnieniu metodologii.

W krótkim filmie przedstawimy metodologię mods do szybkiej, niedrogiej diagnostyki gruźlicy i gruźlicy wielolekoopornej. Film krok po kroku przedstawi metodologię. Omówimy implikacje dla bezpieczeństwa biologicznego wynikające z pracy z kulturami płynnymi, a także wyjaśnimy niektóre z ważnych kwestii związanych z zapewnieniem jakości, które są wymagane do stosowania tej metodologii.

Test modów został opracowany na Uniwersytecie Kayana w Limie w Peru w laboratorium Boba Gilmana. Na podstawie obserwacji początkowo poczynionych przez luźne cavi. W ramach projektu LOOSE starano się zidentyfikować szybkie sposoby wykrywania prątków gruźlicy w kulturach za pomocą wskaźników kolormetrycznych.

Zauważyła jednak, że obserwacja tych kultur pod mikroskopem ujawniła obecność wzrostu mikrobakterii na kilka dni przed zmianą koloru wskaźników kolormetrycznych i to właśnie na podstawie tej obserwacji opracowano test MOD. Test MOD został opracowany w warunkach ograniczonych zasobów i jest ukierunkowany na ustawienia o ograniczonych zasobach, dlatego nieco poniżej 3 punktów na test do wykrywania gruźlicy i oporności wielolekowej na podstawie płynnych kultur. Jest to niezwykle atrakcyjne i po raz pierwszy przynosi tego rodzaju możliwości diagnostyczne w miejscach, w których zasoby są ograniczone.

Tak więc test modów opiera się na trzech głównych zasadach. Po pierwsze, prątki gruźlicy rozwijają się w pożywkach płynnych znacznie szybciej niż w pożywkach stałych. Jest to fakt znany od wielu lat.

Po drugie, jeśli zaobserwujemy te płynne podłoża pod mikroskopem, możemy wykryć wzrost gruźlicy myb znacznie szybciej niż czekając na makroskopowe pojawienie się kolonii na pożywkach stałych. I rzeczywiście, wzrost ten jest całkowicie charakterystyczny, tak że możemy odróżnić gruźlicę M w pożywkach płynnych od skażenia bakteryjnego lub grzybiczego, a nawet od wzrostu atypowych prątków niegruźliczych, które mogą być obecne. Wreszcie, i to jest być może najbardziej ekscytującą rzeczą w teście modów, jest to, że możemy włączyć leki to ryfampicyna, a zatem oporność wielolekowa bezpośrednio z plwociny.

Stosując te leki na początku testu, możemy wykryć zarówno gruźlicę, jak i jednocześnie, czy izolat jest oporny na te dwa leki. A to eliminuje potrzebę subkultury i tworzenia pośredniego testu na lekowrażliwość. Więc teraz zamierzamy tylko nakreślić sprzęt, który jest wymagany do przeprowadzenia testu modyfikacji.

Do przechowywania przygotowanych mediów potrzebna jest lodówka. Do zważenia ryfampicyny wymagana jest waga. Do mieszania plwociny potrzebny jest wir.

W przypadku roztworu do odkażania do zagęszczenia odkażonej próbki plwociny wymagana jest wirówka, która powinna być w stanie osiągnąć 3000 G. Wirówka nie musi być przechowywana w lodówce, ale absolutnie konieczne jest, aby była bezpieczna dla biosu i bios-u. Do pracy z prątkami, która wymaga, aby wiadra wirówki mogły być uszczelnione zamykanymi pokrywami. Wymagany jest inkubator, który może osiągnąć 37 stopni Celsjusza i utrzymać 37 stopni Celsjusza.

Nie musi to być wzbogacane CO2. Do odczytu płytek mods wymagany jest mikroskop odwrócony, który powinien mieć obiektywy cztery x i 10 x, a autoklaw jest potrzebny do sterylizacji pożywki, a także do usuwania kultur mikrobakteryjnych, mikro odpadowe są wymagane do podwielokrotności w pożywce, komorze bezpieczeństwa biologicznego. Klasa druga jest wymagana dla procedur obejmujących manipulację próbkami plwociny i inokulację płytek.

Odczynniki wymagane do wykonania testu mods są następujące: Middlebrook seven H nine media cascione i glicerol Panta, który jest suplementem antybiotykowym i OADC. Zapasy suplementów diety antybiotyków to dimetylosulfotlenek ryfampicyny, DMSO do przygotowania ryfampicyny, wodorotlenek sodu, cytrynian sodu i cysteina nylowa do odkażania plwociny, fosforan sodu i fosforan monopotasowy do przygotowania buforu fosforanowego, 10% podchloryn sodu do usuwania zakażonych odpadów i środek dezynfekujący do czyszczenia powierzchni roboczych. Wymagane są również następujące tworzywa sztuczne i materiały eksploatacyjne: sterylne szklane probówki, filtry 0,2 mikrometra do rozpuszczalników wodnych i filtry 0,2 mikrometra do rozpuszczalników organicznych, mikroprobówki wirówkowe, probówki wirówkowe 15 mil, sterylne 50 mililitrów, 10 mililitrów serologiczne peppes past peppes sterylne końcówki do mikropipet, 24-dołkowe płytki typu kultura tkankowa i zamykane worki typu Ziploc, w których 24-dołkowe płytki umieszcza się po zaszczepieniu próbki plwociny w pożywce.

Istnieją cztery grupy roztworów podstawowych, które można przygotować z wyprzedzeniem. Roztwór buforu fosforanowego składa się z mieszaniny monozasadowych roztworów fosforanu sodu, diba i fosforanu potasu dostosowanych do pH 6,8 plus minus 0,2. Roztwór ten jest sterylizowany w autoklawie w temperaturze od 121 do 124 stopni Celsjusza przez 15 minut w celu sterylizacji, a podwielokrotność jest hodowana na agarze odżywczym w celu potwierdzenia sterylności.

Można go przechowywać w lodówce w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Każda próbka plwociny wymaga 10 mililitrów roztworu buforu fosforanowego. Roztworem podstawowym do odkażania plwociny jest mieszanina wodorotlenku sodu cytrynianu sodu.

Roztwory te łączy się w równych objętościach i sterylizuje w autoklawie w temperaturze od 121 do 124 stopni Celsjusza przez 15 minut, a także może być przechowywane w lodówce w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Na każdą próbkę plwociny wymagane są dwa mililitry tego roztworu. Podstawowa pożywka hodowlana składa się z Middlebrook seven H nine z kastionem i glicerolem.

Proszek Seven H Nine rozpuszcza się w sterylnej wodzie destylowanej zawierającej glicerol i kascyn i miesza przy ciągłym mieszaniu aż do całkowitego rozpuszczenia. Pożywkę tę umieszcza się w autoklawie w temperaturze od 121 do 124 stopni Celsjusza przez 15 minut, a po schłodzeniu dzieli się na 4,5 mililitrowe kwaty w sterylnych szklanych rurkach o wymiarach 16 na 100 milimetrów. Pożywkę inkubuje się w temperaturze 37 stopni przez 48 godzin w celu sprawdzenia sterylności, na którą wskazuje brak zmętnienia po tym czasie i może być przechowywana w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza ze szczelnie zamkniętą nakrętką przez okres do jednego miesiąca.

Każda próbka plwociny wymaga jednej probówki zawierającej 4,5 mililitra tej kultury. Roztwory podstawowe pożywki z antybiotykami przygotowuje się w następujący sposób, rozpuszcza się całkowicie w sterylnej wodzie destylowanej i filtruje za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 mikrometra do rozpuszczalników wodnych. 20 mikrolitrów porcji można następnie przechowywać w sterylnych mikroprobówkach wirówkowych w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do sześciu miesięcy, każda 20 mikrolitrowa porcja wystarcza na maksymalnie sto próbek.

Roztwory podstawowe ryfampicyny o stężeniu ośmiu miligramów na promil przygotowuje się przez rozpuszczenie ryfampicyny w DMSO i sterylnej wodzie destylowanej. Mieszanina ta jest filtrowana za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,2 mikrometra do rozpuszczalników organicznych, a roztwór można przechowywać w podwielokrotnościach o pojemności 20 mikrolitrów w sterylnych probówkach wirówek mikro w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do sześciu miesięcy, każda podwielokrotność 20 mikrolitrów jest wystarczająca na maksymalnie 100 próbek. Przejdźmy więc teraz do części samej metodologii i trzech kroków, które należy wykonać w dniu zabiegu.

Jest to przekształcanie roztworów podstawowych w roztwory robocze. Najpierw mamy roztwór do dekontaminacji, a następnie mamy roztwór do pożywki. I wreszcie roztwory robocze leków isen i ryfampicyna.

Metoda dekontaminacji, która jest stosowana w metodologii mods, to znormalizowana metodologia odkażania wodorotlenku sodu i nalanku. Nalot jest środkiem mukolitycznym i pomaga trawić plwocinę i umożliwia wodorotlenkowi sodu przeprowadzenie dekontaminacji. W tym celu potrzebujemy naszego roztworu podstawowego wodorotlenku sodu z cytrynianem sodu i 0,1 grama NA dodaje się do 20 ml tego roztworu.

Każdy roztwór, który nie został wykorzystany w dniu przygotowania, należy wyrzucić. Końcowe przygotowanie pożywki hodowlanej również powinno odbywać się dopiero w dniu użycia. Przechowywane siedem pożywek H dziewięć łączy się z OADC i panta 4,5 mililitra pożywki łączy się z 0,5 mililitra OADC i 0,1 mililitra Panta w każdej probówce.

Jest to wystarczające dla jednej próbki. Roztwory robocze każdego leku przygotowuje się w dniu użycia, a wszelkie roztwory, które nie zostały użyte, należy wyrzucić, ponieważ nie można zagwarantować aktywności, przechowywane podwielokrotności rozcieńcza się w 24. Dobrze miseczki do hodowli tkankowej płytkuje się szeregowo z pożywką siedem H dziewięć oh A DC tak, że końcowe stężenie studzienki, które osiąga się po dodaniu próbki plwociny z pożywką, wynosi 0,4 mikrograma na promil kwasu forowego i jeden mikrogram na promil dla ryfampicyny.

Przejdźmy teraz do procedury odkażania, dwa mililitry próbki plwociny umieszcza się w stożkowej probówce Falcon, a następnie dodaje się dwa milile naszego roztworu odkażającego z wodorotlenku sodu. Pokrywę zakłada się i mocno przykręca, po czym zawiesinę zawirowuje się i pozostawia na 15 minut, w tym czasie odbywa się procedura odkażania. Po tym czasie dodaje się 14 mililitrów roztworu buforu fosforanowego.

Pokrywę zakłada się i mocno przykręca, a probówkę umieszcza się w wirówce po 50 minutach w temperaturze 3000 G, supernatant S jest dekantowany, a pozostałą osadką jest próbka, którą chcemy pokryć za pomocą 5,1 mililitrowych probówek z siedmioma spiżarkami H dziewięć OEDC. Nasz pellet jest ponownie zawieszany do objętości około dwóch mililitrów. Połowa tej zawieszonej próbki jest przechowywana jako kopia zapasowa w mikroprobówce wirówkowej.

Jest to następnie dostępne na wypadek, gdyby nasza kultura została skażona i musieliśmy ponownie pobrać próbkę. Drugi mililitr dodaje się do pozostałych siedmiu H dziewięć och, a DC panter, który znajduje się w naszej szklanej rurce, i jest to nasza próbka, która jest gotowa do poszycia. 900 mikrolitrów tej zawiesiny pożywki i próbki umieszcza się w każdym z czterech dołków w kolumnie z 24-dołkową płytką.

Pozostałe studzienki na płytce 24-dołkowej wypełnia się kolejnymi próbkami w taki sposób, że pięć próbek wypełnia płytkę 24-dołkową, po jednej na każdą z pięciu kolumn, a szóstą kolumnę pozostawia się bez próbki. Szósta kolumna służy jako kontrola negatywna w tej kolumnie. Umieszczono w nim wszystkie składniki pożywki bez próbki plwociny i wyraźnie każdy wzrost w tej kolumnie wskazuje, że mamy problem z zanieczyszczeniem krzyżowym i cała płytka musi zostać wyrzucona.

Każda tablica, którą uruchamiamy, wymaga kolumny kontroli negatywnej. Więc teraz mamy naszą tabliczkę zawierającą całą naszą próbkę i pożywkę. Musimy dodać nasze zawiesiny antybiotykowe na osobnym talerzu.

Przygotowaliśmy nasze rozcieńczenia, jak opisano wcześniej dla Rifampin i Isid, a za pomocą czterokanałowego multi pet zbieramy 100 mikrolitrów z każdej z tych studzienek i dozujemy 100 mikrolitrów siedmiu H dziewięć OADC do każdej z dwóch studzienek kontrolnych oraz 100 mikrolitrów ryfampicyny i 100 mikrolitrów isidu do każdej z dwóch studzienek zawierających lek. Gdy talerz jest gotowy, pokrywka jest zakładana i umieszczana w środku. Torba Ziploc od tego momentu na torbie nie jest ponownie otwierana, a zatem wszelkie kultury, które rosną w płynnych podłożach, nigdy nie mają możliwości opuszczenia torby.

Od teraz wszystkie odczyty płytki są wykonywane w worku, a worek jest umieszczany w worku autoklawu i wyrzucany po zakończeniu hodowli. W ten sposób unikamy manipulacji silnie skoncentrowanymi zawiesinami prątków. Powiemy teraz kilka słów o kontroli jakości.

W metodologii modów wbudowane są kontrole jakości, które są niezbędne do prawidłowego stosowania testu. Przede wszystkim istnieją kontrole ujemne, które są przeprowadzane na każdej pojedynczej płytce. Zostały one wspomniane wcześniej, ale podsumowując, mamy kolumnę, która zawiera wszystkie składniki pożywki bez obecności próbki plwociny wraz z pięcioma innymi próbkami plwociny na płytce, studzienki w kolumnie powinny być badane tak samo jak każde inne studnie, a obecność jakiegokolwiek wzrostu w tych studzienkach wskazuje, że miało miejsce zanieczyszczenie krzyżowe i że w związku z tym nie można ufać żadnemu z wyników na płytce.

W związku z tym płytkę należy wyrzucić, a wszystkie próbki należy ponownie platerować. Ponadto istnieją kontrole wewnętrzne, które są kontrolami pozytywnymi. Są one umieszczane na osobnej płytce, a ta płytka jest przygotowywana po przygotowaniu wszystkich innych płytek z próbkami pod koniec dnia, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego w laboratorium.

Na tej osobnej płytce przeprowadzamy jeden w pełni podatny szczep Mycobacterium tuberculosis oraz szczep odporny na isid i ryfampicynę. Jeśli istnieją obawy dotyczące prowadzenia szczepu wielolekoopornego na płytce, szczep monooporny na ryfampicynę może być uruchamiany bez szczepu monoopornego zamiast tych dwóch szczepów podatnych i MDR. Celem tych szczepów jest pokazanie nie tylko, że media wspierają wzrost, dlatego wszystkie nasze kontrole pozytywne powinny mieć wzrost bogactwa wolnego od narkotyków, ale także, że nasze stężenia leków są prawidłowe, a zatem podatne kontrole pozytywne nie powinny rosnąć w obecności jest i ryfampicyny, a oporne kontrole pozytywne powinny oczywiście rosnąć dzięki stężeniom ryfampicyny i jest, które są obecne na płytce.

Dobra, a teraz przejdźmy do czytania talerza. Jeśli weźmiemy pod uwagę dzień posiewu z naszych próbników, odczyt płytki w dniu zerowym rozpoczyna się w piątym dniu. Wcześniej wzrost prątków jest bardzo rzadko obserwowany.

Płytki są badane pod mikroskopem ze światłem odwróconym. Oznacza to, że płytki są badane od dołu do góry, co pozwala nam bardzo wyraźnie zobaczyć sznurki, próba wizualizacji kultur z góry jest utrudniona przez kondensację na wieczku płytek, a także dlatego, że ogniskowa nie jest odpowiednia dla standardowego mikroskopu. Badanie mikroskopowe jest zwykle przeprowadzane z 10 obiektywnymi kulturami dodatnimi uważanymi za jedną, w której znajdują się co najmniej dwie jednostki tworzące kolonie w obu studzienkach wolnych od leków.

Obecność zanieczyszczenia jest łatwo rozpoznawalna, ponieważ podłoże staje się mętne, a do piątego dnia następuje generalny przerost większości studni. W przeciwieństwie do tego, wzrost prątków nie prowadzi do zmętnienia studni początkowy wzrost prątków tworzy małe formy przypominające przecinki, które stopniowo rozwijają się, tworząc charakterystyczne akordy lub splątki. W ciągu dwóch tygodni silnie dodatni wzrost utworzy konglomeraty prątków z rdzeniami widocznymi tylko na końcach.

Zdecydowana większość kultur, które mają stać się dodatnie, jest dodatnia do 14 dnia, dlatego zalecamy codzienne odczyty od piątego do 14 dnia, a następnie odczyty co dwa lub trzy dni, zgodnie z obciążeniem laboratoryjnym w dniu, w którym posiew jest wyraźnie dodatni w dwóch dołkach wolnych od leków, należy odczytać studzienki zawierające lek. Każdy wzrost w obecności któregokolwiek z leków wskazuje na oporność na ten lek. Bardzo ważne jest, aby pamiętać, że jeśli region studzienek zawierających lek zostanie wykonany później niż tydzień po odnotowaniu pozytywnej kultury w studniach wolnych od leków, może to nie reprezentować oporności, ponieważ od czasu do czasu obserwuje się przełomowy wzrost.

Odczyty mogą zatrzymać się w 21 dniu, jeśli posiew jest ujemny, ponieważ dodatnie posiewy po tym czasie nigdy nie występują u pacjentów nieotrzymujących terapii Po zakończeniu 21 dni inkubacji kultury można odrzucić. Kultury pozostają w torebkach Ziploc i są umieszczane w workach autoklawowych i autoklawie w temperaturze od 121 do 124 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut, po czym można je bezpiecznie wyrzucić. Powiem teraz kilka słów o bezpieczeństwie biologicznym i testach modyfikacji, ponieważ wprowadzamy modyfikacje nie tylko w Peru, ale także w Afryce i Azji.

Pojawia się powtarzające się pytanie o bezpieczeństwo i bezpieczeństwo biologiczne stosowania kultur mikrobakteryjnych w pożywkach płynnych. Jest to zrozumiała obawa, ponieważ oczywiście płyny mogą się rozlać, a media stałe nie niosą ze sobą tego ryzyka, a także istnieje ryzyko aerozolu, gdy mamy do czynienia z zawiesinami prątków. To właśnie z tych powodów uważamy, że metodologia mod jest bezpieczniejsza niż jakakolwiek metodologia, która wymaga pośrednich testów wrażliwości na leki.

Powodem tego jest to, że do pośredniego badania wrażliwości przygotowuje się zawiesinę znanego stężenia mikrobakterii. Wiąże się to zatem z manipulacją wysoce skoncentrowanymi roztworami mikrobakterii ze wszystkimi towarzyszącymi zagrożeniami rozlania i aerozolu. W przeciwieństwie do tego, metodologia modów, jak już zobaczysz, polega po prostu na zaszczepieniu próbki plwociny na naszej płytce, po czym płytka jest zamykana w plastikowej torbie.

Tego worka nigdy więcej nie otwieramy, dlatego nie mamy do czynienia z tymi mocno skoncentrowanymi zawiesinami. Nie oznacza to, że uważamy, że metodologia mod jest całkowicie bezpieczna, obchodzenie się z prątkami zawsze wiąże się z ryzykiem. Jednak dane z Korei opublikowane w 2006 roku zdawały się potwierdzać nasze stanowisko, że modyfikacje nie są bardziej niebezpieczne niż niszczenie jakiejkolwiek innej kultury.

Było to badanie, które zostało przeprowadzone na pracownikach laboratoryjnych, które wykazało, że ryzyko zawodowe dla pracowników laboratoryjnych, którzy podawali posiewy i nie byli odpowiedzialni za testy wrażliwości na leki, nie było większe niż w przypadku tych, którzy wykonują mikroskopię rozmazu plwociny. Natomiast ci, którzy zajmują się zawiesinami prątków i wykonują testy wrażliwości na leki, mają znacznie wyższe wskaźniki ryzyka zawodowego gruźlicy. Oczywiście niezwykle ważne jest, aby wszyscy pracownicy laboratoriów pracy byli chronieni w jak największym stopniu, dlatego zdecydowanie zalecamy, aby żadna z tych procedur nie była wykonywana bez odpowiedniej osobistej ochrony dróg oddechowych, przez którą rozumiemy standardowe maski N95.

Ponadto wymagana jest szafa lub okap klasy bezpieczeństwa biologicznego, w której wszystkie wywiewane obszary są filtrowane przez filtry HEPA. Wreszcie, prostym mechanizmem, który jest bardzo ważny w unikaniu turbulencji przepływu powietrza w laboratorium, jest zamek w drzwiach laboratorium, który zatrzymuje wejście i wyjście personelu podczas przetwarzania próbek. Zmniejsza to ryzyko transmisji w laboratorium, więc mam nadzieję, że jest to dobry przegląd tego, co obejmuje metodologia modów i jak przydatna może być w warunkach, w których zasoby są ograniczone, ale pilnie wymagana jest wysokiej jakości diagnostyka TB i MDR TB.

Aby uzyskać więcej informacji, możesz odwiedzić naszą stronę internetową, mods peru. org, gdzie znajdziesz nasze szczegółowe standardowe procedury operacyjne, przewodnik użytkownika po modach. Oprócz standardowych procedur operacyjnych (SOP) dotyczących przetwarzania dodatkowych próbek płuc posiadamy również bibliotekę zdjęć prątków i gruźlicy, innych prątków oraz skażenia bakteryjnego i grzybiczego, a także naszą strategię zapewnienia jakości i zalecaną przez nas procedurę akredytacji laboratoriów w celu rozpoczęcia stosowania modów.

Na końcu znajduje się arkusz z często zadawanymi pytaniami i czekamy na wszelkie opinie od użytkowników, którzy obecnie korzystają z modów, ponieważ jest to metodologia iteracyjna. Jak wyjaśniliśmy wcześniej, jest to test niezastrzeżony i zawsze interesują nas ulepszenia, które udało się wprowadzić innym laboratoriom.